妊娠期糖尿病孕婦腸道菌群、炎癥因子及T細(xì)胞亞群分析

張中敏 王海艷 任春麗 劉艷芳

1.承德鋼鐵集團(tuán)有限公司職工醫(yī)院(067102)；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 ；3.河北省承德市婦幼保健院

妊娠期糖尿病(GDM)可導(dǎo)致母體和圍產(chǎn)兒并發(fā)癥，嚴(yán)重危害孕婦及新生兒健康和生命[1]。相關(guān)研究報道，妊娠期婦女的腸道細(xì)菌數(shù)量、組成成分及多樣性均改變顯著，超重孕婦由于腸道菌群分布不同可引起葡萄糖耐量受損形成GDM[2]；有研究指出，GDM孕婦存在機體免疫失衡，對血管和胰島β細(xì)胞功能造成損害[3]；而有學(xué)者認(rèn)為GDM發(fā)生時機體內(nèi)多種免疫細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子產(chǎn)生自身調(diào)節(jié)作用，T細(xì)胞通過產(chǎn)生白細(xì)胞介素2(IL-2)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等介導(dǎo)與局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答以輔助抗體生成，并抑制胰島β細(xì)胞正常功能，對母嬰安全造成影響[4]。故評價GDM孕婦腸道菌群、炎癥因子及T細(xì)胞亞群的水平有利于維護(hù)母嬰健康，但目前此類報道較少。本研究就此進(jìn)行分析，為臨床防治GDM提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，回顧性收集2016年1月—2018年1月本院產(chǎn)前檢查并分娩的孕婦臨床資料，孕婦均知情并簽署同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①GDM診斷符合相關(guān)指南[5]；②單胎妊娠；③年齡22～35歲；④無嚴(yán)重感染性疾病且凝血功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并甲狀腺疾病、高血糖危象及心、肝、肺等嚴(yán)重功能不全；②合并其他類型惡性疾?。虎墼星疤悄虿?；④合并艾滋病、乙型肝炎等傳染性疾病。根據(jù)孕26～28周OGTT試驗結(jié)果將健康孕婦132例作為對照組， GDM孕婦64例作為觀察組。

1.2 資料收集

自制問卷調(diào)查表(經(jīng)驗證K=0.669)和臨床病例，問卷調(diào)查剔除重復(fù)樣本和不合格問卷。收集研究對象年齡、身高、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、孕期增長體重、吸煙史、飲酒史、孕產(chǎn)史、月經(jīng)史、家族史、產(chǎn)檢史、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)；超聲檢查評估胎兒大小并核對孕周，獲取實驗室檢查結(jié)果和分娩情況。

1.3 腸道菌群檢測

收集孕婦糞便樣品常規(guī)處理后培養(yǎng)，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(邁瑞生物科技有限公司)行細(xì)菌總DNA提??；引物設(shè)計根據(jù)目標(biāo)細(xì)菌16SrRNA，序列見表1；實時熒光定量PCR反應(yīng)，產(chǎn)物特異性采用溶解曲線分析，每克糞便樣品待測細(xì)菌基因的拷貝數(shù)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線及Ct值，通過菌落形態(tài)、格蘭染色鏡檢、生化反應(yīng)等鑒定計數(shù)菌落作為定量結(jié)果，腸桿菌采用計算發(fā)酵乳糖、染色鏡檢為G-桿菌的所有菌落，腸球菌采用計數(shù)有明顯褐色圈、染色鏡檢為G-球菌的所有菌落；雙歧菌采用食品衛(wèi)生微生物檢驗雙歧菌檢驗，乳桿菌采用G+無芽胞桿菌、觸酶陰性、APICH50，擬,桿菌采用 G-無芽胞桿菌、API20A；梭桿菌采用G+芽胞桿菌。計數(shù)上述平板培養(yǎng)皿中菌落數(shù)作為定性結(jié)果，菌落數(shù)在培養(yǎng)液中未檢出為陰性，統(tǒng)計腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌及梭桿菌陽性數(shù)。

