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    受體相互作用蛋白激酶1基因表達(dá)下調(diào)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖活性及其機(jī)制研究

    2022-01-21 11:36:02李彥華馬紅帥韓奇財(cái)
    腫瘤基礎(chǔ)與臨床 2021年6期
    關(guān)鍵詞:蛋白激酶壞死性孵育

    李彥華,馬紅帥,田 青,韓奇財(cái)

    (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科,河南 鄭州 450052)

    骨肉瘤是一種高度侵襲性的原發(fā)性骨惡性腫瘤,高發(fā)于兒童和青少年。主要治療手段是新輔助化療+手術(shù)+術(shù)后化療,但患者往往對(duì)化療不敏感,容易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移,預(yù)后差。因此,針對(duì)骨肉瘤尋找有效的治療靶點(diǎn)以及藥物十分重要[1-2]。受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1, RIPK1)在細(xì)胞命運(yùn)的抉擇中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,已逐漸成為多種疾病治療的有效靶點(diǎn)之一[3]。但RIPK1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲及死亡等生物活性是否具有調(diào)整作用,尚不清楚。本研究擬通過(guò)小干擾核糖核酸(small interference ribonucleic acid,siRNA)干擾骨肉瘤細(xì)胞中RIPK1的表達(dá),檢測(cè)RIPK1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲及死亡等生物功能的影響,明確RIPK1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物活性的調(diào)控作用及機(jī)制。

    1 資料與方法

    1.1 材料骨肉瘤MG63細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所;細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;RIPK1、Cleaved caspase-3、p-RIPK3、RIPK3、磷酸化混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(phosphorylated-mixed lineage kinase domain-like,p-MLKL)、β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTeck公司;倒置相差顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司;Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將骨肉瘤MG63細(xì)胞株,以1×106個(gè)細(xì)胞接種于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中,37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)。每3 d換液1次。細(xì)胞融合率達(dá)到80%,用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%乙二胺四乙酸的胰酶消化細(xì)胞,傳代,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3 應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染抑制RIPK1的表達(dá)設(shè)計(jì)3對(duì)針對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞株的siRIPK1引物5’-GGAATATGAGTGATATGATdTdT-3’,5’-AUUGAUUCGGAGACUAUACdTdT-3’;5’-GAACCUGAUTAAAGCAGGAdTdT-3’,5’-CUACGAACUUAGGGCAGUCdTdT-3’; 5’-GAGCACGAAGCAGTAGCTGAdTdT-3’,5’-GGCUGUCAAGCUGCdTdT-3’。以上引物均由廣州銳博科技有限工作合成。使用Lipofectamine 3000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72 h后檢測(cè)RIPK1的表達(dá)。

    1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察siRNA干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞3 d后,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)變化,判斷細(xì)胞活性和增殖變化。

    1.5 CCK-8細(xì)胞增殖定量分析細(xì)胞干預(yù)完畢后,向每孔加入20 μL CCK8溶液,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h;用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

    1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡將細(xì)胞以1×106個(gè)/L的細(xì)胞濃度接種于6孔板,細(xì)胞貼壁,干預(yù);收集細(xì)胞,磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次,分別加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液、5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙錠染色液,輕輕混勻;室溫,避光孵育20 min;隨后置于冰浴中;然后流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

    1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)收集完細(xì)胞后,裂解液裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白。RIPK1、Cleaved caspase-3、p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL檢測(cè)參照課題組既往操作流程進(jìn)行,將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜,體積分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉2 h,一抗4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜10 min×4次,二抗常溫孵育2 h,洗膜10 min×4次,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光、壓片,上機(jī)檢測(cè)蛋白條帶[4]。

    2 結(jié)果

    2.1 干擾骨肉瘤細(xì)胞siRIPK1篩選結(jié)果Western blot分析結(jié)果顯示,不同siRIPK1干擾后,空白對(duì)照組、siRIPK1-1組、siRIPK1-2組、siRIPK1-3組骨肉瘤細(xì)胞RIPK1相對(duì)表達(dá)水平分別為1.000±00.000、0.436±0.106、0.705±0.167、0.625±0.086,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.190,P=0.001), siRIPK1-1組、siRIPK1-2組、siRIPK1-3組骨肉瘤細(xì)胞RIPK1表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組(P均<0.05),其中siRIPK1-1組最高,干擾效率最高。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們將采用siRIPK1-1組序列對(duì)骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行干擾。見(jiàn)圖1。

