4,4’-二氨基二苯基甲烷對(duì)浮萍(Lemna minor L.)毒性作用

柳燕貞，羅鳳娟，梁燕珍，梅承芳，曾國驅(qū),*

1. 廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測(cè)中心，廣州 510070 2. 華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070 3. 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070 4. 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070

4,4’-二氨基二苯基甲烷(4,4’-methylenedianiline, MDA；CAS-No. 101-77-9)是一種重要的化工中間體，是合成聚氨基甲酸酯、二異氰酸酯和還氧樹脂硬化劑等的重要原料。近年來，MDA的使用范圍正在擴(kuò)大，年產(chǎn)量逐年增加，達(dá)400萬t·a-1[1]。MDA是歐盟REACH法規(guī)中的高關(guān)注物質(zhì)之一，其對(duì)生態(tài)環(huán)境及人類健康的潛在危害越來越受到重視[2-4]。當(dāng)釋放到環(huán)境中時(shí)，MDA首先分配到水體中，使地表水受到污染，隨后再分配到沉積物和土壤隔室中。我們的前期實(shí)驗(yàn)和他人的研究結(jié)果表明，MDA并不具有生物蓄積性，但土壤孔隙中的MDA能夠迅速吸附在植物根部表面，從而對(duì)水生生物產(chǎn)生毒害作用[5-6]。

浮萍(LemnaminorL.)屬于浮萍科，廣泛分布于各種水體中，能夠靈敏地反映水體污染狀況。利用浮萍的生物學(xué)特性將其應(yīng)用于生態(tài)環(huán)境修復(fù)，取得了顯著的成果[7-9]。然而有關(guān)MDA對(duì)浮萍的毒性作用尚未見報(bào)道。本研究以浮萍(LemnaminorL.)作為受試生物，通過檢測(cè)不同濃度的MDA對(duì)浮萍生長、葉綠素含量、光合活性、質(zhì)膜透性和抗氧化酶活性等的影響，初步探討MDA對(duì)浮萍的毒性作用，以期為MDA的水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國)，電子天平(XS205DU型，梅特勒-托利多公司，瑞士)，紫外可見分光光度計(jì)(T6型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，中國)，多用途臺(tái)式高速離心機(jī)(Primo R，Thermo Fisher Scientific，美國)，人工氣候箱(PQX-450B-22H，寧波萊?？萍加邢薰?，中國)，手提式pH測(cè)試儀(pH 3210，WTW公司，德國)，溫濕度記錄儀(DSR系列，杭州佐格通訊設(shè)備有限公司，中國)，植物效率分析儀(Handy PEA，Hansatech Instrument Ltd.，英國)，便攜式多量程電導(dǎo)儀(HI 8733，HACH公司，美國)。

試劑：4,4’-二氨基二苯基甲烷為分析純，購自美國Sigma公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自中國廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 受試生物

本次試驗(yàn)選擇浮萍(LemnaminorL.)為受試生物。試驗(yàn)植株從廣州珠江獲得，采集自野外，采集地?zé)o明顯污染。試驗(yàn)開始前植株已在試驗(yàn)用培養(yǎng)基中培養(yǎng)8周以上。試驗(yàn)開始前7 d，從貯備培養(yǎng)的浮萍中選擇足量的浮萍轉(zhuǎn)入新鮮無菌Swedish Standard (SIS)培養(yǎng)基中，并在試驗(yàn)條件下培養(yǎng)7 d。

1.3 MDA對(duì)浮萍生長的影響

本試驗(yàn)按照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則中的浮萍急性毒性試驗(yàn)方法(OECD 221)進(jìn)行[10]。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)置6個(gè)MDA濃度梯度，各試驗(yàn)濃度間隔系數(shù)為3.0，即0(空白對(duì)照)、0.6、1.8、5.4、16.2和48.6 mg·L-1。根據(jù)MDA在試驗(yàn)體系中的穩(wěn)定性，選擇了半靜態(tài)的試驗(yàn)方式，每48 h更換一次MDA試驗(yàn)溶液，分別在0、48、96、144和168 h時(shí)測(cè)定新舊溶液的MDA濃度。取擴(kuò)大培養(yǎng)后葉片完好、大小相近的3株3葉浮萍，采用滅菌SIS培養(yǎng)基對(duì)浮萍漂洗3遍，隨機(jī)放入裝有滅菌SIS培養(yǎng)基的200 mL培養(yǎng)瓶中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將所有培養(yǎng)瓶置于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(24±2) ℃，連續(xù)供光(光照度在85～135 μE·m-2·s-1)。試驗(yàn)期間，每天隨機(jī)調(diào)整試驗(yàn)瓶的擺放位置，以減少由于光照不同導(dǎo)致的植物生長差異。

