歐李LecRLKs基因表達分析及品種間差異比較

韓紅艷,付鴻博,鄧素芳,冀愛青,趙宇,杜俊杰*

歐李基因表達分析及品種間差異比較

韓紅艷1,付鴻博2,鄧素芳1,冀愛青1,趙宇1,杜俊杰2*

1. 晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系, 山西 晉中 030019 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院, 山西 太谷 030801

探究凝集素類受體蛋白激酶基因()與歐李抗性之間的關(guān)系，篩選抗性較高的歐李品種。本研究依據(jù)歐李轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出4個基因，利用qRT-PCR進行其在26個歐李品種果實中的表達分析，測定部分品種的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）的含量，并與基因表達情況進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明：與在各品種中的表達量相對較高，Nongda 5、10-03和JO-1中的表達量高，與其它品種比較有顯著差異；表達量高的品種（10-03、JO-1和Nongda 5）的保護性酶含量顯著高于表達量低的品種（Y04-26、08-24和03-25）；的表達豐度與果肉色澤存在一定關(guān)系，黃色或黃紅色果肉品種10-03、09-19、15-02、X17-01和08-16的相對基因表達量較高，可作為為歐李抗逆性選育的優(yōu)勢品種。

歐李; 基因表達; 種間差異

LecRLKs首次在擬南芥中被描述，其家族可分為G、L和C三種類型[1,2]。凝集素類受體蛋白激酶（Lectin receptor-like protein kinases，LecRLKs）被認為在細胞對外部刺激的反應(yīng)中扮演重要的角色，包括病原體的侵襲和環(huán)境脅迫[3]。植物在其生長發(fā)育過程中會遇到各種生長逆境，LecRLKs是定位于細胞膜最先感知逆境因子信號的受體，LecRLKs及其相互作用的信號成分構(gòu)成了植物細胞表面的識別和保護系統(tǒng)，使植物細胞之間交流并與環(huán)境相互作用[4,5]。LecRLKs參與了植物的脅迫耐受性，如參與鹽脅迫下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、參與ATP的識別、參與細胞死亡的調(diào)控、參與機械損傷的信號調(diào)控等[6-9]。植物受到逆境脅迫提高LecRLKs表達量的同時啟動自身的防御系統(tǒng)抵抗外界不良環(huán)境，抗氧化防御系統(tǒng)被啟動，SOD、POD、CAT等含量增加更好的清除細胞內(nèi)多余的活性氧自由基，抗氧化系統(tǒng)的啟動直接關(guān)系到植物抗逆性的強弱[10]。

歐李（）櫻桃屬植物，兼具經(jīng)濟價值和生態(tài)價值，抗逆性強。近年來，課題組從多角度研究抗性相關(guān)指標，對歐李種質(zhì)資源進行抗性鑒定和評價是其育種和引種的前提和基礎(chǔ)，如：DREB轉(zhuǎn)錄因子家族在提高植物抗性方面的研究[11]。歐李凝集素類受體蛋白激酶家族成員中G、C、L-型個數(shù)分別為125、43和2個，與其抗逆性密切相關(guān)。本文通過qRT-PCR檢測26個歐李品種果實中的表達差異，結(jié)合果實自身抗氧化防御系統(tǒng)各保護性酶的特征進行分析，為篩選抗逆性品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)歐李種質(zhì)資源圃(37°23′N, 112°29′E)，選擇26個歐李品種于2019年采集樣品，其中農(nóng)大4號歐李果實采集幼果期和成熟期果實，其余25個品種于果實成熟期采樣。采樣時分別從每個植株上、中、下部采取大小均勻一致，無病蟲害的果實10個，重復(fù)3次，采集的樣品液氮處理后，超低溫冰箱（- 80℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗試劑與儀器

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction kit 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）（艾德來）、離心機（Eppendorf 5424）、analytikjena-qTOWER2.2型熒光定量PCR儀（德國）、紫外分光光度計（UV-1700）、SCILOGEX D3024R離心機（美國）、analytikjena-Easycycler（德國），引物合成由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction kit 試劑盒的說明書提取。反轉(zhuǎn)錄按照TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit說明書合成cDNA。

