FA160 全自動(dòng)糞便分析儀隱血質(zhì)控品制備及評(píng)價(jià)

陳思 祁媚姣 王昱斌 馬寶良

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030

糞便隱血試驗(yàn)（facal occult blood test，F(xiàn)OBT）現(xiàn)常作為消化道出血和消化道惡性腫瘤早期的篩選指標(biāo)。目前糞便隱血試劑廠家眾多而無單一室內(nèi)質(zhì)控品供應(yīng)，隨著自動(dòng)化和圖像智能識(shí)別技術(shù)的提高，全自動(dòng)糞便分析儀廣泛應(yīng)用于臨床工作［1］。不同的儀器，其檢測(cè)性能存在一定差異［2］。本研究用EDTA 抗凝靜脈血充分混勻后，取全血用雙蒸水溶血配制成100mg/L 的血紅蛋白母液，用于糞便隱血實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控，結(jié)果可滿足糞便隱血試驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控要求。

1 材料與方法

1.1 試劑便隱血（FOB）檢測(cè)試劑盒（膠體金法），四川沃文特生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：2010280）。

1.2 儀器FA160 全自動(dòng)糞便分析處理系統(tǒng)，四川沃文特生物技術(shù)有限公司。

1.3 樣本選取乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病抗體皆陰性且血紅蛋白在100g/L 的新鮮血細(xì)胞分析標(biāo)本1 份，用于配制系列人血紅蛋白溶液。

1.4 方法依據(jù)檢測(cè)試劑盒說明書提供的檢測(cè)卡線性范圍0.20～2000μg/mL，以Hb 濃度100g/L 為原液，蒸餾水為溶劑稀釋配制：3000、2500、2000、1000、500、100、2.0、1.0、0.50、0.20、0.10μg/mL 濃度梯度的血紅蛋白液，用于FOB 檢測(cè)及質(zhì)控品濃度的定值。配制方法見表1。

表1 血紅蛋白液的配制

手工法：取出檢測(cè)卡，置于水平干燥的操作臺(tái)面上，在檢測(cè)卡的加樣孔內(nèi)加入上述系列人血紅蛋白液100μL，室溫孵育4～10 分鐘，測(cè)試結(jié)果在10 分鐘內(nèi)讀取，結(jié)果判斷嚴(yán)格按照操作說明書。分析儀法：裝載檢測(cè)卡與儀器卡槽指定位置，吸取上述系列血紅蛋白液2mL 加入樣本采集管內(nèi)，放置于采集管架上，儀器自動(dòng)對(duì)樣本采集管進(jìn)行進(jìn)樣、混勻、加樣、反應(yīng)結(jié)果圖像采集和輔助判斷，操作人員可根據(jù)采集圖像進(jìn)行結(jié)果的判讀。

1.4.1 確定質(zhì)控品濃度。兩種方法對(duì)上述系列血紅蛋白液，每個(gè)濃度進(jìn)行3 次檢測(cè)，分析比對(duì)各濃度的檢測(cè)結(jié)果，確定隱血陽性質(zhì)控品的濃度。

1.4.2 室內(nèi)質(zhì)控試驗(yàn)。將濃度為2μg/mL 的血紅蛋白溶液用5mL 的采血管各分裝16 支，每管2mL，一半置-20℃冰箱保存，一半置室溫試劑臺(tái)固定位置保存。每間隔4 天各開啟一支，混勻后，直接上機(jī)檢測(cè)，進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控試驗(yàn)并記錄其各自的穩(wěn)定性。

1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)。將100μg/mL（100mg/L）的血紅蛋白母液用1.5mL 微量離心管各分裝12 支，每管1.0mL。保存于-20℃冰箱，每月取一支自然解凍后混勻，用蒸餾水稀釋為2μg/mL 血紅蛋白液50mL，按2mL 每管分裝保存于4℃冰箱，作為室內(nèi)質(zhì)控品，進(jìn)行測(cè)試并記錄結(jié)果，觀測(cè)解凍后的母液穩(wěn)定性。