    圖1 不同siRIPK1干擾后骨肉瘤細(xì)胞RIPK1表達(dá)變化

    2.2 不同siRIPK1干擾后骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制情況采用CCK-8法檢測(cè)siRIPK1干擾對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:干擾24 h后,空白對(duì)照組吸光度值為0.464±0.004,siRIPK1-1組為0.452±0.0051,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.476,P=0.190);干擾48 h后,2組吸光度值分別為0.925±0.038、0.629±0.027;差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.910,P<0.001);干擾72 h后,2組吸光度值分別為1.517±0.011、0.518±0.034,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=48.960,P<0.001)。這提示siRIPK1-1組能夠顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖,且具有時(shí)間依賴(lài)性。見(jiàn)圖2。

    圖2 不同siRIPK1干擾后骨肉瘤細(xì)胞增殖活性變化

    2.3 不同siRIPK1干擾誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡以及壞死性凋亡情況siRIPK1干擾骨肉瘤細(xì)胞后,倒置相差顯微鏡光鏡結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,siRIPK1-1組骨肉瘤細(xì)胞明顯皺縮變形,死亡后漂浮細(xì)胞數(shù)量明顯增加;流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(1.44±0.13)%,細(xì)胞壞死率為(4.96±0.96)%;siRIPK1-1組細(xì)胞凋亡率為(17.52±7.68)%,細(xì)胞壞死率為(15.42±3.56)%;差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.629,P=0.022;t=4.914,P=0.008)。采用Western blot分析進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn):空白對(duì)照組凋亡標(biāo)志性分子Cleaved caspase-3相對(duì)表達(dá)水平為1.000±0.000,siRIPK1-1組為1.633±0.286,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.834,P=0.019),提示siRIPK1干擾后骨肉瘤細(xì)胞凋亡明顯增加,凋亡參與了骨肉瘤細(xì)胞死亡;空白對(duì)照組壞死性凋亡標(biāo)志性分子p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL相對(duì)表達(dá)水平均為1.000±0.000,而siRIPK1-1組分別為1.764±0.372、1.382±0.146、2.091±0.452,提示siRIPK1干擾后壞死性凋亡也參與了骨肉瘤細(xì)胞死亡。見(jiàn)圖3~5。

    圖3 光鏡觀察不同siRIPK1干擾后骨肉瘤細(xì)胞形態(tài)變化

    圖4 流式細(xì)胞儀器檢測(cè)不同siRIPK1干擾后骨肉瘤細(xì)胞凋亡及壞死情況

    3 討論

    RIPK1是RIPK家族的一員,對(duì)多種決定細(xì)胞命運(yùn)的信號(hào)通路發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,在細(xì)胞死亡和存活中都扮演著重要角色[4-5]。RIPK1一方面通過(guò)自身的分子支架功能促進(jìn)腺苷酸活化蛋白激酶通路的激活,發(fā)揮抑制細(xì)胞死亡的功能,另一方面其還可以通過(guò)激酶作用誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。研究[6]發(fā)現(xiàn),在結(jié)腸癌患者中RIPK1蛋白水平明顯上調(diào),并且和腫瘤的惡性程度具有非常好的相關(guān)性,RIPK1可能通過(guò)促進(jìn)線粒體的能量代謝促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。

    骨肉瘤多發(fā)于兒童以及青少年,主要惡性成骨細(xì)胞組成。自從新輔助化療方案引入骨肉瘤的治療方案以來(lái),骨肉瘤的治療效果有了顯著的提高,骨肉瘤患者的5 a生存率可達(dá)到70%。然而目前仍有相當(dāng)一部分患者在接受標(biāo)準(zhǔn)治療后,最終腫瘤還是出現(xiàn)進(jìn)展及惡化,導(dǎo)致骨肉瘤治療遭遇了一直無(wú)法突破的瓶頸[7-8]。究其根本原因,關(guān)鍵在于我們對(duì)骨肉瘤的生物學(xué)特征缺乏足夠的認(rèn)識(shí)。因此,探索對(duì)骨肉瘤生物活性具有重要調(diào)控作用的新靶點(diǎn)迫在眉睫。

    本研究結(jié)果顯示:我們應(yīng)用siRIPK1干擾降低RIPK1在骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平后,細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制;進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn),骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡以及壞死性凋亡標(biāo)志性分子Cleaved caspase-3、p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL等表達(dá)水平明顯升高。這提示RIPK1對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞增殖的維持發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

    總之,RIPK1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖等生物活性具有重要的調(diào)控作用,是骨肉瘤細(xì)胞維持自身生物活性的必要基因,其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。此外,RIPK1在肝癌、腎癌、肺癌的細(xì)胞系和(或)腫瘤組織中也存在,并促進(jìn)腫瘤骨轉(zhuǎn)移,這為我們后續(xù)研究提供了一定的借鑒意義[9-10]。

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