微小RNA-146b-5p對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

劉 洋,樊玉霞,劉 征,袁青嶺,盧秀波

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院甲狀腺外科，河南 鄭州 450052)

微小RNA(microRNA，miR)是一類(lèi)長(zhǎng)約22個(gè)寡核苷酸的非編碼小RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制參與靶基因的調(diào)控［1］。課題組前期研究［2］顯示在甲狀腺乳頭狀癌的miR差異表達(dá)譜中，miR-146b-5p的表達(dá)升高最為顯著，本研究旨在探討miR-146b-5p對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；DNA連接酶購(gòu)自日本Takara 公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司；PCR引物合成由華大基因完成；過(guò)表達(dá)miR-146b-5p的慢病毒質(zhì)粒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞凍存管放入37 ℃水浴鍋中融化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基，離心。加入1 mL培養(yǎng)基混勻后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶。對(duì)培養(yǎng)的TPC-1細(xì)胞進(jìn)行傳代。離心管中加入5滴細(xì)胞懸液，再加入5滴臺(tái)盼藍(lán)染液，混合均勻。吸出少量單細(xì)胞懸液滴到準(zhǔn)備好的計(jì)數(shù)板一側(cè)邊緣，把細(xì)胞計(jì)數(shù)板移顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3 構(gòu)建載體建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系檢測(cè)最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)：將病毒原液稀釋10倍、100倍，將3種不同濃度的病毒液置于3個(gè)孔內(nèi)，加入目的細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察3組細(xì)胞綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，簡(jiǎn)稱(chēng)GFP)的表達(dá)。利用流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率。確定最佳感染復(fù)數(shù)及感染條件。用過(guò)表達(dá)miR-146b-5p的慢病毒質(zhì)粒和包含空載體的慢病毒質(zhì)粒分別感染TPC-1細(xì)胞96 h，倒置相熒光顯微鏡下觀察2組細(xì)胞的GFP表達(dá)率。

1.4 PCR檢測(cè)目的基因提取總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作合成cDNA。合成引物序列hsa-miR-146b-5p：上游CAACCTTGAGAACTGAATTCCATA，下游AAAGGTTGATCTCGTCTCTCTGTC。U6引物：上游 ATTGGAACGATACAGAGAAGATT，下游 GGAACGCTTCACGAATTTG。RT-PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性溫度95 ℃、1 min，變性溫度95 ℃、15 s，60 ℃、20 s，72 ℃、45 s，共40個(gè)循環(huán)。導(dǎo)出Ct值，采用2-△△Ct表法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為3組：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-146b-5p的TPC-1細(xì)胞(轉(zhuǎn)染組)；轉(zhuǎn)染空載體的TPC-1細(xì)胞(空載組)；未經(jīng)轉(zhuǎn)染的TPC-1細(xì)胞(對(duì)照組)。取3個(gè)6孔培養(yǎng)板，用記號(hào)筆在其背側(cè)均勻劃?rùn)M線，橫穿過(guò)孔。用胰蛋白酶分別消化3組細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，在每個(gè)孔中加入5×105個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜。用槍頭在培養(yǎng)板上劃痕，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在0、48 h分別取樣照像。應(yīng)用軟件Image J分析寬度變化。劃痕愈合率=(劃痕0 h間距-劃痕48 h間距)/劃痕0 h間距×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)預(yù)冷后將Matrigel基膠稀釋?zhuān)尤氲絋ranswell小室的上室，室溫下水化，風(fēng)干。磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，加入胰酶消化，離心5 min,磷酸鹽緩沖液洗滌3次，吸管吹打。在計(jì)數(shù)板凹槽處加入細(xì)胞懸液顯微鏡10倍物鏡下，計(jì)數(shù)位于四角大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)左不計(jì)右計(jì)上不計(jì)下(若觀察到細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算)，細(xì)胞密度=細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)/毫升原液=(四大格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)/4)×104。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，小室的上室加入150 μg，下室加入600 μg，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。放入37 ℃恒溫孵育箱中。觀察Transwell小室細(xì)胞情況，培養(yǎng)24、48 h按照分組分別取出小室，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%結(jié)晶紫染色，400倍顯微鏡下隨機(jī)采取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)，取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體感染TPC-1細(xì)胞的最佳MOI細(xì)胞培養(yǎng)48 h，GFP表達(dá)強(qiáng)度隨著轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞MOI的增加而增強(qiáng)，當(dāng)MOI=1、10、100時(shí)，miR-146b-5p轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率分別為0.6%、13.1%、78.1%，且3組TPC-1細(xì)胞均未見(jiàn)大量異常死亡現(xiàn)象，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)最佳MOI為100。見(jiàn)圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)組TPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為0.863±0.022，空載組為0.840±0.017，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.779，P=0.438)。見(jiàn)圖2。