表1 引物序列

1.4 炎性因子檢測

取孕婦空腹靜脈血血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測IL-2、CRP、TNF-α，儀器為FAITH-1600全自動生化分析儀(杭州中翰盛泰醫(yī)療器械有限公司)，試劑盒購自邁瑞生物醫(yī)藥公司。采用CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特生物科技有限公司)檢測T細(xì)胞亞群，包括CD3+、CD4+、CD4+/CD8+，試劑盒由上海泰益醫(yī)療儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析。計量資料比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料比較采用卡方檢驗；分析發(fā)生GDM單因素，并對各檢測指標(biāo)行多元線性回歸，logistic回歸方程分析發(fā)病危險因素；采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析腸道菌群、炎性因子、T細(xì)胞亞群與GDM患者妊娠結(jié)局相關(guān)性。P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料特征

兩組吸煙史、飲酒史、家族史、年齡、身高、月經(jīng)周期、經(jīng)期、分娩孕周、SBP、DBP等無差異(P>0.05)；孕前體重、BMI、孕期增長體重、完整產(chǎn)檢、孕次、產(chǎn)次有差異(P<0.05)。見表2。

表2 兩組臨床資料比較

2.2 實驗室指標(biāo)分析

觀察組IL-2、CRP、TNF-α值及腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、梭桿菌數(shù)量大于對照組，而CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值及雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量小于對照組(均P<0.05)。見表3。

表3 兩組實驗室指標(biāo)比較

指 標(biāo) 觀察組(n=64)對照組(n=132)tPCRP(mg/L)6.88±1.064.19±0.9817.543<0.001TNFα(ng/L)6.03±1.174.11±1.0911.289<0.001CD3+(%)0.69±0.080.73±0.102.7950.006CD4+(%)0.40±0.110.47±0.133.710<0.001CD4+/CD8+1.07±0.331.32±0.344.873<0.001

2.3 發(fā)生GDM多因素logistic回歸分析

乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量、IL-2、CRP、TNF-α值、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+是妊娠期婦女發(fā)生GDM危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 發(fā)生妊娠期GDM多因素logistic回歸分析

2.4 妊娠結(jié)局

觀察組新生兒低血糖、巨大兒及剖宮產(chǎn)發(fā)生率高于對照組(P<0.05)，胎盤早剝、胎膜早破/早產(chǎn)發(fā)生率與對照組無差異(P>0.05)。見表5。

表5 兩組妊娠結(jié)局比較[例(%)]

2.5 GDM孕婦腸道菌群、炎性因子、T細(xì)胞亞群與妊娠結(jié)局相關(guān)性

GDM孕婦乳酸桿菌、雙歧桿菌、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+與剖宮產(chǎn)、巨大兒、新生兒低血糖呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，IL-2、CRP、TNF-α值與巨大兒、剖宮產(chǎn)呈正相關(guān)(P<0.05)，CD4+/CD8+與早產(chǎn)呈正相關(guān)(P<0.05)。見表6。

表6 GDM孕婦腸道菌群、炎性因子、T細(xì)胞亞群與妊娠結(jié)局相關(guān)性(r)

3 討論

目前GDM發(fā)病機制主要歸納為：由自身能量代謝及細(xì)菌感染、創(chuàng)傷及缺血缺氧等非感染因素引起全身炎癥介質(zhì)釋放，從而形成免疫機制受損反應(yīng)，引起全身代謝異常反應(yīng)綜合征。相關(guān)研究已證實機體炎性應(yīng)激反應(yīng)及免疫功能對GDM發(fā)生和發(fā)展有重要價值，Zhang等[6]指出，GDM發(fā)生后免疫功能下降而炎性因子大量釋放引起相關(guān)代謝失衡，進(jìn)一步加重病情。細(xì)胞免疫是清除細(xì)胞內(nèi)寄生微生物的最為有效防御反應(yīng)，也是參與分娩后創(chuàng)口修復(fù)愈合主要免疫系統(tǒng)，T淋巴細(xì)胞亞群作為免疫細(xì)胞中最重要的細(xì)胞群在人體中扮演著免疫監(jiān)視及免疫自穩(wěn)等重要角色[7]。研究認(rèn)為，CD8+可抑制B淋巴細(xì)胞功能，從而抑制抗體產(chǎn)生，CD4+/CD8+水平異常提示機體免疫功能受損[8]。Yu等[9]報道GDM患者體內(nèi)免疫功能下降。本文GDM孕婦CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值小于健康孕婦，提示GDM孕婦免疫機制下降；GDM孕婦炎性因子IL-2、CRP、TNF-α值顯著升高。Zhang等[10]研究證實免疫機制下降可損害孕婦胰島β細(xì)胞功能和葡萄糖調(diào)節(jié)，此時多種免疫細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子產(chǎn)生自身調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步引起IL-2、CRP、TNF-α水平上調(diào)。既往對炎性因子水平在GDM患者中的作用有多項報道：姜艷等[11]認(rèn)為GDM孕婦發(fā)生感染幾率增大，IL-2、CRP、TNF-α值顯著升高；吳一鳴[12]提出炎性因子參與GDM發(fā)生發(fā)展且發(fā)揮重要作用；Alajlan等[13]動物實驗結(jié)果顯示，炎癥反應(yīng)可提高早期胰島細(xì)胞周期異常調(diào)控和基因異常轉(zhuǎn)錄。本文多因素結(jié)果顯示炎CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IL-2、CRP、TNF-α值與妊娠結(jié)局具有相關(guān)性，進(jìn)一步驗證其在GDM發(fā)展中的關(guān)系。

