宮頸癌及癌前病變宮頸組織中miR-548b、CIP2A表達(dá)及與HPV感染關(guān)系

劉曉旭 蘇學(xué)艷 王素娟 梁建梅 王亞凡

1.河北省石家莊市婦幼保健院(050000)；2.河北省石家莊市行唐龍州醫(yī)院

宮頸癌(CC)在中國女性惡性腫瘤中發(fā)病率位居第二[1-2]。高危人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染宮頸后，可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及連續(xù)增殖，在CC中起作用[3-4]； HPV及細(xì)胞學(xué)檢測(cè)是臨床篩查CC的主要手段，但兩者易受其他因素影響，導(dǎo)致篩查特異性低，臨床應(yīng)用受限[5]。尋找與HPV感染、宮頸病變程度有關(guān)的指標(biāo)尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-548b(miR-548b)在肝細(xì)胞癌中呈低表達(dá)，在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌作用[6]；蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)在CC中表達(dá)水平較高，其參與并影響CC病理發(fā)展[7]。miR-548b-3p作為miR-548b的一員，可通過靶向調(diào)節(jié)CIP2A進(jìn)而調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展[8]。但miR-548b在CC及癌前病變中的表達(dá)水平及其與CIP2A、HPV感染的關(guān)系鮮有報(bào)道。因此，本研究分析CC及癌前病變組織中miR-548b、CIP2A表達(dá)水平及其與HPV感染的相關(guān)性，為臨床研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2018年12月—2020年11月本院診治的CC患者47例(CC組)，宮頸癌前病變患者61例(癌前病變組)，宮頸炎患者45例(宮頸炎組)臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①CC、癌前病變患者符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，經(jīng)宮頸活檢確診；②宮頸炎患者為單純的宮頸炎，無惡性病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往接受過宮頸手術(shù)治療、物理治療、放化療；②合并心、腎、肝等重要器官功能不全、其他惡性腫瘤?；颊呒捌浼覍俸炇鹬橥鈺?。研究方法獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

TRIzolTMLS Reagent、High Capacity RNA-to-cDNATMKit、TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqManTMUniversal PCR Master Mix均購買于Invitrogen，SYBR Green Realtime PCR Master Mix購買于TOYOBO，HPV DNA檢測(cè)試劑盒購買于廣州好芝生物科技有限公司。紫外分光光度計(jì)購買于Beckman，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀購買于ABI。

1.3 宮頸組織檢測(cè)

1.3.1miR-548b取部分宮頸活檢或手術(shù)切除的宮頸標(biāo)本，加液氮，研碎，應(yīng)用TRIzolTMLS Reagent提取總RNA，利用TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，使用TaqManTMUniversal PCR Master Mix制備反應(yīng)體系，于qRT-PCR儀上擴(kuò)增。miR-548b以U6為內(nèi)參，引物序列見表1。miR-548b相對(duì)表達(dá)量以2-△△CT法計(jì)算。

1.3.2CIP2A取部分宮頸活檢或手術(shù)切除的宮頸標(biāo)本，根據(jù)TRIzolTMLS Reagent說明書抽提組織標(biāo)本中的總RNA，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，隨后，用High Capacity RNA-to-cDNATMKit合成cDNA，最后，采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix配制反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)定。CIP2A以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。CIP2A相對(duì)表達(dá)量以2-△△CT法計(jì)算。

表1 基因引物序列

1.3.2HPV采用HPV DNA檢測(cè)試劑盒以聚合酶鏈反應(yīng)-反向點(diǎn)雜交法。取受試者適量宮頸上皮細(xì)胞標(biāo)本，加裂解液，提取DNA，PCR擴(kuò)增，加2×SSC，0.1%SDS和PCR產(chǎn)物雜交，洗膜顯色，判定HPV感染。質(zhì)控點(diǎn)IC點(diǎn)須呈現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