1.3.2 熒光定量分析以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，以為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5設(shè)計qRT-PCR引物（表1），分析基因的表達水平（2-△△ct）。

表1 ChLecRLK基因qRT-PCR引物設(shè)計

1.3.3 SOD、POD、CAT活性測定選取ChLecRLK表達量高的品種（10-03、JO-1和Nongda 5）和ChLecRLK表達量低的品種（Y04-26、08-24和03-25）測定其保護性酶活性。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑光還原法[12]測定；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法[12]測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法[12]測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用boxplot軟件分析，Excel、Sigmaplot繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李果實中ChLecRLK差異基因篩選

基于農(nóng)大4號歐李果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共篩選出4個差異基因（、、和），這4個基因在成熟期的表達量明顯高于幼果期（圖1A）。通過qRT-PCR驗證后也發(fā)現(xiàn)，這4個基因在成熟期的表達量明顯高于幼果期，這與轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果一致。COG功能注釋顯示：4個所選基因表達產(chǎn)物參與了細胞受到外界信號刺激時所開啟的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此，將這4個基因作為候選基因進行分析。

圖1 ChLecRLK基因在轉(zhuǎn)錄組的表達情況(A)，qRT-PCR分析ChLecRLK基因的表達情況(B)

2.2 ChLecRLK基因在不同品種歐李果實中的表達分析

通過qRT-PCR分析、、和基因的表達情況可以看出，4個基因在26個歐李品種果實中均表達，且存在品種間差異。在10-03和Nongda 5中的表達量最高與其他24個品種均呈顯著性差異（<0.05），在08-24、03-38和Y04-26三個品種中的表達量最低，在03-25歐李果實中不表達。在10-03、JO-1和Nongda 5三個品種的表達量最高且與其他品種呈顯著性差異（<0.05），在08-24、03-25和Y04-26等多個品種中的表達量均較低。在09-19和15-02中表達量較高，在其他品種中表達量均較低且均無顯著性差異。在10-03和08-16中表達量較高與其他品種呈顯著性差異（<0.05），在03-38和03-25中表達量較低。

圖2 4個ChLecRLK基因在不同品種歐李果實中的表達分析

注：不同字母表示不同品種中的表達量差異顯著（<0.05）。

Note: Different letters in the figure indicates that the expression levels of different varieties were significantly different（<0.05）.

2.3 歐李ChLecRLK基因表達量與果皮、果肉色澤相關(guān)性分析

據(jù)圖3、圖4結(jié)合表2分析基因的相對表達量與果實色澤的相關(guān)性，結(jié)果顯示：黃色果皮品種中，差異基因、和的表達量偏高，值均落在箱體中，中位線偏下，上相鄰值到箱子的距離比下相鄰值到箱子的距離長，無異常值，基因表達有一個異常值，品種為09-19。4個基因的表達量值在紅色果皮品種之間較為集中，而在黃色果皮品種間差異大，但在紅色果皮品種中存在高表達異常值，在品種10-03和15-02表達異常，在品種10-03和JO-1表達異常，在品種15-02表達異常，在品種10-03、15-02和JO-1表達異常。黃色或黃紅色果肉品種4個差異基因表達量較高，中位線偏下且值異常品種為10-03、Nongda5號、09-19、15-02、X17-01、08-16和JO-1。表明：的表達量與果實色澤存在一定關(guān)系。

表2 歐李果實色澤

圖3 歐李果實ChLecRLK差異基因表達水平與果皮色澤的關(guān)系

圖4 歐李果實ChLecRLK差異基因表達水平與果肉色澤的關(guān)系

2.4 不同品種歐李果實中SOD、POD、CAT活性分析

從圖 5可知，所選6個品種的果實在成熟期均保持有SOD、POD和CAT活性，Nongda 5和JO-1兩個品種的SOD活性較高與其他四個品種呈顯著性差異（<0.05），Nongda 5的CAT和POD活性在6個品種中均最高與其他5個品種呈顯著性差異（<0.05）?？傮w來說，基因高表達量的品種（10-03、JO-1和Nongda 5）各保護性酶活性顯著高于基因低表達量的品種（Y04-26、08-24和03-25）。

圖5 不同品種歐李果實中SOD、POD、CAT活性

注：圖中不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平。

Note：Different letters indicate significant difference among differentfruit（< 0.05）.

