納米碳對百合試管苗生長代謝及生理特性的影響

張芳,任建宏,王育選,趙娟*

納米碳對百合試管苗生長代謝及生理特性的影響

張芳1,任建宏2,王育選2,趙娟2*

1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息學(xué)院, 山西 太谷 030801 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山西 太谷 030801

為研究納米碳對百合試管苗生長代謝及生理特性的影響，在優(yōu)化百合試管苗培養(yǎng)基的同時，探討納米碳在離體培養(yǎng)中的作用，為其應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)提供理論參考。本文以平陸百合脫毒試管苗為外植體，接種于附加不同濃度納米碳的培養(yǎng)基中，了解納米碳對百合鱗莖膨大、生根、增殖等生長情況的影響，并測定其干重、葉綠素含量、根系活力、全氮含量等生理指標(biāo)，分析納米碳對百合試管苗生理代謝的影響。結(jié)果表明：納米碳對百合試管苗鱗莖膨大、增殖、生根、物質(zhì)積累、根系活力、抗氧化性等均表現(xiàn)不同程度的促進(jìn)作用。百合試管苗膨大、增殖倍率、生根數(shù)、地上部和地下部干重、全氮、還原糖、Vc含量、根系活力、葉綠素含量、SOD、POD、CAT活性基本隨納米碳濃度提高先升高后降低，MDA含量則先降低后升高，這些指標(biāo)達(dá)到峰值時所需的納米碳濃度不同。綜合分析，納米碳適宜的附加濃度為400～600 mg·L-1，可調(diào)節(jié)百合試管苗生理生化過程，明顯促進(jìn)其生長。

納米碳; 百合; 試管苗; 生長代謝; 生理特性

納米技術(shù)是在納米（10-9m～10-7m）范圍內(nèi)認(rèn)識和改造物質(zhì)，是21世紀(jì)三大新興技術(shù)之一。納米碳是一種低燃點(diǎn)、非導(dǎo)性的改性碳，作為納米材料具有低毒等其它材料所不具備的優(yōu)良特性，在環(huán)境、能源、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1-3]。在農(nóng)業(yè)方面，其研究主要集中于納米碳促進(jìn)大田植物生長發(fā)育和提高肥效[4-6]，應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)方面的相關(guān)報道很少，煙草細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，納米碳可以促進(jìn)煙草細(xì)胞的生長[7]；馮璐等研究表明適宜濃度的納米碳對紅掌、大花蕙蘭、金昌棗等試管苗生長有促進(jìn)作用[8]；我們前期試驗(yàn)結(jié)果表明納米碳能夠促進(jìn)百合鱗片分化[9]。尚未見到關(guān)于納米碳對組培試管苗生長代謝及生理特性影響的相關(guān)報道。

平陸百合(var)是山西省平陸縣特有的食用百合品種，屬百合科百合屬，多年生草本球根植物，其鱗莖營養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“中條參”，具較高營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值[10-13]。百合常規(guī)繁殖以鱗莖分株為主，易受病毒感染，導(dǎo)致種球品質(zhì)退化、產(chǎn)量下降，莖尖脫毒培養(yǎng)獲得脫毒苗是解決這一問題的主要途徑，快繁可提供大量脫毒種球。但長期快繁過程中反復(fù)繼代培養(yǎng)會導(dǎo)致百合脫毒試管苗出現(xiàn)鱗莖退化、繁殖系數(shù)低、葉片徒長等問題[14,15]。通過調(diào)整激素種類和配比，低溫處理及附加其它調(diào)節(jié)生長的物質(zhì)，可改善試管苗生長受抑制的現(xiàn)象。納米碳對百合試管苗生長及代謝是否有促進(jìn)作用尚不明確。

本試驗(yàn)以百合脫毒試管苗為材料，在培養(yǎng)基中附加不同濃度納米碳，研究其對百合試管苗生長發(fā)育和生理代謝特性的影響，明確納米碳能否對百合試管苗生長起促進(jìn)作用，并篩選出納米碳的適宜添加濃度，優(yōu)化百合脫毒試管苗繼代和生根培養(yǎng)基，提高試管苗質(zhì)量，為植物組織培養(yǎng)過程中使用納米碳促生長提供新的思路和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

平陸百合（var.）脫毒試管苗由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)獲得。納米碳（C>90%，粒徑40 nm～80 nm）由山西華農(nóng)納米科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 平陸百合脫毒試管苗的培養(yǎng)平陸百合脫毒試管苗繼代培養(yǎng)基1為MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，繼代培養(yǎng)基2為MS+ZT 2.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+ NAA 0.8 mg·L-1。瓊脂6g·L-1，PH為5.6～5.8，培養(yǎng)溫度25±2 ℃，光照14 h·d-1，光照強(qiáng)度2000～3000 lx。