CC組年齡(58.5±10.0)歲(45～70歲)，體重(56.4±9.1)kg(45.1～68.8kg)；癌前病變組年齡(59.03±10.11)歲(45～70歲)，體重(56.9±9.5)kg(45.0～68.9kg)；宮頸炎組年齡(58.2±9.9)歲(45～70歲)，體重(56.6±9.4)kg(45.4～68.9kg)。3組年齡、體重?zé)o差異(P>0.05)，

2.2 各組宮頸組織miR-548b、CIP2A及HPV感染情況比較

宮頸炎組、癌前病變組、CC組宮頸組織miR-548b表達(dá)依次降低，CIP2A表達(dá)依次升高，HPV陽性感染率逐漸升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組宮頸組織中miR-548b、CIP2A水平及HPV感染情況比較

2.3 宮頸組織miR-548b、CIP2A表達(dá)與HPV感染相關(guān)性

以CC及宮頸癌前病變者宮頸組織miR-548b相對(duì)表達(dá)量平均值0.63為界限，分為<0.63為低表達(dá)(n=62)，≥0.63為高表達(dá)(n=46)。結(jié)果顯示，宮頸組織miR-548b表達(dá)水平與CC及宮頸癌前病變者HPV感染呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。以CC及宮頸癌前病變者宮頸組織CIP2A相對(duì)表達(dá)量平均值1.88為界限，<1.88為低表達(dá)者(n=44)，≥1.88為高表達(dá)者(n=64)。結(jié)果顯示，宮頸組織CIP2A表達(dá)水平與CC及宮頸癌前病變者HPV感染呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 宮頸組織檢測(cè)指標(biāo)表達(dá)與患者HPV感染相關(guān)性(例)

2.4 宮頸組織中miR-548b表達(dá)與CIP2A相關(guān)性

Pearson法分析顯示，宮頸炎、癌前病變、CC患者宮頸組織中miR-548b表達(dá)水平均與CIP2A呈負(fù)相關(guān)(r=-0.431、-0.467、-0.475，P<0.05)。

2.6 宮頸組織miR-548b、CIP2A表達(dá)診斷CC價(jià)值

ROC曲線顯示，宮頸組織miR-548b診斷CC的曲線下面積(AUC)為0.882(95%CI:0.829～0.935)，截?cái)嘀禐?.61，約登指數(shù)為0.620，其敏感度、特異性分別為89.4%、72.6%；宮頸組織CIP2A診斷CC的AUC為0.889(95%CI:0.832～0.947)，截?cái)嘀禐?.81，約登指數(shù)為0.677，其敏感度、特異性分別為89.4%、78.3%；二者聯(lián)合診斷CC的AUC為0.945(95%CI:0.909～0.981)，約登指數(shù)為0.797，其敏感度、特異性分別為87.2%、92.5%。

3 討論

目前，CC發(fā)病機(jī)制研究頗多，發(fā)病不僅與免疫功能異常、初產(chǎn)年齡小、炎癥反應(yīng)、多孕多產(chǎn)等有關(guān)，還與miRNA及癌基因表達(dá)失調(diào)、HPV感染等相關(guān)[10-11]。而HPV可通過黏膜侵入靶細(xì)胞，將DNA整合至宿主染色體上影響宮頸癌變，高危HPV是引發(fā)CC的危險(xiǎn)因素[12-13]。另外，CC是一個(gè)漸變過程，宮頸上皮內(nèi)瘤變是其癌前病變，病程較長[14]。因此，尋找與HPV感染、宮頸病變相關(guān)的指標(biāo)，對(duì)及早診治CC有積極意義。