1.4.4 空白試驗(yàn)。分別用蒸餾水和分析系統(tǒng)配套的樣本稀釋液作為空白試驗(yàn)樣本，用手工方法和分析儀法進(jìn)行FOB 測(cè)試，分別每次取樣100μL，各連續(xù)檢測(cè)5 次。

1.4.5 準(zhǔn)確性試驗(yàn)。選取顯微鏡檢測(cè)RBC 5-10/HP 的FOB 陽性樣本5 份和2μg/mL 的血紅蛋白溶液質(zhì)控品5 份，用分析儀法連續(xù)測(cè)試3 天。

2 結(jié)果

2.1 系列血紅蛋白溶液隱血試驗(yàn)檢測(cè)線性范圍驗(yàn)證用0 代表陰性，用1～4 代表陽性反應(yīng)顏色由淺到深，見表2。結(jié)果顯示：0.10、0.20、0.50μg/mL 濃度的血紅蛋白溶液手工法和儀器法隱血試驗(yàn)均為陰性；1.0、2.0μg/mL濃度的血紅蛋白溶液手工法試驗(yàn)均為陽性，顏色反應(yīng)為1；分析儀法1.0μg/mL 濃度為陰性，2.0μg/mL 濃度為陽性，顏色反應(yīng)為1；100、500、1000、2000μg/mL 濃度的血紅蛋白溶液手工法和儀器法隱血試驗(yàn)均為陽性，顏色反應(yīng)依次為2、3、4；2500、3000μg/mL 濃度的血紅蛋白溶液手工法和儀器法隱血試驗(yàn)同時(shí)均為陰性，為血紅蛋白濃度過高，即抗原過量，引起的HOOK 效應(yīng)所致假陰性。

表2 系列濃度血紅蛋白溶液隱血試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)FA160 全自動(dòng)糞便分析儀隱血檢測(cè)線性范圍驗(yàn)證結(jié)果，濃度為2μg/mL 的血紅蛋白溶液的隱血試驗(yàn)結(jié)果為陽性，可將2μg/mL 的血紅蛋白溶液作為FA160全自動(dòng)糞便分析儀隱血的室內(nèi)質(zhì)控品濃度。結(jié)果顯示：2.0～2000μg/mL 的血紅蛋白溶液做隱血試驗(yàn)，手工法和分析儀法均具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得隱血檢測(cè)試劑卡的檢測(cè)線性范圍為1.0～2000μg/mL，最適室內(nèi)質(zhì)控濃度為2μg/mL。見表3。

表3 手工法和分析儀法確認(rèn)隱血檢測(cè)線性范圍的性能比對(duì)

2.2 保存條件采用2μg/mL 的血紅蛋白溶液作為室內(nèi)質(zhì)控品，室溫保存一周和-20℃冰凍保存1 月，做隱血試驗(yàn)結(jié)果均為陽性（顏色1+），穩(wěn)定性較好。

2.3 穩(wěn)定性采用-20℃冰凍保存的100μg/mL 血紅蛋白溶液（母液），每月稀釋一支，隱血試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，在1 年內(nèi)均能得到理想的質(zhì)控結(jié)果。

2.4 空白試驗(yàn)結(jié)果手工法和分析儀法檢測(cè)FOB 結(jié)果均為陰性，符合率均為100%。

2.5 準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果陽性樣本和自制2μg/mL 的血紅蛋白溶液質(zhì)控品連續(xù)檢測(cè)比對(duì)結(jié)果一致，均為陽性，符合率均為100%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果所有測(cè)試設(shè)計(jì)均涉及重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)，檢測(cè)結(jié)果一致，符合率均為100%。