1.4 浮萍生長參數(shù)及各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)期間MDA濃度采用Agilent 1260高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定(色譜柱：BDS HYPERSIL C18，100 mm×2.1 mm，2.4 μm)，柱溫40 ℃；流動(dòng)相10 mmol·L-1磷酸二氫鈉-乙腈(V∶V=55∶45)，流速0.5 mL·min-1；進(jìn)樣量2.0 μL；檢測(cè)器DAD；檢測(cè)波長210 nm)。浮萍的生長參數(shù)包括浮萍的形態(tài)變化、葉狀體數(shù)量、相對(duì)生長率、干質(zhì)量和葉面積的測(cè)定。各項(xiàng)生理指標(biāo)包括葉綠素含量、光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大光化學(xué)效應(yīng)(Fv/Fm)、質(zhì)膜透性、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定。浮萍干質(zhì)量采用60 ℃烘干恒重法(前后2次質(zhì)量相差≤0.4 mg)進(jìn)行測(cè)定。浮萍葉面積采用軟件Image J將影像數(shù)字化以得到浮萍的葉面積。

1.5 葉綠素含量的測(cè)定

葉綠素含量的測(cè)定采用丙酮提取法[11]。

1.6 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

將浮萍進(jìn)行暗適應(yīng)30 min，采用植物效率分析儀測(cè)定熒光參數(shù)。打開調(diào)制測(cè)量光，測(cè)定最小熒光(F0)，然后打開飽和脈沖，測(cè)定最大熒光(Fm)，根據(jù)公式Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm計(jì)算PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)。

1.7 質(zhì)膜透性測(cè)定

采用電導(dǎo)率法測(cè)定浮萍質(zhì)膜透性[12]。

1.8 SOD、CAT和POD活性測(cè)定方法

SOD活性的測(cè)定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)法[13]，POD活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[13]，CAT活性的測(cè)定采用紫外吸收法[14]。

1.9 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用軟件GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析(ANPVA)方法進(jìn)行各試驗(yàn)組與對(duì)照組的顯著性差異檢驗(yàn)。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 MDA對(duì)浮萍生長的影響

MDA對(duì)浮萍的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，MDA對(duì)浮萍葉片數(shù)、葉片生長率、葉片干質(zhì)量和葉面積均有顯著的抑制作用，且抑制程度與MDA的濃度呈正相關(guān)。MDA對(duì)浮萍葉片生長抑制的7 d半數(shù)效應(yīng)濃度(7 d-EC50)為26.7 mg·L-1，其95%置信限為22.3～32.1 mg·L-1，基于葉片產(chǎn)量抑制的7 d-EC50為0.62 mg·L-1，其95%置信限為0.53～0.74 mg·L-1?；诳?cè)~面積及干質(zhì)量產(chǎn)量抑制的7 d-EC50均<0.6 mg·L-1。

2.2 MDA對(duì)浮萍葉綠素含量及光合活性的影響

植物葉片光合作用產(chǎn)物的積累很大程度上依賴葉綠素的含量。不同濃度MDA處理7 d后，發(fā)現(xiàn)浮萍葉綠素含量變化趨勢(shì)與浮萍葉片干質(zhì)量的趨勢(shì)一致，隨著MDA濃度的增加，浮萍總?cè)~綠素含量逐漸下降(圖2)。葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)是一種靈敏的探針，可用于檢測(cè)逆境脅迫對(duì)植物的危害程度[15]。PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)是葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)中重要且敏感的熒光參數(shù)[16]。采用便捷的植物效率分析儀檢測(cè)MDA處理對(duì)浮萍Fv/Fm的影響。結(jié)果如圖3所示，隨著MDA濃度的增加，F(xiàn)v/Fm逐漸降低。0.6、1.8、5.4、16.2和48.6 mg·L-1MDA處理的浮萍葉片F(xiàn)v/Fm值分別是對(duì)照組的95.8%、93.5%、87.2%、81.9%和75.2%。

