中華跌打丸中藥材鬼畫符、丁茄根水提取物的急性毒性試驗(yàn)研究

劉 佩，鐘 鳴，曾憲彪，王 麗，呂紀(jì)華，鄧聿胤

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022）

中華跌打丸是廣西高新技術(shù)產(chǎn)品，由廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司生產(chǎn)。該中成藥由金不換、鵝不食草、牛尾菜、牛膝、紅杜仲、劉寄奴、過崗龍、穿破石、毛兩面針、雞血藤、崗梅、木鱉子、丁茄根、鬼畫符等32味中草藥組成，具有活血祛瘀、消腫止痛、止血生肌、抗氧化、抗疲勞、增加免疫功能、促進(jìn)骨折愈合及軟組織損傷后修復(fù)等功效，臨床廣泛應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎、乳腺炎、皮膚病、軟組織損傷、骨折、消化性潰瘍等臨床病癥［1-4］。但近年來有文獻(xiàn)報(bào)道中華跌打丸存在損害胃腸系統(tǒng)、皮膚瘙癢等不良反應(yīng)［5］。本研究對(duì)中華跌打丸中丁茄根、鬼畫符藥材進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)研究，初步探討其安全性及毒副作用，為中華跌打丸的臨床安全用藥提供客觀依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物 丁茄根水提取物（凍干粉，批號(hào)：20190528），由廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司提供，每1 g 凍干粉相當(dāng)于18.2 g 丁茄根藥材，真空密封包裝后置2~8 ℃干燥遮光環(huán)境下保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)以蒸餾水配制成相應(yīng)濃度。鬼畫符水提取物（凍干粉，批號(hào)：20190901），由廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司出品，每1 g 凍干粉相當(dāng)于17.4 g 鬼畫符干藥材，真空密封包裝后置2~8 ℃干燥遮光環(huán)境下保存。以小鼠灌胃針能抽吸為限，最高配制濃度為0.3 g 凍干粉/ml，相當(dāng)于每毫升含5.22 g生藥。

1.2 動(dòng)物 健康性成熟昆明種小白鼠，SPF 級(jí)，6～8周齡，體質(zhì)量18~22 g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004；使用許可證號(hào)：SYXK 桂2016-0006。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為（23±2）℃，濕度為（70±5）%。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)方法 按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［6］中急性毒性試驗(yàn)有關(guān)方法進(jìn)行操作。

2.1.1 丁茄根水提取物小鼠灌胃最大耐受量試驗(yàn) 精密稱取丁茄根凍干粉適量，用蒸餾水配成9.36 g/ml、8.89 g/ml、8.45 g/ml、8.03 g/ml濃度藥液，即配即用。取100 只KM 小鼠，隨機(jī)分為5 組，即藥物 A、B、C、D 組及對(duì)照組，每組20 只（雌、雄各半）。藥物A、B、C、D 組分別予以不同濃度丁茄根水提取物灌胃，劑量分別為374.50 g/kg、355.78 g/kg、337.99 g/kg、321.09 g/kg，灌胃體積為40 ml/kg，每天灌胃1次。給藥后立即記錄小鼠中毒死亡情況，觀察小鼠毛色、四肢活動(dòng)、進(jìn)食、飲水、糞便等情況，共14 d。

2.1.2 鬼畫符水提取物小鼠灌胃急性毒性試驗(yàn) 精密稱取鬼畫符凍干粉適量，用蒸餾水配成4.5 g/ml、3.8 g/ml、3.2 g/ml、2.7 g/ml、2.3 g/ml、2.0 g/ml、1.7 g/ml、1.5 g/ml濃度藥液，備用。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)8個(gè)給藥劑量組。取合格小鼠90 只，隨機(jī)分為8 個(gè)劑量組，每組10只（雌、雄各半），剩余10 只小鼠作統(tǒng)計(jì)外給藥和病理檢查用。各劑量組小鼠分別灌胃上述不同濃度的鬼畫符水提取物（凍干粉）溶液35 ml/kg，劑量分別為157.5 g/kg、133.0 g/kg、112.0 g/kg、94.5 g/kg、80.5 g/kg、70.0 g/kg、59.5 g/kg、52.5 g/kg。使最高給藥劑量等于最小100%致死劑量（157.5 g/kg），最低給藥劑量約等于最大0%致死劑量（52.5 g/kg），相鄰兩個(gè)劑量組間的劑量比值約為1∶0.85。此外，選擇幾個(gè)適當(dāng)劑量（157.5 g/kg、133.0 g/kg、80.5 g/kg）給適量統(tǒng)計(jì)外小鼠灌胃給藥，同法試驗(yàn)，供組織病理檢查用。觀察給藥后14 d內(nèi)各組動(dòng)物中毒反應(yīng)和死亡情況。于給藥后2 d，取新死亡小鼠或統(tǒng)計(jì)外瀕死小鼠肝、腎器官，用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋切片，HE 染色，作組織病理檢查。給藥14 d 后處死存活小鼠，取肝臟同法切片，HE 染色或天狼猩紅染色，作組織病理檢查。根據(jù)給藥后14 d 內(nèi)小鼠死亡率查機(jī)率單位與權(quán)重系數(shù)表，找出各組小鼠死亡機(jī)率單位，給藥劑量換算成劑量對(duì)數(shù)，以劑量對(duì)數(shù)為X軸，機(jī)率單位為Y軸，作圖檢查兩者線性關(guān)系。依據(jù)劑量對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位關(guān)系計(jì)算半數(shù)致死劑量（LD50）、半數(shù)致死劑量（LD50）的95%平均可信限及99%平均可信限。

