獼猴桃Ac-miR160d啟動子區(qū)的克隆及表達(dá)分析

李哲馨，祝 瀅，蔣 娟，決登偉，李洪雷，唐建民，蘭建彬

（1.重慶文理學(xué)院 園林與生命科學(xué)學(xué)院/特色植物研究院，重慶 402160； 2.重慶市特色植物產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 402160；3.重慶市經(jīng)濟(jì)植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402160）

獼猴桃Actinidia chinensis是我國山區(qū)脫貧攻堅(jiān)的重要產(chǎn)業(yè)，然而其果實(shí)在采后貯藏過程中極易遭受各類病原菌侵染而變軟腐爛，成為阻礙獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[1]。MicroRNA（miRNA）是一類長度為20 ～24 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過與目標(biāo)基因序列互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)的沉默，從而調(diào)控生命活動中的一系列重要生物學(xué)過程，并被證實(shí)參與植物和逆境脅迫的互作[2-4]。研究獼猴桃miRNA 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，可為利用miRNA 改良獼猴桃品種、提升果實(shí)貯藏保鮮品質(zhì)提供重要的基因資源。

MiR160 作為miRNA 家族的重要一員，通過靶向生長素響應(yīng)因子ARFs 參與生長素信號傳導(dǎo)途徑并發(fā)揮調(diào)控作用[5]。多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)，miR160 參與植物生物脅迫過程。火炬松莖部感染銹病真菌會導(dǎo)致miR160 的表達(dá)受到抑制而下調(diào)表達(dá)[6]。Perez-Quintero 等的研究結(jié)果表明，木薯miR160 通過調(diào)節(jié)生長素信號傳導(dǎo)參與對細(xì)菌性萎蔫病菌的響應(yīng)，且調(diào)節(jié)生長素信號傳導(dǎo)可能是抑制植物細(xì)菌生長的重要策略[7]。大豆感染煙草花葉病毒后，miR160 被誘導(dǎo)發(fā)生明顯上調(diào)表達(dá)[8]。 MiR160 在易感水稻品種中的過表達(dá)導(dǎo)致植株對米曲霉的抗病性增強(qiáng)[9]。以上研究結(jié)果表明，miR160 參與對真菌病原菌的防御反應(yīng)。

目前，miR160 已經(jīng)在擬南芥、蘋果、楊樹等多種植物中被發(fā)現(xiàn)，并被證實(shí)參與植物的許多生物學(xué)功能[10-13]，但尚不清楚miR160 上游受哪些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。啟動子是必需的基因轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)域，對miRNA 核心啟動子和順式作用元件的鑒定與分析有助于了解miRNA 的活化機(jī)制及其在整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要作用。本研究前期，筆者通過小RNA 測序發(fā)現(xiàn)，被灰霉菌Botrytis cinerea侵染后獼猴桃miR160d 被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，推測Ac-miR160d的啟動子很可能是逆境誘導(dǎo)型啟動子。為給Ac-miR160d 在逆境應(yīng)答中的功能研究提供參考，本研究中克隆Ac-miR160d 的啟動子序列，分析啟動子序列中含有的順式作用元件及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域，并對Ac-miR160d 表達(dá)受逆境誘導(dǎo)調(diào)控進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以遺傳背景清晰的‘紅陽’獼猴桃Actinidia chinensiscv.‘Hongyang’的果實(shí)作為試驗(yàn)材料。果實(shí)采集自重慶文理學(xué)院黃瓜山獼猴桃示范基地。因樹體上發(fā)育果實(shí)的不確定因素較多，如病蟲害入侵、果實(shí)位置、氣候條件等，增加了試驗(yàn)結(jié)果的不確定性。為盡量避免上述不確定性因素，采集授粉后130 d 約95 g 的獼猴桃果實(shí)，并在采后3 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，使用2%次氯酸鈉消毒2 min，再用自來水沖洗2 ～3 次，晾干后備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物材料的脅迫處理