2.3 MDA對(duì)浮萍質(zhì)膜透性的影響

采用不同濃度的MDA處理浮萍7 d，發(fā)現(xiàn)MDA能夠增加浮萍質(zhì)膜透性，0.6、1.8、5.4、16.2和48.6 mg·L-1MDA處理的質(zhì)膜透性分別是對(duì)照組的1.26倍、1.44倍、1.79倍、2.19倍和2.82倍(圖4(a))，說明MDA對(duì)浮萍質(zhì)膜具有明顯的慢性毒性作用。為進(jìn)一步研究MDA是否對(duì)浮萍質(zhì)膜具有直接毒性作用，將健康植物分別移入含有0.6、1.8、5.4、16.2和48.6 mg·L-1MDA的培養(yǎng)基中，并抽真空10 min以使MDA滲透到植物中，蒸餾水沖洗后，立即用電導(dǎo)儀測(cè)定整個(gè)植物的質(zhì)膜滲透率。結(jié)果表明，直接毒性實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的質(zhì)膜透性與慢性毒性實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果相似(圖4(b))，這表明MDA可以直接損傷細(xì)胞膜。

2.4 MDA對(duì)浮萍抗氧化酶活性的影響

MDA對(duì)浮萍SOD活性的影響如圖5(a)所示，低濃度MDA處理7 d，浮萍的SOD活性無明顯變化。當(dāng)MDA濃度達(dá)到5.4 mg·L-1時(shí)，浮萍SOD活性顯著增加。MDA對(duì)浮萍POD活性的影響如圖5(b)所示，MDA濃度依賴地促進(jìn)浮萍POD的活性。然而，當(dāng)MDA濃度達(dá)到48.6 mg·L-1時(shí)，POD的活性顯著降低。MDA對(duì)浮萍CAT活性的影響如圖5(c)所示，低濃度MDA(0.6 mg·L-1)處理，浮萍的CAT活性無明顯變化，隨著濃度的增加，浮萍CAT活性逐漸上升，當(dāng)MDA濃度達(dá)到16.2 mg·L-1時(shí)，浮萍CAT活性達(dá)到最高。

圖1 4,4’-二氨基二苯基甲烷(MDA)對(duì)浮萍生長的影響注：(a)MDA對(duì)浮萍葉片數(shù)的抑制作用；(b)MDA對(duì)浮萍葉片生長率的抑制作用；(c)MDA對(duì)浮萍葉片干質(zhì)量 的抑制作用；(d)MDA對(duì)浮萍葉面積的抑制作用(*P<0.05)。Fig. 1 The effects of 4,4’-methylenedianiline (MDA) on growth of L. minorNote:(a) Inhibitory effect of MDA on leaf number; (b) Inhibitory effect of MDA on leaf growth rate; (c) Inhibitory effect of MDA on leaf dry weigh; (d) Inhibitory effect of MDA on leaf area (*P<0.05).

圖2 MDA對(duì)浮萍葉綠素含量的影響(* P<0.05)Fig. 2 The effects of MDA on chlorophyll contents of L. minor (*P<0.05)

圖3 MDA對(duì)浮萍PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm) 的影響(*P<0.05)Fig. 3 The effects of MDA on the maximal photochemical efficiency of PSⅡ (Fv/Fm) of L. minor (*P<0.05)

3 討論(Discussion)

