添加氯化鉀和蛋黃對(duì)虹鱒精液冷凍保存的效果

張俊杰 王彥博

摘 要：為篩選出更有效的虹鱒（Oncorhynchus mykiss）精液冷凍保存液，在以10%甲醇和0.3 M葡萄糖作為主要成分的基礎(chǔ)上，分別或同時(shí)添加0.9 g/L氯化鉀和10%蛋黃形成四種冷凍保存液，用于虹鱒精液冷凍保存試驗(yàn)，分別形成4個(gè)處理組：Ⅰ#（不添加氯化鉀和蛋黃）、Ⅱ#（添加氯化鉀）、Ⅲ#（添加蛋黃）和Ⅳ#（添加氯化鉀和蛋黃），比較不同處理組凍精精子激活比例、存活時(shí)間和精子活率。結(jié)果表明，Ⅰ#組的精子活率最高，達(dá)到24.59%，但與其它三組相比沒有顯著性差異;該組凍精的激活比例最高（24.00%±9.67%），顯著高于Ⅲ#和Ⅳ#組，但與Ⅱ#組無(wú)顯著性差異。Ⅳ#組凍精的精子平均存活時(shí)間最長(zhǎng)，達(dá)80.3 s。由此推測(cè)，添加氯化鉀或蛋黃都降低了虹鱒凍精的精子激活比例和精子活率，而添加氯化鉀可在一定程度上提高精子存活時(shí)間?？傊?，分別或同時(shí)添加氯化鉀和蛋黃可能會(huì)降低虹鱒精液冷凍保存效果，推薦使用不添加氯化鉀和蛋黃的Ⅰ#冷凍保存液用于虹鱒精液的冷凍保存。

關(guān)鍵詞：虹鱒（Oncorhynchus mykiss）;冷凍保存;精液;氯化鉀;蛋黃;激活比例

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）屬鮭形目（Salmoniformes），鮭科（Salmonidae），鮭屬（Salmo），原產(chǎn)于北美洲太平洋沿岸的淡水水域。虹鱒肉質(zhì)細(xì)嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，生長(zhǎng)迅速，是優(yōu)良的世界性冷水性養(yǎng)殖魚類，在流水養(yǎng)殖下產(chǎn)量很高，也是新疆目前養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量最高的冷水魚養(yǎng)殖品種。我國(guó)1959年從朝鮮引進(jìn)發(fā)眼卵進(jìn)行人工養(yǎng)殖，1982年引入新疆進(jìn)行人工養(yǎng)殖[1-2]。由于虹鱒在全世界的廣泛養(yǎng)殖，其育種和保種工作就顯得尤為重要，精液冷凍保存技術(shù)為虹鱒的育種繁殖和種質(zhì)保存工作帶來(lái)了很多益處。

魚類精液冷凍保存技術(shù)研究開始于1953年，Blaxter[3]用干冰（-79℃） 將大西洋鯡精巢保存6個(gè)月后解凍，獲得了80%的受精率。從1960年Terao開始冷凍虹鱒魚精液以后，虹鱒魚精液冷凍保存研究，包括冷凍保護(hù)液的配置、冷凍的方法等方面，已經(jīng)進(jìn)行了很多工作，并取得顯著的進(jìn)步，其中冷凍保護(hù)液配制已經(jīng)從復(fù)雜逐漸簡(jiǎn)化，抗凍劑也由原來(lái)以二甲亞砜為主，轉(zhuǎn)變成甲醇為主[4-6]。如Hisashi等[4]用由NaCl、KCl、鹽酸氨甲基丙二醇和血清白蛋白組成的，并用二甲亞砜（7.5%的終濃度）作為抗凍劑，其凍精可以獲得最高41%的受精率。而Lahnsteiner等[5]用由NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4和Hepes（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）組成的基礎(chǔ)稀釋液，用10%甲醇作為抗凍劑，獲得最高89.2%的受精率。Ciereszko等[6]用由0.18 M葡萄糖和9%甲醇組成的冷凍保護(hù)液，獲得的虹鱒魚凍精受精率大于80%。但是K+作為鮭科魚類重要的精子抑制劑[7]，蛋黃曾經(jīng)作為重要非滲透性抗凍劑[8]，它們對(duì)虹鱒精液冷凍保存效果的影響一直未見報(bào)道。

