不同囊胚活檢方法用于植入前遺傳學(xué)檢測的臨床效果

宋 歌 米冬青 蔣 彥 田 耕 袁景川 耿彩平 苗穗兵 吳小華

河北省石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院(河北醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院)( 050011)

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測技術(shù)(PGT)是在體外受精-胚胎移植技術(shù)(IVF-ET)的基礎(chǔ)上，使用全染色體篩查技術(shù)，對(duì)體外受精胚胎進(jìn)行植入前檢測，以避免染色體不平衡胚胎植入宮腔。胚胎活檢可以獲取細(xì)胞進(jìn)而為PGT提供可檢測的遺傳物質(zhì)。隨著體外胚胎培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的生殖中心逐漸將胚胎培養(yǎng)至囊胚，囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢能夠得到更多的細(xì)胞用于PGT，顯著降低對(duì)胚胎的損傷、提高診斷的準(zhǔn)確性，已經(jīng)成為目前PGT的主要活檢方式[1-3]。囊胚活檢方法中目前使用較多的是在胚胎發(fā)育至第3天(D 3)打孔[4]，稱之為D3打孔活檢法。筆者探索開發(fā)了一種新的囊胚活檢方法，即D5打孔孵出/D6皺縮后活檢相結(jié)合的方法(簡稱新D5/D6活檢法)，本文回顧性分析D3打孔活檢法和新D5與D6活檢法的結(jié)局，探討新D5/D6活檢法的有效性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2019年1月—2020年6月在本中心接受PGT且符合納入標(biāo)準(zhǔn)的63例患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：女性年齡≤40歲，≥8個(gè)成熟卵母細(xì)胞，第3天優(yōu)質(zhì)胚胎≥3個(gè)[5]。此研究通過石家莊市第四醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者夫妻雙方在經(jīng)過充分的遺傳咨詢后，要求選擇并簽署PGT知情同意書。PGT周期按活檢方法分成兩組，其中D3打孔活檢組(37個(gè)周期)，新D5/D6活檢組(38個(gè)周期)。

1.2 胚胎培養(yǎng)

本研究中PGT周期的卵泡刺激方案不做限制，人絨毛膜促性腺激素(hCG)注射后36h取卵，取卵日全部采用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)受精，原核觀察時(shí)間在受精后16～18h，之后采用G系列序貫培養(yǎng)系統(tǒng)37℃三氣培養(yǎng)箱(5%CO2，5%O2和90%N2)中培養(yǎng)胚胎。第3天卵裂胚根據(jù)細(xì)胞個(gè)數(shù)、碎片大小和均一性對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)分[6]，兩種活檢方法均挑選2PN來源的≥4細(xì)胞且胚胎評(píng)分≥2級(jí)的卵裂胚[7]繼續(xù)培養(yǎng)；D5和D6囊胚質(zhì)量評(píng)估基于Gardner囊胚評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]，根據(jù)囊胚的擴(kuò)張程度和囊胚的大小評(píng)價(jià)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞質(zhì)量[9]。將D5或D6評(píng)分≥3期，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞評(píng)級(jí)中不同時(shí)含C級(jí)的囊胚定義為可利用囊胚[10]。囊胚擴(kuò)張程度≥3期且≥BB級(jí)的囊胚定義為優(yōu)質(zhì)囊胚[11]。為了減少誤差，兩名技術(shù)熟練的胚胎學(xué)家每周輪流進(jìn)行胚胎分級(jí)和滋養(yǎng)層活檢。

1.3 活檢樣本采集

1.3.1D3打孔活檢組在胚胎培養(yǎng)D3，對(duì)繼續(xù)培養(yǎng)的卵裂胚，選擇避開卵裂球位置(卵裂球與透明帶的間隙)進(jìn)行激光打孔(脈沖0.18 ms)，隨后更換新的序貫培養(yǎng)液(G2)入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至第5，6天，為了更好的進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢，通過觀察胚胎和囊胚評(píng)分(Gardner 評(píng)分法)[8]，對(duì)可利用囊胚活檢。