3 討論

FOBT 是指肉眼或者顯微鏡觀察不到的潛在的一種出血現(xiàn)象，目前國(guó)內(nèi)糞便常規(guī)的檢查普遍使用顯微鏡法和FOB 方法，它是臨床診斷消化道出血和消化道腫瘤早期篩查常用的一種鑒別方法［3，4］，具有檢測(cè)便捷、特異、無創(chuàng)、時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于急性或慢性消化道出血、消化道惡性腫瘤等疾病具有重要的臨床診斷價(jià)值［5］。常用檢測(cè)方法有化學(xué)法、免疫化學(xué)法和免疫層析法［6］，各有優(yōu)點(diǎn)和局限性。化學(xué)法靈敏度低［7］，特異性高，存在一定的假陽性，對(duì)上消化道出血檢出率高［8］。免疫法檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，對(duì)下消化道出血檢出率高，受抗原性和鉤狀效應(yīng)的影響而存在一定的假陰性，兩種方法聯(lián)合檢測(cè)，可以提高陽性檢出率，避免漏檢［9］。免疫層析法是人血紅蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的聯(lián)合檢測(cè)方法，對(duì)于上消化道出檢出率高［10，11］，方法學(xué)上優(yōu)于其他兩項(xiàng)FOBT，但他的成本要明顯高于其他兩項(xiàng)試驗(yàn)。

隨著自動(dòng)化分析儀技術(shù)和圖像智能識(shí)別技術(shù)不斷進(jìn)步，越來越多的全自動(dòng)糞便分析儀應(yīng)用于臨床工作［12，13］，提高了工作效率。不同的儀器檢測(cè)性能有一定的差異［2］，所以在使用全自動(dòng)糞便分析儀時(shí)，嚴(yán)格執(zhí)行室內(nèi)質(zhì)控尤為重要，糞便結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性才能得到有效的保障［14，15］。

FA160 全自動(dòng)糞便分析儀采用軌道式流水線自動(dòng)進(jìn)樣，機(jī)械手抓取樣本采集管，穿刺加注稀釋液后進(jìn)行氣動(dòng)混勻方式對(duì)樣本進(jìn)行充分的混勻、加樣、自動(dòng)采集樣本顏色性狀圖像，有形成分形態(tài)學(xué)圖像拍照，傳輸?shù)杰浖D像采集系統(tǒng)，由專業(yè)人員進(jìn)行結(jié)果的判讀和保存。全程實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，避免人為操作的誤差和隨意性，并且消除了檢測(cè)過程中的安全隱患，確保了工作環(huán)境的干凈、整潔、舒適，并且生物安全性高。

室內(nèi)質(zhì)控是檢驗(yàn)工作中的靈魂，開展室內(nèi)質(zhì)控是保證FOBT 質(zhì)量的必要措施［16］，目前市售的室內(nèi)質(zhì)控品多為商家配套提供商品，多為套餐或組合式包裝，很少有單一質(zhì)控品。大多推薦用眾多實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可好評(píng)的質(zhì)控品供應(yīng)商的商品，其價(jià)格昂貴，使用周期短，不宜廣泛推廣應(yīng)用。國(guó)內(nèi)有陸永輝［17］林馥嘉［18］等通過自制1μg/mL 血紅蛋白質(zhì)控品驗(yàn)證其可檢測(cè)線性，保存條件驗(yàn)證，進(jìn)行FOB 日常室內(nèi)質(zhì)控應(yīng)用取得好的效果，但其配制方法操作性還可嘗試優(yōu)化。

本文制備濃度為2μg/mL 血紅蛋白液作為隱血陽性質(zhì)控品，母液分裝12 支，-20℃儲(chǔ)藏，每月取1 支母液配100mL 質(zhì)控應(yīng)用液，4℃不添加任何防腐劑保存，每次取2mL 質(zhì)控應(yīng)用液上機(jī)完成每天室內(nèi)質(zhì)控。本文中隱血陽性應(yīng)用液質(zhì)控品配制簡(jiǎn)單、4℃保存、質(zhì)量穩(wěn)定、實(shí)用價(jià)廉，完全能滿足FA160 全自動(dòng)分析儀隱血試驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控要求，同時(shí)也解決了目前隱血陽性質(zhì)控品市場(chǎng)良莠不齊、價(jià)格昂貴、開瓶期短的問題。為FOB結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了有力的保障。本研究自制的室內(nèi)質(zhì)控品配制簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性可控良好，價(jià)格低廉，具有較好的實(shí)用性。

綜上所述，本文制備的濃度為2μg/mL 的血紅蛋白液隱血陽性質(zhì)控品可作為日常室內(nèi)質(zhì)控應(yīng)用，4℃無防腐劑條件保存，能夠滿足臨床便隱血檢驗(yàn)，易推廣使用。