2.3 miRNA-146b-5p表達(dá)轉(zhuǎn)染組TPC-1細(xì)胞miR-146b-5p的表達(dá)水平為133.949±24.262，空載組為0.901±0.154，對(duì)照組為1.047±0.335，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=90.097，P<0.001)。轉(zhuǎn)染組明顯高于空載組和對(duì)照組(P均<0.05)。

2.4 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果劃痕實(shí)驗(yàn)48 h，轉(zhuǎn)染組劃痕愈合率為65.9%，空載組為29.3%對(duì)照組為30.2%，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=36.562，P<0.001)。轉(zhuǎn)染組與空載組和對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.962，P<0.001；χ2=27.449，P<0.001)。見(jiàn)圖3。

2.5 Transwell小室侵染實(shí)驗(yàn)結(jié)果Transwell小室侵染實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染組48 h后穿膜細(xì)胞數(shù)為149.667±2.517，空載組為37.667±5.131，對(duì)照組為32.667±1.528個(gè)，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 125.343，P<0.001)。轉(zhuǎn)染組與空載組和對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖1 不同MOI時(shí)TPC-1細(xì)胞GFP表達(dá)情況

圖2 轉(zhuǎn)染組和空載組TPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(×100)

A和B為轉(zhuǎn)染組，C和D為空載組，A和C為倒置熒光顯微鏡，B和D為普通光學(xué)顯微鏡

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌是近年來(lái)發(fā)病率增長(zhǎng)最快的腫瘤，在城市人群中發(fā)病率位居第4位。盡管其惡性程度較低，但在2014年國(guó)家癌癥中心的數(shù)據(jù)中，我國(guó)甲狀腺癌平均5 a生存率僅67.5%,局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響腫瘤患者預(yù)后的主要原因，因此對(duì)甲狀腺乳頭狀癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)［3-4］。

MiR在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用［5-6］。人類(lèi)的miR-146b-5p位于染色體10q24～26區(qū)段上，在正常的肺臟、脾臟和胸腺組織中均有表達(dá)，有關(guān)miR-146b-5p的報(bào)道較少，早期的研究多集中在同源的miR-146b上。MiR是通過(guò)序列定向的克隆技術(shù)結(jié)合生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的,是最早發(fā)現(xiàn)具有自主轉(zhuǎn)錄功能的小RNA，是炎癥信號(hào)通路中重要的節(jié)拍器，腫瘤發(fā)生的控制器。MiR在不同的腫瘤中起著不同的作用，在乳腺癌［7］、胰腺癌［8］、前列腺癌［9］、惡性黑色素瘤［10］等惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平下降，起著抑癌基因的作用；但在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤［11］、腎癌［12］中呈高表達(dá)，起著癌基因的作用。課題組前期研究［2］發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌20個(gè)差異性表達(dá)的miR中，miR-146b-5p的差異最為顯著，且與甲狀腺乳頭狀癌臨床分期呈正相關(guān)，因此推斷miR-146b-5p在甲狀腺乳頭狀癌中起著癌基因作用，且可以促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展。有研究［13］發(fā)現(xiàn)存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌中miR-146b-5p的表達(dá)明顯升高，這說(shuō)明了miR-146b-5p可能促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的轉(zhuǎn)移。另有研究［14］通過(guò)抑制TPC-1細(xì)胞中miR-146b-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TPC-1細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯降低。

圖3 轉(zhuǎn)染組(A)、空載組(B)、對(duì)照組(C)TCP-1細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果(×100)

圖4 轉(zhuǎn)染組(A)、空載組(B)、對(duì)照組(C)TCP-1細(xì)胞Transwell小室侵染實(shí)驗(yàn)48 h后結(jié)果(×100)

本研究利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)得到了miR-146b-5p穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TPC-1細(xì)胞，進(jìn)一步采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)分別觀察轉(zhuǎn)染組、空載組和對(duì)照組TPC-1細(xì)胞遷移數(shù)量和進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。這表明甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中miR-146b-5p的過(guò)表達(dá)可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)，從而引起腫瘤的局部侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。由此推測(cè)抑制miR-146b-5p的表達(dá)可以使甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱，從而降低腫瘤的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，miR-146b-5p的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的侵襲和遷移，這揭示了甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展的部分機(jī)制，miR-146b-5p有望成為甲狀腺乳頭狀癌基因治療的新靶點(diǎn)。