1.3.2新D5/D6活檢組D5早上觀察胚胎發(fā)育情況，對(duì)4期囊胚立即用激光(脈沖0.18 ms)在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的對(duì)側(cè)穿透性打孔，放入37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6h，觀察滋養(yǎng)層細(xì)胞孵出情況，大多數(shù)囊胚滋養(yǎng)外胚層會(huì)孵出。①對(duì)于滋養(yǎng)層部分孵出以后的囊胚直接吸取孵出的滋養(yǎng)層細(xì)胞部分，采用較小的激光(脈沖長度0.12 ms)對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞連接處單點(diǎn)激光上下位置打2下，同時(shí)活檢針適當(dāng)抽吸，邊抽吸邊牽拉，出現(xiàn)明顯斷裂點(diǎn)后，持卵針?biāo)砷_囊胚后與活檢針配合進(jìn)行機(jī)械切割，即可將一定數(shù)量的滋養(yǎng)層細(xì)胞切割下來。②對(duì)沒有孵出的囊胚，用激光(脈沖0.18 ms)對(duì)囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對(duì)側(cè)滋養(yǎng)層細(xì)胞間隙進(jìn)行穿透性打孔，待囊胚輕微皺縮后，活檢針直接從透明帶上所開的縫隙進(jìn)入胚胎內(nèi)部，吸取一定數(shù)量滋養(yǎng)層細(xì)胞(3～8個(gè))后，利用負(fù)壓將其沿原縫隙拽出，同時(shí)活檢針微微抖動(dòng)， 吸出比合適數(shù)量多一些的細(xì)胞后，再稍微吐出一些，出現(xiàn)一個(gè)較細(xì)的凹陷部位，用激光(脈沖0.12 ms)沿著此凹陷部位的細(xì)胞連接處單點(diǎn)切割滋養(yǎng)層細(xì)胞，同時(shí)活檢針適當(dāng)抽吸，邊抽吸邊牽拉，直至完全分離所需要的滋養(yǎng)層細(xì)胞。D6早上觀察胚胎發(fā)育情況，對(duì)于4期囊胚，遵循D6囊胚活檢一定要早的原則，采用不提前打孔皺縮后活檢的方法，同方法②。每枚囊胚活檢3～10個(gè)細(xì)胞(400×高倍鏡下計(jì)數(shù)有核細(xì)胞)，活檢后的囊胚逐一進(jìn)行玻璃化冷凍，于液氮罐中保存，在合適時(shí)機(jī)將檢測結(jié)果正常的囊胚進(jìn)行解凍并移植。

1.4 二代測序技術(shù)(NGS)及PGT結(jié)果的解讀

將活檢細(xì)胞經(jīng)清洗后裝入含有2μl單細(xì)胞裂解液的PCR管中，-20℃保存待用。單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增后，采用二代測序技術(shù)進(jìn)行PGT。PGT結(jié)果選擇染色體平衡、無單基因病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的胚胎記錄為檢測結(jié)果正常的囊胚，行單囊胚移植。

1.5 凍融胚胎移植(FET)內(nèi)膜準(zhǔn)備及黃體支持

囊胚移植的內(nèi)膜準(zhǔn)備分為自然周期(NC)和人工周期(HRT)[12]。NC適用于月經(jīng)周期規(guī)律的患者, 通過經(jīng)陰道超聲監(jiān)測, 優(yōu)勢卵泡直徑≥14 mm, 子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm, 排卵后第5日為解凍囊胚日。HRT 適用于月經(jīng)不規(guī)律、排卵障礙以及NC 內(nèi)膜或卵泡發(fā)育欠佳的患者, 以肌內(nèi)注射黃體酮為第0天,第5天進(jìn)行囊胚解凍復(fù)蘇移植。

