化療對急性淋巴細胞白血病患兒性腺功能的影響

曹 科 羅小娟 王 纓 劉 霞 葉炳均 陳詩楊 賴建威 龍慶玲 陳運生

深圳市兒童醫(yī)院 1.檢驗科，2.血液腫瘤科，3.內分泌科（廣東深圳 518038）

急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是兒童白血病的最常見類型，約占兒童惡性腫瘤的80%左右。近年來由于采用強烈聯合化療和風險導向治療等手段，兒童白血病的治療取得了長足進步，ALL化療后5～10年無事件生存率在我國大型兒童白血病診療中心高達80%以上。由于環(huán)磷酰胺等化療藥物的藥理毒性和靶向選擇性差等特點，ALL 化療生存率的提高可能伴隨著患兒性腺功能損傷并增加成年期早發(fā)性卵巢功能不全，無/少精子癥和不育不孕發(fā)病率[1-2]。目前，化療方案的療效和安全性是ALL臨床治療的焦點和重心。

兒童腫瘤組織建議對于>13 歲，曾接受過烷化劑或盆部放療的女童，可采用血清促性腺激素對卵巢功能進行篩查。但對于青春期前（2～5 歲為主）的ALL 兒童，其下丘腦-垂體-性腺軸尚未激活，血清促性腺激素處于低值，雌激素和雄激素幾乎測不到，卵巢和睪丸變化幾乎處于靜止狀態(tài)，無月經周期和射精過程。因此，血清性激素水平、睪丸觸診等性腺發(fā)育評估，月經周期和精液質量改變等指標，并不適用于評估ALL 兒童化療期間性腺損傷。抗繆勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）和抑制素B（inhibin B，INHB）由女性卵巢生長卵泡和男性睪丸支持細胞分泌，是屬于轉化生長因子β 超家族成員，是除雌、雄性激素和黃體生成素、促卵泡激素等激素外，參與兩性生殖細胞和性腺發(fā)育，反映男女性腺功能的重要生物標志物。在正常排卵婦女中發(fā)現，與卵泡刺激素、雌激素相比，血清AMH水平能更好地反映卵巢卵泡池大小和卵泡數量，更能準確反應卵巢生殖功能的下降和預測絕經期，是預測卵巢儲備功能的一個可靠指標[3]。INHB 主要由睪丸支持細胞分泌，血清INHB 水平降低與睪丸損傷相關，而且單次采血檢測結果與激發(fā)試驗后睪酮水平兩者間存在強烈關聯，因此，血清INHB可間接反映男性睪丸支持細胞的數量和活性，被推薦為評估青春期前睪丸功能有效、可靠的非侵入性標志物[4-5]。目前，AMH 和INHB 在生殖領域和評估化療對成人惡性腫瘤的性腺功能損傷研究中應用較多[6-8]，但對ALL 兒童性腺功能損傷的評估鮮有報道。本研究依據華南地區(qū)兒童ALL治療協助組2016化療方案（south China children’s leukemia group，SCCLG-ALL-2016），連續(xù)監(jiān)測低、中、高危三型ALL兒童化療前及化療后血清AMH、INHB激素水平，旨在了解不同強度的化療對ALL兒童性腺功能激素指標的影響，評估化療期間性腺功能損傷程度。

1 對象與方法

1.1 研究對象

采用回顧性隊列研究，收集2017年4月至2020年8月期間深圳市兒童醫(yī)院血液腫瘤科收治的ALL患兒臨床資料。研究對象入選標準：①青春期前兒童（女1～10 歲、男1～12 歲），由經驗豐富的內分泌醫(yī)師評估入組兒童第二性征發(fā)育（男童睪丸、陰莖和陰毛生長，女童乳房、陰毛生長的Tanner 分期均為Ⅰ期）；②確診為ALL；③新發(fā)患兒。排除標準：①成熟B、急性混合型白血病；②第二腫瘤；③曾經接受過放療或化療；④繼發(fā)于免疫缺陷??；⑤伴唐氏綜合征的ALL；⑥中樞神經系統和/或睪丸白血??；⑦入組前1個月內使用糖皮質激素超過1周；⑧隱睪癥、性早熟、特納綜合征等影響性腺功能疾病。