灰霉菌HFXC-16 菌株分離自感染獼猴桃[14]，提前2周接種到新的PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃條件下培養(yǎng)備用。用無菌水稀釋菌體，制成104CFU/mL 的菌懸液。將采集的果實(shí)隨機(jī)分成3 組，每個(gè)果實(shí)用無菌針管扎5 mm 深，造成傷口并晾干后，分別推入10 μL 無菌水、100 mmol/L NaCl 溶液、灰霉菌懸液和40 mg/kg GA3溶液。雖然采摘后的果實(shí)可能會發(fā)生一定的基因表達(dá)的變化，但在進(jìn)行脅迫處理時(shí)設(shè)置了對照組試驗(yàn)，miR160d 表達(dá)水平的規(guī)律性變化可以說明其參與獼猴桃植物激素信號及逆境脅迫的響應(yīng)。每處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)處理10 個(gè)果實(shí)，置于光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)（溫度25 ℃、濕度85%）。侵染0、1、2、3、4、5、6 d 時(shí)采集創(chuàng)傷口周圍樣品，使用液氮迅速冷凍并置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 Ac-miR160d 啟動子克隆與RNA 二級結(jié)構(gòu)分析

采用CTAB 法提取獼猴桃基因組DNA。采用TransStart?FastPfuDNA Polymerase 高保真酶（全式金，北京）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件參照說明書。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至克隆載體pEASY?- Blunt Cloning Kit（全式金，北京）并進(jìn)行測序驗(yàn)證。所用引物序列（5′—3′）的上游引物為AAACAAATACGCTTTAAGATGTGA，下游引物為GTTTCATGCACATGCACACA。通過在線工具M(jìn)fold（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）分析各前體序列的RNA 二級結(jié)構(gòu)。

1.2.3 Ac-miR160d 啟動子序列的生物信息學(xué)分析

使用Neural Network Promoter Prediction 在線軟件（https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）進(jìn)行核心啟動子預(yù)測；使用PlantCARE 網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析Ac-miR160d 啟動子區(qū)域可能存在的順式作用元件；使用PROMO 在線軟件（http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3）對Ac-miR160d 啟動子序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，設(shè)置物種范圍為植物。

1.2.4 Ac-miR160d 啟動子序列的qRT-PCR 分析

使用RNAiso Plus 試劑盒（Takara，大連）提取總RNA，使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 試劑盒（全式金）合成第一鏈cDNA，使用TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒（全式金）進(jìn)行qRT-PCR 分析。所用引物序列（5′—3′）的上游引物為TGCCTGGCTCCCTGTATGAA，下游引物 為GTGCAGGGTCCGAGGT。 以β-actin作 為內(nèi)參基因[15]，所用引物序列（5′—3′）的上游引物為GCAGTGTTTCCCAGTATTGT，下游引物為TCCATGTCATCCCAGTTGC。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ac-miR160d 啟動子序列克隆

根據(jù)‘ 紅陽’ 獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫（http://kiwifruitgenome.org/）、前期本課題組miRNA 及轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果（已上傳至NCBI，PRJNA645761），獲取獼猴桃Ac-miR160d 前體序列，該前體序列編號為+1 ～+86 bp，以+1 上游 2 111 bp，+86 下游86 bp 作為Ac-miR160d 的預(yù)測啟動子，長度為2 283 bp。以獼猴桃果實(shí)基因組為模板，采用高保真酶擴(kuò)增，可獲得單一條帶，通過測序獲得該啟動子及前體基因序列（圖1）。對Ac-miR160d 前體的RNA 二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其具有典型的小RNA 前體序列結(jié)構(gòu)特征，即具有穩(wěn)定的莖環(huán)折疊的RNA 二級結(jié)構(gòu)以及miR/miR*二聚體結(jié)構(gòu)，且無較大的蛋白編碼序列（圖2）。

圖1 Ac-miR160d 預(yù)測啟動子克隆Fig.1 Ac-miR160d predicted promoter clone

圖2 Ac-miR160d 前體RNA 的二級結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary structure of Ac-miR160d precursor RNA