1.2.2 納米碳處理選取繼代培養(yǎng)獲得的均一健壯試管苗，接種到附加不同濃度納米碳（200、400、600、800、1000 mg·L-1）的上述3種培養(yǎng)基中，以不添加納米碳的處理為對照，培養(yǎng)條件同上，每處理重復(fù)3次，接種40 d后，觀察統(tǒng)計(jì)百合鱗莖膨大、增殖和生根情況。

1.2.3 生理指標(biāo)的測定在生根培養(yǎng)基中附加不同濃度納米碳（200、400、600、800、1000 mg·L-1），接種百合脫毒試管苗60 d后進(jìn)行下列指標(biāo)的測定。從鱗莖基部將百合試管苗地上部和地下部切分，分別在105 ℃下殺青30 min，80 ℃下烘干，測定其干重[16]；采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定根活力[17]；采用丙酮法測定葉片葉綠素含量[17]；采用半微量凱氏定氮法測定全氮含量[18]；采用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量[17]；采用分光光度計(jì)法測定Vc含量[19]；采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測定SOD活性[17]；采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性[17]；采用紫外吸收法測定CAT活性[17]；采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量[17]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并制圖，使用DPS7.05對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米碳對百合試管苗生長及干重的影響

不同小寫字母表示同一品種同一組織不同干旱脅迫程度下的差異顯著（＜0.05），下同。

Different lowercase alphabets indicate significant differences of the same variety and tissue under different drought stress levels at 0.05 level. The same as below.

2.1.1 對百合鱗莖膨大的影響由圖1-A可見，在繼代培養(yǎng)基1中附加不同濃度的納米碳均可促進(jìn)百合鱗莖膨大，且在200 mg·L-1～1000 mg·L-1范圍內(nèi)，鱗莖膨大倍數(shù)呈先升高后降低的趨勢。附加濃度為600 mg·L-1時，鱗莖膨大較對照增加了3.04倍，且生長健壯（圖2-A）。

2.1.2 對百合鱗莖增殖的影響相較于對照，在繼代培養(yǎng)基2中添加不同濃度的納米碳均可促進(jìn)百合鱗莖增殖，且在所設(shè)范圍內(nèi)，鱗莖增殖倍率呈先升高后降低的趨勢（圖1-B）。各處理間差異明顯，以附加600 mg·L-1納米碳時，百合鱗莖增殖效果最好，增殖倍率達(dá)9.8倍（圖2-B）。

2.1.3 對百合試管苗生根的影響將不同濃度納米碳附加于生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，納米碳對試管苗生根率和根長沒有明顯促進(jìn)作用，但可顯著促進(jìn)試管苗生根數(shù)增加（圖1-C，圖2-D）。以附加400 mg·L-1納米碳時，百合試管苗生根數(shù)達(dá)12.73條，且根健壯，適于移栽（圖2-C）。

2.1.4 對百合試管苗各部分干重的影響由圖1-D可見，在培養(yǎng)基中附加不同濃度納米碳均可促進(jìn)百合脫毒試管苗生長，其地上部和地下部干重積累增加。提高納米碳濃度，百合試管苗地上部和地下部干重積累先增加后減少，尤其在附加濃度為600 mg·L-1時，二者達(dá)到最大值，明顯高于對照，說明納米碳促進(jìn)百合生長作用明顯。

圖 2 納米碳對百合試管苗生長的影響

A: 鱗莖的膨大Enlargement of bulbs; B鱗莖的增殖Multiplication of bulbs; C-D:試管苗生根Rooting of test-tube plantlets

2.2 納米碳對百合試管苗幾種代謝物含量的影響

2.2.1 對百合各器官全氮含量的影響由圖3-A可知，培養(yǎng)基中添加不同濃度納米碳后，其葉片、鱗莖和根的氮含量均較對照有不同程度的提高，但不同器官所需的納米碳適宜濃度不同。葉片和鱗莖全氮含量達(dá)到最大值時所需納米碳濃度為600 mg·L-1，在此濃度下其含量別比照增加了202.95 mg·g-1和79.73 mg·g-1。根系全氮含量則在納米碳濃度為200 mg·L-1是達(dá)到最大，為133.39 mg·g-1，比對照增加了21.86 mg·g-1。說明納米碳對百合各器官中氮素積累有一定促進(jìn)作用，尤其是對葉片中氮素的積累作用更為顯著。