腸道菌群通過在腸黏膜表面形成天然屏障來參與人體消化吸收、代謝等重要活動，且對免疫功能有一定調(diào)節(jié)促進(jìn)作用。根據(jù)既往報道，腸道微生態(tài)是控制體重和能量代謝重要環(huán)境因素之一，其與代謝性疾病如肥胖、2型糖尿病、GDM合并癥發(fā)生等密切相關(guān)[14-15]。Chong等[16]指出其還可調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防發(fā)生心血管疾病。相關(guān)研究報道，T2DM患者腸道菌群結(jié)構(gòu)明顯不同于健康個體，其大腸桿菌、擬桿菌屬等條件致病菌水平顯著上調(diào)，腸道內(nèi)厚壁菌門/均菌屬細(xì)菌顯著下調(diào)，雙歧桿菌含量大幅減少[17]。王武華等[18]給予小鼠喂養(yǎng)不同膳食，發(fā)現(xiàn)高脂膳食小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌水平顯著降低，其水平與空腹胰島素水平及宿主葡萄糖耐受呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究GDM孕婦腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、梭桿菌數(shù)量增多而雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量減少，而雙歧桿菌、乳桿菌為GDM發(fā)生獨立影響因素，考慮GDM發(fā)生后免疫機制和腸道活性菌數(shù)量下降，增加感染和疾病惡向發(fā)展機會。Ilario等[19]建立小鼠體外實驗發(fā)現(xiàn)，腸道相關(guān)菌群可刺激炎性因子發(fā)生不同程度的趨向性，提示腸道菌群與免疫機制相關(guān)性。GDM孕婦體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)、晚期糖基化代謝作用升高，受損的內(nèi)皮細(xì)胞可通過相關(guān)特異性通路激活炎性細(xì)胞，而高活性的雙歧桿菌和乳酸桿菌總數(shù)能夠調(diào)節(jié)炎癥因子，降低胰島素抵抗和血糖水平[20]。當(dāng)各種原因引起腸道微生態(tài)環(huán)境遭到破壞出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)時，可直接引起宿主循環(huán)系統(tǒng)中內(nèi)毒素增加，誘發(fā)機體高炎性應(yīng)激反應(yīng)和加重代謝性疾病病情。GDM患者代謝產(chǎn)物增加可改變腸道PH值和厭氧環(huán)境，厭氧菌雙歧桿菌、乳酸桿菌對腸道內(nèi)環(huán)境變化最為敏感呈大幅度減少，導(dǎo)致機體炎癥因子水平升高，導(dǎo)致疾病惡性循環(huán)。本文分析腸道菌群與妊娠結(jié)局相關(guān)性，發(fā)生乳酸桿菌、雙歧桿菌與剖宮產(chǎn)、巨大兒、新生兒低血糖呈負(fù)相關(guān)，提示乳酸桿菌、雙歧桿菌可負(fù)向調(diào)控妊娠結(jié)局。

綜上所述，GDM發(fā)生后，腸道益生菌群數(shù)量、免疫功能降低而炎性反應(yīng)增高，可增加不良妊娠結(jié)局發(fā)生率。對腸道菌群、炎性因子及T細(xì)胞亞群進(jìn)行干預(yù)對降低GDM發(fā)生與不良結(jié)局可能有重要價值。但由于本研究受時間限制，收集病例數(shù)量有限，故有待擴大樣本數(shù)作進(jìn)一步研究。