本研究在以10%甲醇和0.3 M葡萄糖作為主要成分的基礎(chǔ)上，分別或者同時(shí)添加氯化鉀和蛋黃形成四種冷凍保存液，研究了它們對(duì)虹鱒凍精精子激活比例、存活時(shí)間和精子活率的影響，進(jìn)而探討蛋黃和K+對(duì)虹鱒精液冷凍保存效果的影響，為虹鱒生產(chǎn)應(yīng)用和種質(zhì)保存服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 親魚的選擇 試驗(yàn)所用虹鱒親魚為北園春市場(chǎng)出售的人工養(yǎng)殖虹鱒，挑選身體健康且發(fā)育成熟的雄魚。

1.1.2 試驗(yàn)環(huán)境 試驗(yàn)場(chǎng)所選擇在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)冷水性魚類實(shí)驗(yàn)室，試驗(yàn)水溫為5 ℃，養(yǎng)殖場(chǎng)所光線比較暗，同時(shí)采取必要的避光措施，盡量避免光線對(duì)精子的殺傷，減少試驗(yàn)結(jié)果的誤差。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精液稀釋液的配制 參考Ciereszko[6]和Zhang等[9]的研究結(jié)果，以10%的甲醇（MeOH）作為冷凍保護(hù)劑，以0.3 M的葡萄糖作為基礎(chǔ)溶液的主要成分，再分別或者同時(shí)添加10%蛋黃、0.9 g/L的KCl，配制出四種不同的虹鱒精液冷凍保存液，分別用于虹鱒精液冷凍保存試驗(yàn)，形成4個(gè)不同的處理組（見表1）。

1.2.2 精液的采集 虹鱒精液采集的方法：采精前先把雄魚體表的水用干毛巾擦干，然后在精巢位置用手進(jìn)行擠壓，將精巢內(nèi)的精液擠入干燥小燒杯中，置于冰盒內(nèi)，避光儲(chǔ)存，整個(gè)過程要防止精液接觸水分。采精后在顯微鏡下進(jìn)行精子濃度和活力的檢查，將合格的精液混勻備用。

1.2.3 精液的冷凍保存 分別將四種已預(yù)冷的冷凍保存液與精液以3∶1的比例混合，并迅速分裝到0.25 mL的麥管中，每種冷凍保存液裝20～35支，用熨斗封口，形成4個(gè)處理組（Ⅰ#—Ⅳ#），隨后將麥管水平放置在距液氮表面2 cm處，經(jīng)過5 min的降溫后，迅速投入液氮中，然后裝入相應(yīng)的袋子中，保存在液氮罐內(nèi)。

1.2.4 伊紅染色檢測(cè)精子活率 精子活率的檢測(cè)參考周佳勃等[10]的方法進(jìn)行。用激活液（100 mM NaCl，pH=9）將凍精200倍稀釋混勻后，迅速取20 μL精子懸液與等量伊紅染液（0.5%）在載玻片上混勻并加蓋蓋玻片，1 min后在400倍顯微鏡下觀察并記錄一個(gè)視野內(nèi)的著色精子和未著色精子（一個(gè)樣品至少計(jì)數(shù)150個(gè)精子），并按以下公式計(jì)算相對(duì)精子活率：

精子活率（%）= 未著色精子數(shù)/精子總數(shù)×100。

1.2.5 檢測(cè)精子激活比例和存活時(shí)間 將裝有凍精的麥管從液氮罐里取出，迅速放入25 ℃水浴中進(jìn)行解凍，10 s后迅速取出，剪斷麥管取出中部的精液涂到載玻片上，用激活液激活，用顯微鏡錄像技術(shù)觀察并記錄精子激活比例（解凍的精子經(jīng)過激活后活動(dòng)的精子數(shù)占總精子數(shù)的比例）和精子存活時(shí)間（解凍的精子經(jīng)過激活后95%精子停止運(yùn)動(dòng)所經(jīng)歷的時(shí)間）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA分析法，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種冷凍保存液對(duì)虹鱒凍精精子活率的影響