2.2 結(jié)果

2.2.1 丁茄根水提取物最大耐受量試驗(yàn)結(jié)果 小鼠灌胃給藥后出現(xiàn)飲食欠佳、少動(dòng)等癥狀，14 d 后，藥物A、B 組小鼠出現(xiàn)死亡，藥物C、D 組小鼠未見死亡，提示丁茄根水提取物（凍干粉）小鼠最大耐受量為337.99 g/kg，見表1。

表1 丁茄根水提取物最大耐受量試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 鬼畫符水提取物半數(shù)致死量試驗(yàn)結(jié)果 見表2、表3。小鼠灌胃給藥后出現(xiàn)飲食欠佳、少動(dòng)等癥狀，次日后相繼有小鼠死亡，死亡小鼠多集中在給藥后2～3 d。給藥后4 d 期間，存活小鼠飲食與體重增長(zhǎng)欠佳，高劑量組尤為顯著，低劑量組次之。給藥4 d后，存活小鼠飲食和活動(dòng)基本恢復(fù)正常，且都存活至給藥后14 d。各組小鼠死亡數(shù)與給藥劑量呈正相關(guān)，劑量越大，死亡越多，最高劑量組死亡率大于70%，最低劑量組死亡率小于30%（表2）。當(dāng)給藥劑量在94.5～59.5 g/kg區(qū)間時(shí)，劑量對(duì)數(shù)（1.9754～1.7745）與死亡機(jī)率單位（5.842～4.158）之間呈近似線性關(guān)系，回歸直線方程式為Y=9.555 1X-13.195。依照劑量對(duì)數(shù)和死亡機(jī)率單位等數(shù)據(jù)（表3），用綜合法計(jì)算得半數(shù)致死劑量（LD50）為80.209 g/kg，半數(shù)致死劑量（LD50）的95%平均可信限為（80.209±7.778）g/kg，半數(shù)致死劑量（LD50）的99%平均可信限為（80.209±10.198）g/kg。

表2 鬼畫符水提取物半數(shù)致死量試驗(yàn)結(jié)果 （n=10）

表3 鬼畫符水提取物小鼠急性毒性劑量對(duì)數(shù)和死亡機(jī)率單位的線性關(guān)系 （n=10）

2.2.3 小鼠肝腎病理檢查結(jié)果 給藥后2 d，肝、腎等主要器官，肉眼下可見小鼠肝臟呈灰白色改變，病理鏡下顯示肝細(xì)胞水腫、變性、壞死。且此病理改變與給藥劑量呈正相關(guān)，劑量越大病變范圍越大，甚至超出肝小葉范圍，相鄰的病變肝細(xì)胞連成廣泛性水腫、變性、壞死等細(xì)胞病理改變，見圖1。157.5 g/kg 組在100倍鏡下顯示，小鼠肝細(xì)胞廣泛性水腫、變性、壞死，病變范圍超出肝小葉，相鄰的病變相互融合，條索狀肝小葉組織結(jié)構(gòu)消失（圖1-A）；在400 倍鏡下顯示水腫肝細(xì)胞變圓變大，胞質(zhì)稀疏或空泡化，細(xì)胞質(zhì)著色淺淡，肝細(xì)胞水腫、變性、壞死，病變肝細(xì)胞無序排列（圖1-B）。80.5 g/kg 組在100 倍鏡下顯示，肝細(xì)胞水腫、變性、部分壞死，累及大部份肝小葉，條索狀肝小葉組織結(jié)構(gòu)尚可分辨（圖1-C）；在400 倍鏡下顯示水腫或變性肝細(xì)胞變圓變大，胞質(zhì)稀疏或空泡化，肝細(xì)胞水腫、變性、壞死。肝細(xì)胞有序排列，可區(qū)分條索狀肝小葉組織結(jié)構(gòu)（圖1-D）。