2.2 Ac-miR160d 啟動子核心區(qū)域預(yù)測

啟動子核心區(qū)域是保證RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的DNA 序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-25 ～-30 bp 處的TATA 盒，其確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。使用Neural Network Promoter Prediction 在線軟件，以預(yù)測值0.8 作為判斷的截?cái)嘀担搯幼有蛄锌赡艽嬖陬A(yù)測分值分別為1.00、0.91、0.82、0.96、0.84 和0.89 的6 段核心啟動子區(qū)域，序列分別位 于40 ～90、891 ～941、921 ～971、1 290 ～ 1 340、1 875 ～1 925 及2 060 ～2 110 bp 處，可能轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別為C、T、A、A、G、A，分別位于81、932、962、1 331、1 926、2 101 bp 處 （表1）。

表1 Ac-miR160d 啟動子核心區(qū)域預(yù)測結(jié)果?Table 1 The prediction result of the core region in Ac-miR160d promoter

2.3 Ac-miR160d 啟動子順式作用元件預(yù)測

使用PlantCARE 和PLACE 網(wǎng)站在線分析AcmiR160d 啟動子區(qū)域可能存在的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)該啟動子區(qū)域不僅存在TATA-box、CAATbox 等基本轉(zhuǎn)錄元件，還存在激素應(yīng)答元件（赤霉素應(yīng)答元件P-box、水楊酸響應(yīng)元件TCAelement、脫落酸應(yīng)答元件ABRE、茉莉酸響應(yīng)元件CGTCA-motif 等）、參與逆境脅迫的元件（厭氧響應(yīng)元件ARE、干旱誘導(dǎo)的MYB 結(jié)合位點(diǎn)等）以及大量光應(yīng)答元件（ATCT-motif、G-box、GAmotif、BOX4、GATA-motif、GT1-motif、LAMPelement、MRE、Sp1、chs-CMA2a 等），如圖3 所示。

圖3 Ac-miR160d 啟動子順式作用元件預(yù)測結(jié)果Fig.3 Prediction of cis-acting elements in Ac-miR160d promoter sequences

2.4 Ac-miR160d 啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域預(yù)測

使用PROMO 在線軟件對Ac-miR160d 啟動子序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該啟動子區(qū)存在PF1、PBF、SQUA、MYB2、HSF1、 GAMYB、SPF1、Dof2、PHR1 等26 種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（圖4）。

圖4 Ac-miR160d 啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域預(yù)測結(jié)果Fig.4 Prediction of Ac-miR160d promoter transcription factor binding domain

2.5 Ac-miR160d 在脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)分析

根據(jù)Ac-miR160d 啟動子區(qū)順式作用元件的分析結(jié)果，分別對獼猴桃果實(shí)進(jìn)行非生物（NaCl、GA3）和生物（灰霉菌）脅迫處理，并檢測AcmiR160d 的水平。結(jié)果顯示，當(dāng)獼猴桃果實(shí)受到鹽脅迫時(shí)，在脅迫處理后1 d 時(shí)Ac-miR160d 的水平即發(fā)生明顯下調(diào)，脅迫處理后3 ～6 d 時(shí)下調(diào)更為顯著。當(dāng)獼猴桃果實(shí)受到GA3處理和灰霉菌侵染時(shí)，Ac-miR160d 的水平出現(xiàn)先升高、后降低的趨勢，在侵染處理后1 ～2 d 時(shí)急劇升高，隨后逐漸降低（圖5）。說明Ac-miR160d 參與獼猴桃鹽脅迫及其與灰霉菌的互作，且與激素調(diào)控密切相關(guān)。

圖5 Ac-miR160d 在鹽脅迫、GA3 處理及灰霉菌侵染下的表達(dá)Fig.5 Expression analysis of Ac-miR160d under salt stress, GA3 treatment and B.cinerea infection

3 結(jié)論與討論

本研究中克隆了獼猴桃Ac-miR160d 的啟動子序列，并分析了其順式作用元件及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域，結(jié)合鹽脅迫、GA3處理及灰霉菌侵染后獼猴桃果實(shí)內(nèi)Ac-miR160d 的表達(dá)情況，初步驗(yàn)證AcmiR160d 的表達(dá)受逆境誘導(dǎo)調(diào)控。