2.2.2 對百合鱗莖還原糖含量的影響與對照相比，培養(yǎng)基中附加低濃度納米碳對百合試管苗鱗莖中還原糖合成沒有明顯促進(jìn)作用，提高納米碳濃度至600 mg·L-1以上可明顯促進(jìn)還原糖含量增加。以添加800 mg·L-1納米碳時，還原糖含量最大，達(dá)31.78 mg·g-1，比照提增加了7.01 mg·g-1（圖3-B）。

2.2.3 對百合鱗莖Vc含量的影響百合試管苗鱗莖中Vc含量隨培養(yǎng)基中附加納米碳濃度升高出現(xiàn)上下波動變化，但與對照相比均有增加（圖3-C）。附加濃度為600 mg·L-1時，鱗莖中Vc含量達(dá)到最大，為22.91 mg·g-1，比對照增加了5.54 mg·g-1。

圖 3 不同濃度納米碳對百合試管苗代謝物含量的影響

2.3 納米碳對百合脫毒試管苗生理特性的影響

2.3.1 對百合試管苗根系活力的影響在培養(yǎng)基中添加不同濃度納米碳后，百合試管苗根系活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（圖4）。納米碳濃度在200 mg·L-1～800 mg·L-1范圍內(nèi)均可促進(jìn)根系活力提高，以添加400 mg·L-1納米碳時，根系活力達(dá)到最大，為936.31 μg·g-1·h-1，比對照上升29.5%，顯著高于對照和其它處理濃度。納米碳濃度提高至1000 mg·L-1時，根系活力下降，低于對照。

2.3.2 對百合試管苗葉片葉綠素含量的影響與對照相比，在培養(yǎng)基中附加納米碳可提高葉綠素含量，且濃度范圍內(nèi)不同濃度作用下，葉綠素a和葉綠素b含量均高于對照，但達(dá)到最大值時所需納米碳濃度略有差異（圖5）。葉綠素a含量在附加納米碳濃度為400 mg·L-1時達(dá)到最大值，比對照增加了0.205 mg·g-1；葉綠素b含量則在納米碳濃度為600 mg·L-1時達(dá)到最大值，比對照增加了0.115 mg·g-1。

圖 4 不同濃度納米碳對百合試管苗根系活力的影響

圖 5 不同濃度納米碳對百合試管苗葉片葉綠素含量的影響

2.3.4 對百合試管苗抗氧化性的影響由圖6可見，隨著附加納米碳濃度的升高，百合試管苗葉片和鱗莖中的抗氧化酶系SOD、POD、CAT活性均先升高后降低，出現(xiàn)峰值時所對應(yīng)的納米碳濃度不同，以附加納米碳濃度為400 mg·L-1～600 mg·L-1時顯著高于對照。這與細(xì)胞中MDA含量先降低后升高相對應(yīng)，說明納米碳增強(qiáng)了細(xì)胞的抗氧化性，減少M(fèi)DA積累。

圖6 不同濃度納米碳對百合試管苗抗氧化性的影響

3 討論

納米碳顆粒微小，可完全溶于水而成為超導(dǎo)體，促進(jìn)根系吸水，進(jìn)而促進(jìn)植物對礦質(zhì)元素的吸收，在植物物質(zhì)代謝和生長發(fā)育方面表現(xiàn)出良好的促進(jìn)作用[2]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中附加不同濃度納米碳可不同程度地促進(jìn)百合試管苗鱗莖膨大、增殖，并促進(jìn)試管苗生根量增加，促進(jìn)百合試管苗各部分干物質(zhì)積累。這與王佳琦等[20]、楊健等[21]、梁太波等[22]在大田植物玉米、烤煙上得到的研究結(jié)果相似。離體培養(yǎng)物在生根培養(yǎng)之前多數(shù)為無根材料，直接吸收培養(yǎng)基成分，納米碳可促進(jìn)沒有生根的鱗莖膨大和增殖與其強(qiáng)吸附性有關(guān)，可以有效地促進(jìn)培養(yǎng)物對培養(yǎng)基中水分、礦質(zhì)元素及有機(jī)物的吸收，這是促進(jìn)鱗莖膨大和增殖的重要原因。