3 討論與結(jié)論

凝集素類受體蛋白激酶（）是表達識別和傳遞逆境信號的蛋白分子，它在植物中表達豐度的高低可以作為選育抗逆品種的指標之一[13]。本研究通過對歐李26個品種成熟期果實中4個上調(diào)表達量分析，結(jié)果顯示：、和在品種10-03、15-02、JO-1、09-19、X17-01、08-16和Nongda 5七個品種中的表達量均顯著高于其他品種，結(jié)合表達量與果皮、果肉色澤相關(guān)性的分析，這7個品種中紅色果肉占14.2%，黃色果肉占85.8%，表明：的表達豐度與果肉色澤存在一定關(guān)系，黃肉品種10-03、09-19、X17-01、08-16和15-02可作為歐李抗逆性選育的優(yōu)勢品種。Nongda 5果實中基因的表達量及保護性酶的活性均與其他品種有顯著性差異，今后將其作為親本對開展歐李抗逆性品種選育具有重要意義。

在植物細胞中SOD、POD和CAT可清除自由基對生物膜的侵害，抑制膜脂發(fā)生過氧化，進一步維護生物膜的結(jié)構(gòu)和功能；SOD可通過歧化反應(yīng)清除自由基生成活性較弱的H2O2，CAT與POD將其還原為H2O[14]，CAT活性增強可以提高植物的抗逆境能力[15]。研究表明，同一植物不同品種[16，17]、不同發(fā)育期[18]、不同亞細胞定位[19]及同一器官的不同形狀[20]體內(nèi)抗氧化酶存在明顯差異，表現(xiàn)出在抵抗脅迫和適應(yīng)環(huán)境方面的遺傳多樣性其抗氧化酶活性不同。本研究以3個高表達量品種（10-03、JO-1和Nongda 5）和3個低表達量品種（Y04-26、08-24和03-25）進行SOD、POD和CAT活性測定，結(jié)果表明：表達量高其相應(yīng)的抗氧化防御能力高，二者在植物抗生物/非生物脅迫中存在一定的相關(guān)性，將作為今后研究的方向。

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Analysis ofGene Expression inand Comparison of Interspecific Differences

HAN Hong-yan1, FU Hong-bo2, DENG Su-fang1, JI Ai-qing1, ZHAO Yu1, DU Jun-jie2*

1.030619,2.030801,

The relationship between expression of lectin receptor protein kinase gene () and resistance ofselect the varieties with high resistance. In this study, fourup-regulated genes were screened according to the transcriptome data. Their expression abundances were detected in the fruits of 26 varieties ofby qRT-PCR methodAt the same time, the contents of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD) of some varieties were measured to correlate with gene expression.The results showed thatandhad relatively high expression levels in 26 varieties. Compared with other varieties, Nongda 5, 10-03 and JO-1 have high expression levels and the difference was significant. The contents of protective enzymes in varieties with highexpression levels including 10-03, JO-1 and Nongda5 were significantly higher than those in varieties with low expression including Y04-26, 08-24 and 03-25. The expression abundance ofhad relationship with the color of the pulp.differential gene expression levels of yellow or yellow-red flesh varieties including 10-03, Nongda 5, 09-19, 15-02, X17-01 and 08-16 were high. Therefore, they can be used as the dominant varieties for resistance breeding of.

; gene expression; interspecific difference

Q946

A

1000-2324(2021)06-0916-06

2021-08-05

2021-09-04

晉中學(xué)院“1331工程”創(chuàng)客團隊項目(Jzxycktd2017009);山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(201801D121251)

韓紅艷(1976-),女,碩士,副教授,研究方向:果樹種質(zhì)資源研究與創(chuàng)新. E-mail:hhy0822@126.com

通訊作者:Author for correspondence. E-mail:djj738@163.com