四種冷凍保存液獲得的虹鱒凍精精子活率分別為24.59%、20.53%、20.18%、22.88%，其中以Ⅰ#冷凍保存液獲得的凍精的精子活率最高，但與其它三組都未達(dá)到顯著性差異水平，見表1。這一結(jié)果說明，在以10%甲醇和0.3 M葡萄糖為主要成分的基礎(chǔ)上，無(wú)論分別還是同時(shí)添加氯化鉀和蛋黃，都降低了虹鱒凍精的精子活率。

2.2 四種冷凍保存液對(duì)虹鱒凍精精子激活比例的影響

四種冷凍保存液獲得的虹鱒凍精精子激活比例整體上都不是很高，其中Ⅰ#冷凍保存液激活比例最高，為24.00%±9.67%，顯著高于Ⅲ#和Ⅳ#冷凍保存液，但與Ⅱ#冷凍保存液無(wú)顯著性差異。Ⅱ#、Ⅲ#和Ⅳ#冷凍保存液激活比例分別為20.88%±10.67%、6.88%±4.63%、10.00%±3.54%。Ⅱ#冷凍保存液顯著高于Ⅲ#冷凍保存液，與Ⅳ#冷凍保存液無(wú)顯著性差異，Ⅲ#與Ⅳ#冷凍保存液之間也無(wú)顯著性差異。見表1。從這些結(jié)果可以看出，在以10%甲醇和0.3 M葡萄糖為主要成分的基礎(chǔ)上，無(wú)論是添加氯化鉀，還是添加蛋黃，都降低了虹鱒凍精精子的激活比例，尤其是添加蛋黃的Ⅲ#和Ⅳ#冷凍保存液降低效應(yīng)尤為顯著。

2.3 四種冷凍保存液對(duì)虹鱒凍精精子存活時(shí)間的影響

四種冷凍保存液獲得的虹鱒凍精精子存活時(shí)間分別介于63～80.3 s之間，添加氯化鉀的Ⅱ#和Ⅳ#冷凍保存液分別提高了虹鱒凍精精子存活時(shí)間，其中以同時(shí)添加氯化鉀和蛋黃形成的Ⅳ#冷凍保存液最高，只添加了蛋黃的Ⅲ#冷凍保存液精子存活時(shí)間最低，但各組之間的差異都沒有達(dá)到顯著性水平。見表1。

3 討論

淡水魚精子產(chǎn)出前在精漿中保持靜止?fàn)顟B(tài)，K+是淡水魚類精漿的重要組成成分之一，也是構(gòu)成精漿滲透壓的主要物質(zhì)和淡水魚類精子激活的主要抑制因子[11]。在鮭魚中，細(xì)胞外K+濃度的降低觸發(fā)了鞭毛運(yùn)動(dòng)的啟動(dòng)[12]，所以在進(jìn)行鮭科魚類精液冷凍保存液的篩選時(shí)，K+是一個(gè)重要的考慮成分，但是很多研究并沒有得到確定積極的結(jié)果。Judycka等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在海藻糖作為主要成分的基礎(chǔ)上，添加40 mM KCl，可使虹鱒魚凍精獲得更高比例活細(xì)胞，延長(zhǎng)解凍后的儲(chǔ)存時(shí)間，但是對(duì)受精率沒有明顯影響。Judycka等[14]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在以0.18 M葡萄糖和9%甲醇為主要成分的冷凍保護(hù)液基礎(chǔ)上，添加K+對(duì)四種鮭魚凍精的精子活力有負(fù)面影響，并可通過提高冷凍保護(hù)液的滲透壓，降低這種負(fù)面影響，證明滲透壓而不是鉀離子，是鮭魚精子冷凍保存成功的最重要因素。本研究為防止精液在與精液冷凍保存液混合過程中被激活，在10%甲醇和0.3 M葡萄糖的基礎(chǔ)上添加0.9 g/L KCl，希望通過0.3 M葡萄糖提供足量滲透壓的同時(shí)，添加KCl進(jìn)一步抑制精子的激活。試驗(yàn)結(jié)果證明添加KCl降低了虹鱒凍精精子的激活比例和精子活率，但在一定程度上提高了精子存活時(shí)間。從這個(gè)結(jié)果可以看出，K+對(duì)凍精激活的抑制作用可能與其添加濃度過高有關(guān)，導(dǎo)致其稀釋激活時(shí)，K+可能仍然發(fā)揮著一定的抑制作用，這個(gè)情況有待進(jìn)一步研究探討。