在生根培養(yǎng)基中添加納米碳可明顯增加百合試管苗生根量、提高根系活力，能夠進(jìn)一步促進(jìn)百合試管苗對養(yǎng)分的吸收。本研究發(fā)現(xiàn)，使用納米碳后，百合試管苗葉片、鱗莖、根系中氮含量均明顯高于對照，說明納米碳促進(jìn)了氮素的吸收和在百合試管苗各部分的積累。同時試管苗鱗莖的還原糖和Vc含量，試管苗葉片葉綠素含量也明顯高于對照，這與馬興立等[23]研究結(jié)果相似。說明納米碳對百合試管苗物質(zhì)代謝合成也表現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用。這與大田植物上得到的納米碳促進(jìn)對氮素的吸收，提高其葉綠素含量，促進(jìn)植物生長的結(jié)論一致[24-26]。

研究表明，將納米碳加入基肥或追肥中均可降低氮素土壤殘留，顯著提高大田作物氮肥利用率。納米碳顆粒尺度小、表面能活性高，能以聚合物的形式與土壤中的營養(yǎng)離子結(jié)合，促進(jìn)植物吸收和利用養(yǎng)分。但本文將納米碳添加入培養(yǎng)基中，促進(jìn)離體培養(yǎng)材料的生長代謝，其作用機(jī)理可能又有所不同，單從納米碳的高吸附性上已不能完全解釋其促生長和吸收的機(jī)制。本試驗(yàn)中也從提高植物抗氧化性上做了初步研究，結(jié)果表明，納米碳可以提高抗氧化酶SOD、POD、CAT活性，降低細(xì)胞MDA含量，減小細(xì)胞受損程度，這可能也是納米碳促生長的原因之一；趙振杰等[27]的研究認(rèn)為納米碳能顯著提高離體培養(yǎng)的煙草細(xì)胞水通道蛋白基因和細(xì)胞周期蛋白基因的表達(dá)量，這是促進(jìn)愈傷組織生長的基礎(chǔ)，但要全面了解納米碳促進(jìn)離體培養(yǎng)物生長和分化的機(jī)理還需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

從百合試管苗外部形態(tài)看，培養(yǎng)基中添加適宜濃度的納米碳可以促進(jìn)百合試管苗鱗莖膨大和增殖，促進(jìn)試管苗生根數(shù)增加。從內(nèi)部代謝看，納米碳提高根系活力，促進(jìn)營養(yǎng)吸收和積累，氮素、還原糖和Vc含量增加，促進(jìn)葉綠素合成，提高抗氧化酶活性，減少細(xì)胞損傷，促進(jìn)試管苗生長。

[1] Borm PJ, Robbins D, Haubold S,. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC [J]. Particle and Fibre Toxicology, 2006,14(3):11-35

[2] Alia DS, Castillo-michel H, Hemandez-viezcas JA,. Synchrotron micro-XRF and micro-XANES confirmation of the uptake and translocation of TiO2nanoparticles in cucumber () plants Environmental [J]. Scienc ＆ Technology, 2012,46(14):7637-7643

[3] 張中太,林元華,唐子龍,等.納米材料及其技術(shù)的應(yīng)用前景[J].材料工程,2000(3):42-48

[4] 張志明,劉鍵,韓振,等.納米增效肥對雜交稻的增產(chǎn)效果研究[J].腐植酸,2012(2):15-19

[5] 趙娜,姚玉鵬,劉曉東,等.不同用量納米碳溶膠對玉米生長及產(chǎn)量的影響[J].北方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2017,45(6):62-66

[6] 李小龍,孫占偉,過偉民,等.納米碳增效肥料對煙草農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟(jì)指標(biāo)的影響[J].土壤,2016,48(4):831-834

[7] Khodakovskaya MV, Silva K, Biris AS,. Carbon nanotubes induce growth enhancement of tobacco cells [J]. ACS Nano, 2012,6(3):2128-2135

[8] 馮璐,王玉國,溫銀元,等.納米碳對離體培養(yǎng)條件下幾種植物生長及分化的影響[J].生物技術(shù)通報,2017,33(4):164-168

[9] 王鵬麗,任建宏,王曉璐,等.納米碳對平陸百合脫毒苗鱗片分化的影響[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2017,37(12):879-883

[10] 朱昀,王未,李倩,等.百合珠芽與鱗莖營養(yǎng)成分及活性成分研究[J].生物技術(shù)進(jìn)展,2016,6(5):336-340

[11] 靳磊,劉師源,張萍.岷江百合鱗莖生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分分析[J].食品工業(yè),2016,37(9):255-258

[12] Kim KH, Moon E, Choi SU,. Polyphenols from the bark of Rhus verniciflua and their biological evaluation on anti-tumor and anti-inflammatory activities[J]. Phytochemistry, 2013,92(3):113-121