圖1 給藥2 d后小鼠肝臟病理改變（HE染色）

給藥后14 d，病理可見細(xì)胞質(zhì)著色變淺等肝細(xì)胞變性改變和散在點(diǎn)狀肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞變性范圍與給藥劑量呈正相關(guān)，劑量越大病變范圍越大，甚至超出肝小葉范圍（圖2），天狼猩紅染色切片未見明顯肝組織纖維化改變。157.5 g/kg 組小鼠肝組織在100 倍鏡下顯示，變性肝細(xì)胞著色變淺、片狀分布，條索狀肝小葉組織結(jié)構(gòu)完整（圖2-A）；在400 倍鏡下顯示變性肝細(xì)胞呈多邊形，胞質(zhì)著色淺淡，肝細(xì)胞有序排列（圖2-B）。80.5 g/kg 組小鼠肝組織在100 倍鏡下顯示，變性肝細(xì)胞著色變淺、片狀分布，條索狀肝小葉組織結(jié)構(gòu)完整（圖2-C）；在400 倍鏡下顯示變性肝細(xì)胞呈多邊形，胞質(zhì)著色淺薄，肝細(xì)胞有序排列，壞死肝細(xì)胞散在點(diǎn)狀分布（圖2-D）。

圖2 給藥14 d后小鼠肝臟病理改變（HE染色）

給藥后2 d，顯微鏡下見157.5 g/kg 組小鼠腎組織切片，腎小球和腎小管未見明顯異常（圖3）。

圖3 給藥2 d后小鼠腎臟病理切片（HE染色）

3 討 論

丁茄根來源為茄科植物水茄（Solanum torvum Swartz.）的干燥根及老莖，性微溫、味辛、微苦、有小毒，具有活血散瘀、消腫止痛之功效，主治胃痛、牙痛、風(fēng)濕痛、瘡毒等疾?。?］。水茄主要含有甾體類、皂苷類、脂肪族等化學(xué)成分，對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株（CNE-1 細(xì)胞）、人肺腺癌細(xì)胞株（A-549 細(xì)胞）、人舌癌細(xì)胞株（Tca8113細(xì)胞）和人肝癌細(xì)胞株（HepG-2細(xì)胞）等4種腫瘤細(xì)胞株有抑制作用，具有一定的抗腫瘤細(xì)胞毒性［8-9］。鬼畫符為大戟科植物黑面神Breynia fruticosa（L.）Hook.f.的根、嫩枝、葉，又稱鬼面葉，分布于廣西、廣東、浙江、福建等地，其枝、葉和莖皮所含鞣質(zhì)，莖皮中含量為12.02%［10］。鬼畫符性寒，味苦，有毒，具有清濕熱毒、祛瘀消腫之功，臨床應(yīng)用廣泛，常用于治療扁桃體炎、慢性支氣管炎、濕疹、皮炎、鶴膝風(fēng)、跌打腫痛等疾?。?1］。近年來藥理研究還顯示鬼畫符具有抗急性炎癥、抗皮膚I型超敏反應(yīng)、抑菌等作用［12-13］。

在丁茄根急性毒性試驗(yàn)中，以4 種不同劑量的丁茄根水提取物給藥，發(fā)現(xiàn)以337.99 g/kg、321.09 g/kg 劑量灌胃后，小鼠無一死亡，表明丁茄根水提取物小鼠最大耐受劑量為337.99 g/kg。鬼畫符急性毒性實(shí)驗(yàn)研究表明，小鼠灌胃鬼畫符水提取物半數(shù)致死劑量（LD50）為80.209 g/kg，半數(shù)致死劑量（LD50）的95%平均可信限為（80.209±7.778）g/kg，半數(shù)致死劑量（LD50）的99%平均可信限為（80.209±10.198）g/kg。小鼠灌胃鬼畫符水提取物后早期可發(fā)生急性中毒致死，多集中在給藥后2~3 d。病理顯示給藥后2 d，小鼠肝臟病變?yōu)楦渭?xì)胞水腫、變性、壞死。給藥后14 d，肝組織病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞變性、壞死，未見明顯肝組織纖維化，藥物主要損害小鼠肝臟。上述肝臟病變與給藥劑量呈正相關(guān)，劑量越大病變范圍越大，甚至廣泛性肝細(xì)胞水腫、變性，或散在點(diǎn)狀肝細(xì)胞壞死。小鼠死亡與鬼畫符水提取物（凍干粉）致小鼠廣泛性肝細(xì)胞水腫、變性、肝功能急性衰竭有關(guān)。

本研究對(duì)中華跌打丸中丁茄根、鬼畫符兩味藥進(jìn)行小鼠灌胃急性毒性試驗(yàn)，初步完善了方劑中丁茄根與鬼畫符的毒理學(xué)研究，可為中華跌打丸的臨床安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。