miRNA可調(diào)控自噬、免疫炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、及細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等過程，與卵巢癌、乳腺癌、CC等關(guān)系密切[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-548b-3p在肺癌患者中表達(dá)水平降低，可能通過調(diào)節(jié)有關(guān)信號(hào)通路而影響癌細(xì)胞增殖、凋亡發(fā)揮抑癌作用，可能是治療肺癌的潛在靶標(biāo)[17]；miR-548b-3p在乳腺癌患者中表達(dá)水平較低，過表達(dá)可通過靶向調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移，有望成為診治乳腺癌的標(biāo)志物[18]。以上研究表明，miR-548b-3p可能在癌癥中發(fā)揮抑癌作用。本研究顯示，宮頸炎組、癌前病變組、CC組患者宮頸組織miR-548b表達(dá)水平逐漸降低，提示miR-548表達(dá)水平降低可能與CC及癌前病變有關(guān)，推測(cè)，miR-548b低表達(dá)可能影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使其對(duì)宮頸細(xì)胞異常增殖、遷移的作用減弱，從而影響宮頸癌前病變及CC的病理進(jìn)程，但具體機(jī)制有待結(jié)合基礎(chǔ)研究證實(shí)。本研究中宮頸組織miR-548b診斷CC的AUC為0.882，提示miR-548b對(duì)CC有一定診斷價(jià)值，有助于輔助診斷CC。

CIP2A可促進(jìn)細(xì)胞增殖，保證細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞衰老及蛋白磷酸酶2A活性，在腫瘤生長中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，CIP2A在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)水平升高，與患者總生存率降低有關(guān)[21]；在CC組織中高表達(dá)，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度相關(guān)，可能影響CC患者預(yù)后不良[22]。本研究中CIP2A表達(dá)水平隨宮頸病變程度增加而升高，提示CIP2A可能在宮頸癌前病變及CC中發(fā)揮關(guān)鍵作用。分析原因，高水平CIP2A可能促進(jìn)宮頸細(xì)胞異常增殖能力，抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)CC病變進(jìn)程，但仍需深入探討其作用機(jī)制。本研究中宮頸組織CIP2A診斷CC的AUC為0.889，提示CIP2A可作為輔助判定CC發(fā)生的指標(biāo)，有利于確定CC是否發(fā)生。

HPV感染是引發(fā)CC的重要因素，分析其與miR-548b、CIP2A的關(guān)系有助于更進(jìn)一步評(píng)價(jià)及宮頸癌前病變關(guān)系。Tian等[23]研究認(rèn)為， HPV16 E6可上調(diào)CIP2A表達(dá)，表明HPV16等病毒感染可能與CIP2A有關(guān)。本研究顯示，宮頸炎組、癌前病變組、CC組HPV陽性感染率呈升高趨勢(shì)，與何旻等[5]研究相符；且CC及宮頸癌前病變者HPV感染與宮頸組織miR-548b表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與CIP2A表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示宮頸病變?cè)絿?yán)重、HPV陽性感染率越高，與 miR-548b、CIP2A表達(dá)水平及宮頸病變進(jìn)展均有關(guān)。本研究中宮頸炎、癌前病變患者宮頸組織及CC患者癌組織中miR-548b表達(dá)水平均與CIP2A呈負(fù)相關(guān)，提示miR-548b可能與CIP2A共同影響宮頸病變過程，但機(jī)制有待深入探討；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，宮頸組織miR-548b、CIP2A聯(lián)合診斷CC的AUC及特異性均高于二者單項(xiàng)檢測(cè)，且敏感度達(dá)87.2%，提示兩者聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷CC效能，有較高的臨床參考價(jià)值。

綜上，CC及癌前病變患者宮頸組織miR-548b表達(dá)下調(diào)、CIP2A上調(diào)，兩者均與HPV感染相關(guān)，可能在CC及癌前病變發(fā)展中發(fā)揮重要作用；miR-548b、CIP2A聯(lián)合檢測(cè)可提高對(duì)CC有較好診斷價(jià)值。但本研究未對(duì)miR-548b、CIP2A在CC中的機(jī)制及CC及癌前病變患者中HPV感染類型的差異進(jìn)行深入探討，后續(xù)有待研究。