生長抑制是有害物質(zhì)檢測(cè)的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，雖然由MDA導(dǎo)致的浮萍死亡率不是很明顯，但是它對(duì)浮萍的葉狀體數(shù)量、葉片數(shù)生長率、葉片干質(zhì)量和葉面積都有顯著的抑制，說明MDA對(duì)浮萍生長具有顯著性的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量高低能夠反映植物光合作用水平，體現(xiàn)了植株的生長勢(shì)和抗逆性。葉綠素含量低，光合作用受到抑制使得植物不能正常新陳代謝，進(jìn)而導(dǎo)致植物鮮重降低[17]。我們發(fā)現(xiàn)隨著MDA處理濃度的升高，浮萍總?cè)~綠素含量逐漸下降，結(jié)果與浮萍葉片干質(zhì)量的變化趨勢(shì)一致。Fv/Fm是葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)中重要且敏感的熒光參數(shù)，可較準(zhǔn)確反映植物光合機(jī)構(gòu)的狀態(tài)，常用于評(píng)估光化學(xué)反應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)[16]。我們發(fā)現(xiàn)隨MDA處理濃度的升高，F(xiàn)v/Fm逐漸降低，進(jìn)一步證實(shí)MDA脅迫能夠抑制浮萍光合活性。

植物體細(xì)胞在正常代謝過程中會(huì)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，ROS會(huì)對(duì)植物細(xì)胞的脂類、蛋白質(zhì)和DNA等產(chǎn)生氧化損傷。植物細(xì)胞內(nèi)存在相應(yīng)的抗氧化酶系統(tǒng)，如SOD、POD和CAT等能有效地清除ROS，從而維持ROS動(dòng)態(tài)平衡[18]。研究表明，植物的逆境條件會(huì)加劇ROS的產(chǎn)生和積累，當(dāng)環(huán)境脅迫引起的ROS增加超出ROS清除系統(tǒng)的能力時(shí)，動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)被打破，引起膜脂質(zhì)過氧化使得植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，從而抑制植物生長[19-20]。我們發(fā)現(xiàn)低濃度MDA脅迫下，浮萍SOD、POD和CAT酶活性與對(duì)照組相近，說明此處理濃度所造成的脅迫尚未超出浮萍細(xì)胞內(nèi)正常的ROS條件范圍。但是低濃度MDA脅迫依然能夠抑制浮萍葉綠素合成及光合活性，提示MDA可能通過其他的方式對(duì)浮萍產(chǎn)生毒性作用。通過測(cè)定浮萍質(zhì)膜透性，我們發(fā)現(xiàn)MDA對(duì)浮萍質(zhì)膜具有直接毒性作用，導(dǎo)致質(zhì)膜透性增加，這可能是低濃度MDA處理導(dǎo)致光合活性降低的主要原因之一。與我們的研究結(jié)果相似，Kreslavski等[21]研究發(fā)現(xiàn)，多環(huán)芳烴(PAHs)對(duì)植物的毒性也與其對(duì)脂質(zhì)雙層膜的破壞有關(guān)。隨著MDA濃度的進(jìn)一步升高，浮萍SOD、CAT和POD酶活性增加，說明MDA處理導(dǎo)致浮萍氧化應(yīng)激反應(yīng)，以避免ROS對(duì)細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。當(dāng)MDA濃度的達(dá)到48.6 mg·L-1時(shí)，POD活性顯著降低，POD活性降低通常是植物受到嚴(yán)重氧化損傷的標(biāo)志，說明此MDA濃度對(duì)浮萍產(chǎn)生了不可修復(fù)的傷害。綜上所述，我們認(rèn)為MDA能夠直接損傷質(zhì)膜，干擾葉綠體功能并抑制光合活性，而氧化損傷是質(zhì)膜損傷引起的繼發(fā)性應(yīng)激，繼而引起膜脂質(zhì)過氧化加劇，質(zhì)膜損傷，從而進(jìn)一步抑制浮萍的生長。

圖4 MDA對(duì)浮萍質(zhì)膜透性的影響注：(a)慢性影響；(b)直接影響；*P<0.05。Fig. 4 The effects of MDA on plasma membrane permeability of L. minorNote: (a) chronic effect; (b) direct effect; *P<0.05.

圖5 MDA對(duì)浮萍抗氧化酶活性的影響注：(a)MDA對(duì)浮萍超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的影響；(b)MDA對(duì)浮萍過氧化物酶(POD)酶活性的影響； (c)MDA對(duì)浮萍過氧化氫酶(CAT)酶活性的影響；*P<0.05。Fig. 5 The effects of MDA on antioxidant enzyme activity of L. minorNote: (a) The effects of MDA on superoxide dismutase (SOD) activity; (b) The effects of MDA on peroxidase (POD) activity; (c) The effects of MDA on catalase (CAT) activity; *P<0.05.