選取同期在院兒童保健科健康體檢，年齡和性別相匹配的健康兒童57例作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 記錄入組ALL 患兒性別、年齡，臨床危險度分型和化療方案。

1.2.2 危險度分型 依據患兒臨床特征、細胞免疫學與生物學特征、對治療反應，將臨床危險度分為高危型、中危型、低危型3 組。低危型：①潑尼松7天反應佳，第8天外周血幼稚細胞＜1.0×109/L；②年齡≥1歲且＜10歲；③WBC＜50×109/L；④誘導化療第15天骨髓M1（原淋+幼淋＜5%）；⑤誘導化療第33天骨髓 M1；符合以上①～⑤標準，或初診時有以下兩項之一且符合微小殘留病的低危標準，①t(12;21)/(TEL-AML1)(ETV6-RUNX1)陽性；②超二倍體（＞50）且伴4、10號三倍體。中危型：潑尼松7天反應佳，且符合以下1項或多項，①年齡<1歲或≥10歲；②WBC≥50×109/L；③T-ALL；④中樞神經系統白血?。–NSL）或/和睪丸白血病；⑤費城染色體陽性ALL（Ph+ALL）或費城染色體樣ALL（Ph-like ALL）；⑥t(1;19)(E2A-PBX1)陽性；⑦t(9;22)(BCR-ABL 1)陽性；⑧第15 天骨髓M 2（5%≤原淋+幼淋＜25%），且第33天骨髓 M1。高危型：符合以下任何1 項或多項，①潑尼松反應差，第8 天外周血幼稚細胞≥1.0×109/L；②第15 天骨髓M3（原淋+幼淋≥25%）；③第33天骨髓未緩解M2及M3（原淋+幼淋≥5%）；④t(4;11)(MLLAF4)或其他MLL基因重排陽性；⑤低二倍體（≤44）；⑥21號染色體內部擴增（iAMP21）陽性；⑦IKZF陽性；⑧MEF2D重排或ZNF384重排；⑨TCF3-HLF/t(17;19)(q 22;p 13)；⑩誘導治療后（第33 天）評估縱隔瘤灶沒有縮小到最初腫瘤體積的1/3或鞏固治療前仍存在瘤灶者。

1.2.3 治療方案 按SCCLG-ALL-2016方案進行規(guī)范化療，總流程包括誘導緩解、鞏固、再誘導和維持治療。誘導緩解階段采用VDLD 方案（醋酸潑尼松+長春新堿+柔紅霉素+培門冬酶+地塞米松）和CAM方案（環(huán)磷酰胺+阿糖胞苷+6-巰基嘌呤+長春新堿）早期強化治療，低危組1 輪，中危、高危組2 輪。鞏固治療階段：低危組以甲氨蝶呤2 g/m2、中危組以甲氨蝶呤5g/m2進行4輪化療，每2周1次，為期56天，每次大劑量甲氨蝶呤（5 g/m2）化療時需給予腰穿鞘注治療，同時口服巰嘌呤[25mg/(m2·d)]化療56 天；高?；純盒杞o予2 輪HR-1’、HR-2’、HR-3’方案，化療藥物包括：地塞米松、長春新堿、長春地辛、大劑量甲氨蝶呤（5 g/m2）、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、培門冬酶、異環(huán)磷酰胺、柔紅霉素、依托泊苷。再誘導階段：采用VDLD方案（低危組3輪，中、高危組4 輪）和CAM 方案。維持治療階段：6-巰基嘌呤+甲氨碟呤+地塞米松+長春新堿治療。在整個化療期間需定期腰穿鞘注預防中樞神經系統白血?。豢偗煶?.0～2.5年。

1.2.4 樣本采集 分別于化療前，化療后3、6、12、18 個月共5 個時間點，于上午8 點空腹抽取靜脈血3 mL，相對離心力1 200×g，離心5分鐘后取血清。收集同期在院兒童保健科健康體檢兒童生化常規(guī)檢測的剩余血清標本，于-40℃冰箱凍存?zhèn)錂z。

