豬糞快速降解微生物的篩選

徐登峰 張邑帆 楊柳 朱買勛

(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

生豬養(yǎng)殖是我國畜禽養(yǎng)殖的重要組成部分，由于省區(qū)養(yǎng)殖區(qū)域分布廣泛，豬糞的產(chǎn)量較大，傳統(tǒng)的處理方式主要是通過豬糞堆肥進(jìn)行發(fā)酵，處理的時(shí)間較長，資源化利用低，豬糞的生產(chǎn)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于處理的速度。同時(shí)豬糞中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，如果不能夠被及時(shí)利用和快速降解，就會(huì)污染環(huán)境、產(chǎn)生臭氣，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，也嚴(yán)重限制了養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[1-3]。豬糞的處理有多種方式，其中生物降解因操作簡單、無二次污染、所需設(shè)備要求低而倍受關(guān)注。由于生物降解的主體是微生物，如何篩選到高效降解糞便的微生物成為本研究的關(guān)鍵[4]。盡管，在自然環(huán)境中的微生物，絕大多數(shù)是非培養(yǎng)的，可培養(yǎng)的只有少部分。但可培養(yǎng)微生物對(duì)促進(jìn)糞便的快速腐熟和穩(wěn)定、促進(jìn)環(huán)境改善起到十分重要的作用。培養(yǎng)基對(duì)微生物的篩選、分離起到十分關(guān)鍵的作用，合適的培養(yǎng)基可以加快微生物的篩選進(jìn)程。本研究根據(jù)豬糞中營養(yǎng)物質(zhì)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了細(xì)菌耐高溫和降解能力試驗(yàn)，進(jìn)行微生物的篩選分離。分離純化得到豬糞快速降解微生物，為后續(xù)的研究工作奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 糞污來源

糞污采集于重慶市畜牧科學(xué)院種豬場(chǎng)，采集糞污處于堆肥10d、15d、20d，分別采集糞堆4個(gè)角落的高、中、低3個(gè)層面的樣品，每個(gè)糞堆采集的糞樣充分混勻?yàn)?個(gè)樣品，共采集樣品16個(gè)。

1.1.2 主要試劑

水解蛋白質(zhì)培養(yǎng)基(明膠培養(yǎng)基)，水解脂肪培養(yǎng)基，水解淀粉培養(yǎng)基，纖維素剛果紅培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，均購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；福爾馬林，剛果紅染料，盧哥氏碘液等試劑均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

SWCJ1D2D超凈工作臺(tái)購于蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌鍋購于上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HN-25S恒溫培養(yǎng)箱購于青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；CX31正置顯微鏡購于奧林巴斯工業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微生物的分離

準(zhǔn)確稱取樣品10g，放入裝有90mL的滅菌生理鹽水，并放有玻璃珠的250mL玻璃杯中，浸泡10min后，置于震蕩器上振動(dòng)20min。使微生物分散，靜止20～30s，即得到10-1的稀釋度。采用逐步稀釋法：即再用1mL無菌吸管，吸取10-1的稀釋度的溶液2mL移入裝有18mL滅菌生理鹽水的試管中，吹吸3次以上，讓菌液混合均勻，即得到10-2的稀釋度；依次類推，連續(xù)稀釋，制得10-3、10-4、10-5、10-6一系列稀釋度菌液。分別接種在營養(yǎng)瓊脂平板上，從平板上選擇生長較好的，具有代表性的單菌落，劃線接種相應(yīng)的培養(yǎng)基，進(jìn)行再次純化。同時(shí)，微生物制片，用顯微鏡作純度的檢查，如果細(xì)菌大小一致，均勻分布，則表明菌種純度好。若菌種不純，應(yīng)進(jìn)一步劃線分離，直到獲得純培養(yǎng)物。

1.2.2 耐高溫細(xì)菌的篩選

參照文亞雄等[5]的文章，普通細(xì)菌可分為中溫型和高溫型，分別將32株純化好的細(xì)菌接種于培養(yǎng)基上，置于30℃、37℃、40℃、45℃、50℃培養(yǎng)3d，觀察細(xì)菌的生長情況，判定細(xì)菌的耐高溫情況。

1.2.3 淀粉降解試驗(yàn)

參照張鋒等[6]的文章，將能夠耐受高溫的細(xì)菌接種在淀粉降解培養(yǎng)基上，分別標(biāo)記為H1～H12，接種的時(shí)候劃“+”，劃線長短為1cm，置于合適的溫度下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌落豐厚，加入盧哥氏碘液，均勻地覆蓋到培養(yǎng)基上，若菌落周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)圈或者由于碘試劑顏色使培養(yǎng)基輕度發(fā)黃者，說明淀粉已經(jīng)被水解。定量比較篩選細(xì)菌水解能力的大小，按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

Up=(D/d)2

式中，D為透明環(huán)的平均直徑，cm，平均直徑(cm)=(縱向直徑+橫向直徑)/2；d為菌落大小的平均直徑，cm。

1.2.4 明膠液化試驗(yàn)