有研究結(jié)果表明，miRNA 啟動子序列中含有TATA-box、CAAT-box、CT repeat 等啟動子特征元件[16]。本研究中克隆到的Ac-miR160d 啟動子序列中含有相關(guān)元件，說明Ac-miR160d 啟動子符合RNA 聚合酶Ⅱ指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的基因啟動子的特征。通過啟動子核心區(qū)域預(yù)測，初步確認(rèn)獼猴桃Ac-miR160d 啟動子序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在AcmiR160d 上游180 ～1 000 bp 處。

受逆境誘導(dǎo)的miRNA 啟動子存在逆境應(yīng)答相關(guān)元件[17]。在對Ac-miR160d 啟動子元件進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一些與激素應(yīng)答、逆境脅迫、光應(yīng)答相關(guān)的元件。這些元件的存在說明Ac-miR160d極有可能參與對激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境脅迫和光反應(yīng)的調(diào)控過程。miRNA 的轉(zhuǎn)錄由復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)，外界環(huán)境刺激或內(nèi)源信號可促使不同轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件相結(jié)合。miRNA 啟動子上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位的確定對研究miRNA 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要意義，可為后續(xù)Ac-miR160d 上游互作蛋白篩選及對miR160 抗逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的挖掘提供參考。本研究中發(fā)現(xiàn)Ac-miR160d 啟動子區(qū)存在大量參與調(diào)控逆境脅迫轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。PBF和Dof2 屬于Dof 家族C2H2 鋅指因子類，PBF 被證實(shí)有助于bZIP 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA[18]。MYB 和WRKY 是植物轉(zhuǎn)錄因子基因家族的2 個(gè)大類，參與調(diào)控植物對生物和非生物脅迫的雙重響應(yīng)[19-22]。本研究結(jié)果表明，在Ac-miR160d 啟動子區(qū)域有MYB2、GAMYB、MYB305 以及SPF1 結(jié)合位點(diǎn)，還有參與高溫脅迫響應(yīng)的HSF1、磷脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PHR1 等結(jié)合位點(diǎn)，這些結(jié)合位點(diǎn)均與脅迫誘導(dǎo)調(diào)控相關(guān)聯(lián)。

本研究中分別用無菌水、NaCl 溶液、GA3溶液及灰霉菌懸浮液對獼猴桃果實(shí)處理0 ～6 d 后進(jìn)行qRT-PCR 分析，結(jié)果表明miR160d 的表達(dá)在獼猴桃果實(shí)受鹽脅迫、GA3誘導(dǎo)和灰霉菌侵染后迅速作出反應(yīng)，推測Ac-miR160d 參與調(diào)控獼猴桃果實(shí)對NaCl 脅迫及灰霉菌的防御響應(yīng)，且與激素調(diào)控密切相關(guān)。在灰霉菌侵染后1 ～2 d 時(shí)AcmiR160d 的表達(dá)明顯上調(diào)，說明獼猴桃果實(shí)通過miR160d 的表達(dá)抵抗灰霉菌侵染造成的脅迫；隨著脅迫處理后時(shí)長的增加，miR160d 的表達(dá)有所下調(diào)，但在處理后4 d 時(shí)有所回升，隨后再次下調(diào)，推測獼猴桃果實(shí)逐漸適應(yīng)脅迫后miR160d 的表達(dá)有所回升，但是由于無法長時(shí)間適應(yīng)，使得miR160d 再次下調(diào)?；颐咕秩精J猴桃果實(shí)后，miR160d 的表達(dá)水平明顯高于赤霉素處理。這些結(jié)果進(jìn)一步說明Ac-miR160d 啟動子為逆境誘導(dǎo)型啟動子。

由于本研究中生物信息學(xué)分析結(jié)果具有一定的局限性，應(yīng)進(jìn)行分子生物學(xué)及功能的驗(yàn)證。下一步將構(gòu)建Ac-miR160d 啟動子融合GUS基因植物表達(dá)載體，利用獼猴桃遺傳轉(zhuǎn)化體系[23-24]，在多種脅迫和激素誘導(dǎo)條件下，驗(yàn)證啟動子相應(yīng)順式作用元件的功能。