1.2.5 檢測方法 血清AMH、INHB水平、黃體生成激素（LH）、卵泡生成激素（FSH）、雌二醇（E2）和睪酮（T）均采用化學發(fā)光免疫分析法檢測，儀器為深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司的iFlash 3000化學發(fā)光免疫分析儀，使用儀器配套專用試劑盒，嚴格按照儀器標準操作程序和試劑盒說明書操作檢測，室內質量控制在控。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差表示，非正態(tài)分布計量資料以中位數（P25～P75）表示，經對數轉換為正態(tài)分布數據后，再行相關檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。重復測量計量資料采用重復測量的方差分析，若符合球形假設檢驗則行兩因素方差分析，若因變量方差協方差矩陣不相等，行Greenhouse&Geisser方法（ε＜0.75）或者Huynh-Feldt方法（ε≥0.75）矯正。相關性分析采用Spearman 秩相關檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

共納入112 例ALL 患兒，男58 例、女54 例，中位年齡4.1（2.5～6.1）歲（范圍1～9歲）。其中男童高危型14例、中危型29例、低危型15例；女童高危型10例、中危型29例、低危組15例。正常對照組57例，男28例、女29例，中位年齡4.0（2.5～6.3）歲。

2.2 ALL 患兒化療前血清AMH、INHB 和性激素水平

無論男、女，ALL 高危組、中危組、低危型組與對照組之間年齡，血清AMH、INHB 和LH、FSH 水平的差異均無統計學意義（P＞0.05）。無論ALL 高危組、中危組、低危型組還是對照組（t=7.97～16.38，P均＜0.01），女童組血清AMH、INHB 水平均明顯低于男童組，FSH 明顯高于男童組，差異均有統計學意義（t=5.02～6.52，P均＜0.01）。見表1。

表1 ALL兒童化療前血清AMH、INHB和性激素水平比較分析

經Spearman 秩相關檢驗發(fā)現，女童化療前血清AMH水平與年齡呈正相關（r=0.37，P=0.006），男童AMH、INHB水平與年齡呈負相關（r=-0.48，P＜0.001；r=-0.32，P=0.014）。

2.3 ALL化療前、后血清AMH和INHB水平比較

采用重復測量方差分析發(fā)現，男童低危型、中危型、高危型之間血清AMH 水平差異無統計學意義（F=1.05，P=0.362），男童化療前后不同時間點的血清AMH 水平差異也無統計學意義（F=2.65，P=0.105），時間與危險度分型對于血清AMH水平不存在交互效應（F=1.20，P=0.304）。男童低危型、中危型、高危型之間血清INHB 水平差異有統計學意義（F=3.60，P=0.036），男童化療前后不同時間之間血清INHB水平差異有統計學意義（F=81.67，P＜0.001），時間與危險度分型對于血清INHB水平存在交互效應（F=5.12，P＜0.001）。見表2。

表2 ALL男童化療前、后血清AMH和INHB水平比較分析

采用重復測量方差分析發(fā)現，女童低危型、中危型、高危型之間血清AMH 水平差異無統計學意義（F=0.62，P=0.551），女童化療前后不同時間之間血清AMH水平差異有統計學意義（F=21.32，P＜0.001），時間與危險度分型對于血清AMH水平存在交互效應（F=2.33，P=0.029）。女童低危型、中危型、高危型之間血清INHB 水平差異無統計學意義（F=0.675，P=0.523），女童化療前后不同時間之間血清INHB水平差異無統計學意義（F=1.226，P=0.300），時間與危險度分型對于血清INHB水平不存在交互效應（F=0.664，P=0.721）。見表3。