參照桂文龍等[7]的文章，將待測(cè)細(xì)菌菌株劃“+”線接種在平板上，在19℃的溫度下培養(yǎng)至菌落生長豐厚后取出。觀察前將包含菌種的平皿于4℃的條件下放置20～30min。若明膠為固體形態(tài)即為不液化，記為“-”;若明膠呈液體狀即為液化，并且肉眼可見記為“+”，其強(qiáng)弱可用“+、++、+++、++++”表示。

1.2.5 纖維素降解試驗(yàn)

參照張喜慶等[8]的文章，將純化的細(xì)菌接種于纖維素降解培養(yǎng)基上，待細(xì)菌長滿，加入適量剛果紅使用液，染色1h，棄去染液，加入適量1mol·L-1的NaCl溶液，洗滌30min，測(cè)量透明圈和菌落的大小，根據(jù)菌落周圍出現(xiàn)透明圈的大小，篩選微生物分解纖維素能力的強(qiáng)弱。按以下公式進(jìn)行計(jì)算，方法與淀粉降解菌能力統(tǒng)計(jì)方法相同。

Up=(D/d)2

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

根據(jù)分離得到細(xì)菌進(jìn)行純化后，比較菌落形態(tài)、大小、顏色等指標(biāo)，結(jié)合顯微鏡下觀察結(jié)果，篩選到32株不同菌落形態(tài)的細(xì)菌。分別進(jìn)行了耐高溫培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有30株細(xì)菌可以在30℃的溫度下進(jìn)行生長，而35℃、40℃、45℃、50℃的溫度下細(xì)菌的生長株數(shù)分別是31株、29株、16株、12株，呈現(xiàn)出明顯的降低趨勢(shì)，在糞污堆積的過程中會(huì)逐漸升溫，伴隨溫度的升高，也有部分細(xì)菌會(huì)被高溫殺死，要實(shí)現(xiàn)糞污的快速發(fā)酵功能，細(xì)菌必須能夠持續(xù)耐受高溫。

表1 不同溫度培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)菌的生長情況

2.2 細(xì)菌對(duì)淀粉降解能力測(cè)定試驗(yàn)

由表2可知，有7株細(xì)菌出現(xiàn)了明顯的暈環(huán)現(xiàn)象，其中H5、H8、H9、H10、H12共5株細(xì)菌Up值較高，尤其是H8細(xì)菌的Up值達(dá)到了7.11，說明水解淀粉的能力較強(qiáng)。

表2 細(xì)菌對(duì)淀粉降解能力測(cè)定結(jié)果

2.3 細(xì)菌液化明膠能力測(cè)定試驗(yàn)

由表3可知，在12株細(xì)菌中，有10株細(xì)菌對(duì)明膠有液化作用，將生長平板放置到4℃條件下，根據(jù)菌落周圍有沒有出現(xiàn)明膠重凝固確定降解菌的強(qiáng)弱，其降解能力為H8>H5≥H10≥H2>H12≥H3≥H9>H6≥H7≥H1，尤其是H8株，液化效果達(dá)到++++。

表3 細(xì)菌對(duì)明膠液化能力測(cè)定結(jié)果

2.4 細(xì)菌對(duì)纖維素降解能力測(cè)定試驗(yàn)

由表4可知，經(jīng)剛果紅篩選平板培養(yǎng)基培養(yǎng)之后，12株細(xì)菌均具有降解纖維素的能力，H2、H3、H5、H8、H10降解能力較為明顯，Up值均超過10，尤其是H8的Up值最高，達(dá)到了23.52，表現(xiàn)出較好的降解纖維素效果。

表4 細(xì)菌對(duì)纖維素降解能力測(cè)定結(jié)果

3 分析討論

在豬糞堆積發(fā)酵的過程中，長期的堆積會(huì)形成不同的產(chǎn)熱層，高溫層的位置和厚度隨著堆肥發(fā)酵時(shí)期呈動(dòng)態(tài)變化，其中高溫有助于豬糞的發(fā)酵腐熟[9]。由于當(dāng)前生豬養(yǎng)殖使用了大量的精飼料，導(dǎo)致糞便中有大量的蛋白質(zhì)和淀粉，因此要高效降解豬糞，首先要降解蛋白質(zhì)和淀粉。除此之外，養(yǎng)殖中產(chǎn)生的豬糞含有大量的水分，密度較高，糞堆中氧氣含量不足，不能直接堆肥，需要濾干水分，添加大量的木屑、秸稈等纖維素物質(zhì)，為了實(shí)現(xiàn)豬糞的快速發(fā)酵，發(fā)酵微生物還需要能夠降解纖維素，這樣才能將糞便中的有機(jī)物轉(zhuǎn)化成腐殖質(zhì)和有機(jī)殘?jiān)黐10]。試驗(yàn)中分離的32株細(xì)菌中有12株能夠耐受高溫，通過淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、纖維素降解試驗(yàn)，兼顧對(duì)各成分降解的平衡性，這12株細(xì)菌中只有H8株細(xì)菌能夠符合要求。說明該細(xì)菌具有應(yīng)用于豬糞堆肥快速腐熟，擴(kuò)大實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的潛力。