1.6 觀察項(xiàng)目

通過D3優(yōu)胚率(D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù))，囊胚形成率(囊胚形成數(shù)/培養(yǎng)囊胚胚胎數(shù))，可用囊胚形成率(可利用囊胚數(shù)/形成囊胚數(shù))，臨床妊娠率(妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù))等進(jìn)行評(píng)估。單囊胚復(fù)蘇移植后第14天，檢測血清hCG≥ 30 U/L為生化妊娠。移植后 30 d B超示宮內(nèi)有胎囊和胎心搏動(dòng)判定為臨床妊娠。確定臨床妊娠后定期隨訪產(chǎn)前診斷(羊水穿刺等)至胎兒出生。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料

本研究納入63例共75個(gè)周期，包括染色體病63周期，單基因病6周期，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)6周期。兩組對(duì)象年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)水平、不孕年限、促性腺激素(Gn)總量均無差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般情況比較

2.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)

活檢囊胚數(shù)348枚，檢測成功339枚，活檢成功率97.4%，PGT檢測結(jié)果正常囊胚率41.9%(142/339)，正常囊胚檢出周期率76.0%(57/75)。兩組獲卵數(shù)、 MⅡ卵數(shù)、正常受精率、D3優(yōu)胚率、D3可用胚胎率、活檢成功率無差異(P>0.05)。新D5/D6活檢組囊胚形成率、可利用囊胚率、活檢D5囊胚率高于D3打孔活檢組，活檢滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)量低于D3打孔活檢組(均P<0.05)。見表2。

2.3 移植結(jié)局

因自然妊娠等原因有6例未行囊胚移植，共復(fù)蘇移植囊胚51周期，包括D3打孔活檢組20個(gè)周期，新D5/D6活檢組31個(gè)周期。二次移植6例，其中5例第1次移植未妊娠，1例第1次移植流產(chǎn)，二次移植均妊娠。周期妊娠率64.7%(33/51)，33個(gè)妊娠周期中，流產(chǎn)3例，胚胎停育2例，異位妊娠1例，目前共獲得19例健康新生兒，均無明顯出生缺陷發(fā)生，尚有8例妊娠中。兩組妊娠率、囊胚復(fù)蘇率無差異(P>0.05)。見表2。

表2 兩組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

指 標(biāo) D3打孔活檢組(n=37)新D5/D6活檢組(n=38)t/χ2PD3可用胚胎率(%)88.4(366/414)88.9(375/422)0.0430.835 囊胚形成率(%)64.8(237/366)72.0(270/375)4.500.034 可利用囊胚率(%)63.7(151/237)73.0(197/270)5.0170.025 活檢D5囊胚率(%)63.6(96/151)74.1(146/197)4.4790.034 活檢滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)量(個(gè),x±s)6.38±1.505.18±1.233.7820.001活檢成功率(%)96.7(146/151)98.0(193/197)0.5570.456PGT檢測正常囊胚率(%)43.2(63/146)40.9(79/193)0.1680.705囊胚復(fù)蘇率(%)95.0(19/20)100(31/31)1.5810.198周期妊娠率(%)60.0(12/20)67.7(21/31)0.3190.612

3 討論

囊胚活檢首選激光法破膜，因?yàn)榧す馄颇に俣瓤?，能有控制地打出?guī)范的小孔，它在技術(shù)上要求較低，需要較少的培訓(xùn)[13]。雖然D3打孔活檢法操作簡單、容易掌握，但該方法也有如下不足：①很多卵裂胚不一定形成囊胚，增加了無效工作量；②在D3打孔，孵出細(xì)胞存在較多不確定環(huán)節(jié)，如內(nèi)細(xì)胞團(tuán)處于活檢位置、囊胚過早孵出、孵出不充分，這樣就要重新二次打孔，操作難度加大，活檢操作時(shí)間不能確定等；③提前打孔導(dǎo)致形成較少數(shù)目的囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞、囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞大、囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞提前孵出的情況等[14]；④有文獻(xiàn)報(bào)道，D3打孔后可能影響胚胎發(fā)育潛能[15-17]。