表3 ALL女童化療前、后血清AMH和INHB水平比較分析

3 討論

本研究將ALL兒童化療前血清AMH、INHB和性激素水平與正常對照組相比，結果并無統計學差異，提示ALL本身不會顯著改變AMH和INHB水平。對健康兒童性激素調查顯示，不同性別、不同年齡組間的性激素水平存在顯著差異，新生嬰兒期和青春期變化波動較大，而幼兒期至學齡期則相對穩(wěn)定[9]。本研究對象年齡跨度較大（1～9 歲），與年齡進行相關性分析，提示女童血清AMH水平隨年齡增長有升高趨勢，而男童血清AMH和INHB隨年齡增長呈下降趨勢。同時，女童組血清AMH、INHB水平均顯著低于男童組，而FSH 高于男童組，與已報道的性激素參考值調查結果相似[10]。因此，本研究分析化療對ALL患兒性腺功能激素指標的影響，比較同一個體化療前后血清AMH、INHB水平變化，能減少年齡和性別相關的個體差異造成的組間偏倚，能更客觀反映化療期間性腺功能的損傷。

ALL 治療與霍奇金淋巴瘤和骨盆/腹部實體腫瘤相比，烷基化劑等化療劑量和放療強度相對較小，對于青春期前兒童，白血病化療是否導致其性腺功能損傷，尚不明確。本研究對ALL 兒童化療前、后AMH 和INHB 激素指標進行分析，結果表明盡管ALL兒童尚處于青春前期，SCCLG-ALL-2016化療仍可導致其性腺功能激素指標改變，而且化療對高危型的影響程度高于低、中危型，提示ALL患兒在化療期間性腺功能存在不同程度的損傷，與國外最近研究結果[11]相一致。長期臨床隨訪顯示，兒童期因白血病、實體腫瘤接受高劑量放化療的男性患兒，成年后發(fā)生無精或少精癥的比例高達80.2%～92.6%，性功能明顯較正常人差[12]。女性發(fā)生卵巢早衰性不孕風險增加，或者雖然能夠自然受孕，但存在月經不規(guī)則，性腺激素紊亂，竇卵泡數較低等情況[13]，提示卵巢儲備功能下降和“生育窗口期”縮短。在ALL治療目標達到臨床緩解，進而提高生活質量的今天，生育能力的保存是至關重要的，化療可能導致性腺潛在的損傷應充分告知。

ALL化療方案中環(huán)磷酰胺作為雙功能烷化劑和細胞周期非特異性藥物，在臨床治療中的生殖毒性是決定性腺損傷的關鍵因素。研究表明，環(huán)磷酰胺通過上調卵母細胞PTEN/PI3K/Akt信號通路，啟動卵泡的募集和生長，最終導致卵巢卵泡儲備的集體閉鎖-耗盡[14]。其他細胞抑制劑，如阿糖胞苷或阿霉素，雖然實質上對性腺功能的毒性較小，但可損傷DNA，通過卵母細胞和原始卵泡顆粒細胞凋亡等不同機制導致卵泡閉鎖[15-16]。一項利用人卵巢異種移植模型，對原始卵泡卵母細胞進行單細胞測序結果顯示，注射環(huán)磷酰胺后12h，即可出現原始卵泡DNA損傷顯著增加和細胞凋亡高峰，導致卵巢儲備大量喪失[17]。動物實驗證明環(huán)磷酰胺可誘導小鼠睪丸所有階段的生殖細胞凋亡，以精原細胞和精母細胞最為顯著[18-19]。環(huán)磷酰胺一方面對睪丸支持細胞（sertoli cells，SC）具有明顯的氧化應激損傷作用，損害睪丸生精細胞形成精子所依賴的微環(huán)境，繼而干擾SC細胞內分泌功能，抑制INHB 等精原細胞生長因子的分泌功能，導致未成熟睪丸損傷；另一方面通過對睪丸組織信號傳導通路的損傷，誘導已經分化的精原細胞及精母細胞顯著凋亡，并干擾“幸存”的未分化精原細胞的正常增殖及分化，最終導致無精、少精癥和精子質量下降[20]。