在哺乳動(dòng)物精子冷凍保存研究中，卵黃可改善精子解凍后的運(yùn)動(dòng)能力，因?yàn)榈兔芏戎鞍捉M分（LDL）與細(xì)胞膜結(jié)合，并在冷凍保存過程中提供保護(hù)，防止損傷[15]。據(jù)報(bào)道，用卵黃覆蓋精子細(xì)胞膜，可以減少冷凍過程中細(xì)胞膜的溶解[16]。在許多低溫冷凍保存試驗(yàn)中，將蛋黃作為添加到精液稀釋液中的一個(gè)添加成分或者作為低溫保護(hù)劑加以研究，但Jodun等[8]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充蛋黃的有益效果似乎具有物種特異性和特定于冷凍保護(hù)液配方，在葡萄糖、KCl和甲醇組成的冷凍保護(hù)液中添加蛋黃可提高大西洋鮭凍精受精率，對(duì)精子提供額外保護(hù)，但在葡萄糖、KCl和二甲基亞砜組成的冷凍保護(hù)液中添加蛋黃則使凍精受精率下降。Lahnsteiner等[17]在由NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4和Hepes組成的基礎(chǔ)稀釋液和以二甲基亞砜、甘油、蔗糖和牛血清白蛋白作為抗凍劑的基礎(chǔ)上，添加蛋黃顯著提高了虹鱒凍精的激活比例。本研究為探討補(bǔ)充蛋黃對(duì)虹鱒凍精是否有益，在以10%甲醇和0.3 M葡萄糖為主要成分的基礎(chǔ)上，添加10%蛋黃卻降低了虹鱒凍精精子的激活比例和精子活率。這進(jìn)一步說明評(píng)估外部低溫保護(hù)劑時(shí)需要針對(duì)每一個(gè)物種，并要考慮特定的配方組合。

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Effect of potassium chloride and egg yolk on cryopreservation of rainbow trout semen

ZHANG Junjie，WANG Yanbo

（College of life sciences，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，830052，China）

Abstract：In order to screen out a more effective rainbow trout （Oncorhynchus mykiss） semen cryopreservation solution， on the basis of 10% methanol and 0.3 M glucose as the main components， 0.9 g/L potassium chloride and 10% egg yolk were added respectively or simultaneously to form four cryopreservation solutions for rainbow trout semen cryopreservation test. Four treatment groups were formed respectively： I #（no potassium chloride or egg yolk），II #（adding potassium chloride）， Ⅲ# （adding egg yolk） and Ⅳ# （adding potassium chloride and egg yolk）. The sperm activation ratio， survival time and sperm viability of rainbow trout frozen sperm among the groups were compared. The results showed that the sperm viability of frozen semen in group I# was the highest， which was 24.59%， however， no significant difference was found compared with those of the other three groups， and the activation ratio of frozen semen of this group was also the highest （24.00% ± 9.67%）， which was significantly higher than those of group Ⅲ# and Ⅳ#， but no significant difference with that of groupⅡ#.The average survival time of frozen sperm in group Ⅳ# was the longest， which was 80.3 s. Therefore， it is speculated that the addition of potassium chloride or egg yolk decreased the activation ratio and sperm viability of frozen semen of rainbow trout; the addition of potassium chloride improved the sperm survival time to a certain extent. In conclusion， the addition of potassium chloride and egg yolk respectively or in combination may reduce the cryopreservation effect of rainbow trout semen. I# cryopreservation solution without potassium chloride and egg yolk is recommended for the cryopreservation of rainbow trout semen.

Key words：Oncorhynchus mykiss; cryopreservation;semen;potassium chloride;egg yolk; activation ratio

（收稿日期：2021-09-04;修回日期：2021-11-09）