目前關(guān)于囊胚活檢的操作步驟尚無共識(shí)，文獻(xiàn)中也缺少相應(yīng)的數(shù)據(jù)，有關(guān)囊胚活檢時(shí)機(jī)的選擇以及囊胚活檢的細(xì)節(jié)也鮮有提及。囊胚腔擴(kuò)張時(shí)間不固定，反復(fù)開箱觀察會(huì)影響胚胎的發(fā)育，胚胎學(xué)家甚至需要每天不定時(shí)觀察囊胚是否擴(kuò)張和孵出，這些都是亟待解決的問題[18]。為此探索D5打孔孵出聯(lián)合D6皺縮后活檢法(新D5/D6活檢法)，第5天(D5)囊胚的細(xì)胞間緊密聯(lián)系度較差，活檢切割的黏連度較高，這些決定了D5囊胚最好采用打孔后孵出再活檢的方法，在D5觀察到形成囊胚后，在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對(duì)側(cè)打孔，此時(shí)囊胚已經(jīng)發(fā)育成熟，囊胚腔已經(jīng)完全擴(kuò)張，透明帶變薄，打孔皺縮后囊胚會(huì)以一個(gè)比較穩(wěn)定的速度擴(kuò)張，并在打孔處使一定的細(xì)胞孵出，對(duì)孵出的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行活檢切割，操作更加便利，能夠提高活檢效率。相反，D6囊胚細(xì)胞間緊密聯(lián)系度增加，較易切割，可以采用不提前打孔的方法，直接皺縮活檢，不用等到D6下午，減少體外培養(yǎng)時(shí)間，減少激光切割的創(chuàng)面，減小受影響細(xì)胞的比例。

本研究結(jié)果顯示，新D5/D6活檢組的囊胚形成率、可利用囊胚率和活檢D5囊胚率高于D3打孔活檢組，說明D3打孔活檢法與D5打孔孵出/D6皺縮活檢法相比可降低囊胚的發(fā)育潛能。Zhao[7]的研究也證明新的囊胚活檢方法能夠獲得更多的囊胚用于滋養(yǎng)外胚層活檢，這與本研究結(jié)果一致，但其對(duì)于新活檢方法的介紹較含糊，也沒有提及不同發(fā)育速度囊胚的細(xì)胞間緊密度和活檢切割的黏連度等方面，不能給胚胎實(shí)驗(yàn)室操作人員提供明確的參考。

筆者的新D5/D6活檢法D5在囊胚上只打1個(gè)孔，減少囊胚在冷凍過程中的損傷，減少孵出嵌頓導(dǎo)致胚胎著床失敗。而且筆者在實(shí)際操作中，采用新D5/D6活檢法，每天只要觀察一次胚胎就能確定囊胚是否當(dāng)天需要活檢，使活檢操作人員對(duì)活檢時(shí)機(jī)把握得更加明確，大大降低了對(duì)囊胚發(fā)育的干預(yù)頻率，對(duì)于不同發(fā)育速度的囊胚，采用個(gè)性化活檢方案，更加符合胚胎的自然發(fā)育規(guī)律。

與D3打孔活檢組相比，新D5/D6活檢組的臨床妊娠率、囊胚復(fù)蘇率無顯著性差異，有待加大樣本量來進(jìn)一步研究。有學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)活檢滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的數(shù)量可能影響妊娠結(jié)局，隨著活檢滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)量的增加，其植入率會(huì)降低[19]。本研究中，D3打孔活檢組與新D5/D6活檢組相比， 活檢滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)量明顯增高，可能與活檢方法本身導(dǎo)致的囊胚過早孵出、孵出細(xì)胞較多有關(guān)。

總之，使用新的囊胚活檢方法可使囊胚活檢變得更加簡單，使活檢操作人員對(duì)活檢時(shí)機(jī)把握得更加明確，與經(jīng)典的D3打孔活檢法相比是有效的。