[13] Hou R, Chen J, Yue C,. Modification of lily polysaccha-ride by selenylation and the immune-enhancing activity[J]. Carbohy Poly, 2016,142(1):73-81

[14] 吳英英,許昌慧,唐軍榮,等.野生紫斑百合高效離體再生體系的建立[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,28(2):242-246

[15] 周春華,尤超,陳凝華.百合組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].北方園藝,2013(14):193-195

[16] 任建宏.不同外源物質(zhì)對平陸百合組織培養(yǎng)影響的研究[D].太谷:山西農(nóng)業(yè)大學(xué),2017

[17] 李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2000:119-120

[18] 鮑士旦.土壤農(nóng)化分析[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000:58-76,119-120

[19] 聶洪勇.維生素及其分析方法[M].北京:輕工業(yè)出版社,1989:7-8

[20] 王佳奇,李麗鶴,孟令波,等.納米碳對玉米種子萌發(fā)及根系形態(tài)的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2013(18):62-66

[21] 楊健,梁太波,李海江,等.納米碳溶膠對烤煙根系生理特性及鉀吸收的影響[J].煙草科技,2015,48(1):7-11

[22] 梁太波,尹啟生,張艷玲,等.施用納米碳對烤煙氮素吸收和利用的影響[J].生態(tài)學(xué)報,2014,34(6):1429-1435

[23] 馬興立,趙昆昆,趙品源,等.納米碳點(diǎn)對花生幼苗生長及其相關(guān)生理生化指標(biāo)的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報,2019,34(2):138-144

[24] 李淑敏,馬辰,李麗鶴,等.納米碳對玉米氮素吸收及根系活力和土壤酶活性的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(7):14-18,25

[25] 喬俊,趙建國,解謙,等.納米炭材料對作物生長影響的研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2017,33(2):162-170

[26] 吉增寶,王進(jìn)鑫,李繼文,等.不同季節(jié)干旱及復(fù)水對刺槐幼苗可溶性糖含量的影響[J].西北植物學(xué)報,2009,29(7):1358-1363

[27] 趙振杰,梁太波,王寶林,等.不同培養(yǎng)條件下納米碳溶膠對煙草細(xì)胞生長的影響[J].煙草科技,2018,51(5):1-7

Effect of Nano-carbon on the Growth Metabolism and Physiological Characteristics of Lily Test-tube Plantlet

ZHANG Fang1, REN Jian-hong2, WANG Yu-xuan2, ZHAO Juan2*

1./030801,2./,030801,

In order to study the effect of nano-carbon on the growth and metabolism and physiological characteristics of lily tube seedling, the role of nano-carbon in vitro culture was studied while optimizing the culture medium of lily tube seedling so as to provide theoretical reference for its application in plant tissue culture. In this paper, the virus-free plantlets of Lilium pinglu were used as explants and inoculated in the medium supplemented with different concentrations of nano carbon. Thus the effects of nano carbon on lily bulb expansion, rooting and proliferation were investigated as well as the physiological indexes such as dry weight, Chlorophyll content, root activity and total nitrogen content were measured to analyze the influence of nano carbon on the physiological metabolism of Lily tube seedlings. The results showed that the nano-carbon had different degree of promoting effect on the bulbous expansion, its proliferation, root activity, rooting matter accumulation, antioxidant activity of Lily test-tube plantlet. Lily tube seedlings inflated, proliferation rate, rooting number, above-ground dry weight as well as underground dry weight, total nitrogen, reducing sugar, Vc content, root activity, Chlorophyll content, SOD, POD, CAT activity basically increased first and then decreased with the increase of nano carbon concentration while MDA content decreased first and then increased instead. And the concentration of nanocarbon required would be different when these indexes reach to peak. According to the comprehensive analysis, the appropriate additional concentration of carbon nanoparticles was 400～600 mg·L-1, which could regulate the physiological and biochemical process of lilium tube-seedling and significantly promote its growth.

Nano-carbon; Lily; test-tube plantlet; growth metabolism; physiological characteristics

S644.1

A

1000-2324(2021)06-0911-05

2020-02-12

2020-04-13

山西省面上青年基金項(xiàng)目(201601D202054);山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20130311014-1);山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動項(xiàng)目(2012YJ13)

張芳(1982-),女,碩士研究生,研究方向:植物組織培養(yǎng). E-mail:910380646@qq.com

通訊作者:Author for correspondence. E-mail:sxndzhaojuan@163.com