ALL 的臨床危險度分為低危、中危和高危型組。烷基化劑等化療藥物劑量和療程在不同的危險組之間有差異，其生殖毒性大小和性腺功能損傷程度不一。SCCLG-ALL-2016 化療方案中低危型組環(huán)磷酰胺累積劑量2 g/m2，中危型組3 g/m2，而高危型組使用的環(huán)磷酰胺劑量高達5 g/m2。環(huán)磷酰胺的性腺毒性依賴于劑量，但其導致性腺損傷的臨界劑量尚未確定。對ALL 兒童化療后長期幸存者的精液質量和生育能力研究顯示，＜10 g/m2的環(huán)磷酰胺累積劑量（聯合預防性顱照射）治療男性癌癥幸存者時，未能觀察到精液質量和激素水平的變化[21]。而其他研究發(fā)現，環(huán)磷酰胺總劑量為5.0～7.5 g/m2時精液參數即可發(fā)生異常[22-23]。本研究結果顯示，女童和男童低危、中危和高危型3組均分別出現血清AMH和INHB水平下降，而高危型組下降程度和持續(xù)時間更長。提示高危型組患兒接受了更高強度的化療，對性腺功能的影響更為明顯，應重視對其遠期性腺功能的隨訪觀察。低危、中危型組雖然環(huán)磷酰胺累積劑量較低，但與其他性腺毒性細胞抑制劑聯用，仍存在性腺功能紊亂的可能。

另外，本研究發(fā)現，ALL女童化療后血清AMH水平出現明顯下降，但在12～18 月后能恢復至化療前水平，而男童則在相同時間內未觀察到INHB水平回升。與成年乳腺癌患者化療結束6 個月后，AMH 未恢復至基線水平相比[24]，化療后女童卵巢儲備功能似乎具有一定的恢復代償機制。有研究報道，ALL 女童治療后的時間間隔與血清AMH 水平呈正相關，化療結束10 年以上女性AMH 水平明顯高于10年以下者，提示女童卵巢功能存在部分恢復的可能[11]。未成熟女性AMH 水平隨著卵泡的生長而升高，在生殖早期，盡管原始卵泡池下降，生長卵泡數量和AMH 水平卻保持相對穩(wěn)定，表明維持生長卵泡數量恒定的補償機制是存在的，提示青春前期女童卵子儲蓄池功能大于成年女性，推測其對化療的敏感性低于成年期女性[25]。另外，新近病例報告描述了同卵雙胞胎姐妹均接受白血病化療和骨髓移植后截然不同的生育結果，姐姐在2 歲診斷治療，27 歲時自然受孕并順產一個健康女嬰；而妹妹則在青春期月經初潮后（15歲）診斷治療，10年后復發(fā)接受再次化療和骨髓移植，28歲發(fā)生卵巢早衰而不孕[13]，推斷青春期前的狀態(tài)對卵巢衰竭起到了保護作用。

目前研究表明，生殖細胞和組織（卵細胞、精子、卵巢和睪丸組織）在超低溫條件下能長期存活。惡性腫瘤患者化療前，可采用凍存胚胎、生殖細胞和組織等方法保留生育能力，待化療結束后再行胚胎著床、生殖細胞受孕或生殖組織再植[26]。另有研究表明，促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）可抑制成熟女性下丘腦-垂體-卵巢軸功能，保持在青春前期狀態(tài)，對腫瘤患者化療后卵巢功能具有一定的保護作用。針對化療所致生殖細胞凋亡信號通路的關鍵基因或蛋白抑制劑的新藥研發(fā)也是熱點。然而，目前針對青春前期患兒生育潛能的保護，仍面臨諸多技術難題和倫理挑戰(zhàn)，需要多學科通力合作以提高生存率和保護生育力。

綜上，本研究比較不同強度的化療對ALL兒童性腺功能激素指標的影響，提示ALL 兒童在化療期間性腺功能存在不同程度的損傷。血清AMH 和INHB對ALL兒童化療后短期內性腺損傷的監(jiān)測評估具有臨床意義，對如何在治療癌癥的同時最大限度地保護性腺功能具有積極意義?；熀箅S訪時間短，是本研究的不足之處，有待進一步采用多中心前瞻性研究，并延長隨訪時間，進一步明確兒童期ALL 化療對青春發(fā)育、遠期性腺功能損傷和成年后孕育等臨床結局影響。