小鼠脂肪間質干細胞源胞外囊泡激活蛋白激酶B促進卵巢癌細胞增殖遷移和上皮間質轉化

沈娜惠,孫曉春

(1.江蘇大學醫(yī)學院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.常州市第四人民醫(yī)院檢驗科,江蘇 常州 213000)

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一,在女性致命疾病中排名第四[1-2]。由于卵巢癌早期不易診斷,約61%卵巢癌患者在診斷時已發(fā)生遠處轉移,預后較差[3]。目前,卵巢癌轉移的機制復雜且不明確。腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細胞存在的周圍微環(huán)境,包括周圍的血管、免疫細胞、成纖維細胞、間質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、骨髓源性炎性細胞、各種信號分子和細胞外基質等[4]。據(jù)報道,腫瘤微環(huán)境對卵巢癌的轉移有顯著促進作用[5-6]。MSCs和胞外囊泡作為腫瘤微環(huán)境中重要的成員影響著腫瘤的發(fā)展方向[7]。MSCs是一種來源于發(fā)育早期具有高度分化和自我更新能力的多能干細胞,其中脂肪間質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)可通過皮下抽脂等方式獲取,來源非常豐富,且其使用無倫理爭議。胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是一類可由多種細胞類型釋放的納米級膜性小泡,由于其攜帶的表面抗原標志和內容物與母細胞相似,被認為是“微縮版的干細胞”,在與腫瘤通訊中具有重要的調控作用[8]。目前,因受制于腫瘤源MSCs標本來源的限制,本研究擬以ADSCs代替腫瘤源MSCs并分離EVs,同時以卵巢癌細胞株ID8為研究對象,探討脂肪間質干細胞源胞外囊泡(ADSC-EVs)對ID8細胞株生物功能的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑和儀器

5～6周齡C57BL/6J雌性小鼠10只購于江蘇大學實驗動物中心[許可證號:SYXK(蘇)2018-0053]；ID8細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；L-DMEM、H-DMEM、胰酶和胎牛血清(美國Gibco公司)；成骨成脂誘導分化培養(yǎng)基試劑盒(美國Cyagen公司)；細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和Transwell小室(美國Corning公司)；雙抗、BCA蛋白濃度檢測試劑盒和SDS-PAGE凝膠試劑盒(上海碧云天公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；兔抗小鼠單克隆抗體E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin),蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、CD9、CD81、GAPDH均購自美國CST公司；HRP標記的羊抗兔二抗(上海愛必信公司)；Nanosight可視型納米顆粒分析儀(英國Nanosight公司)。

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)(美國GE公司)；酶標儀(美國Biotek公司)。

1.2 ADSCs分離培養(yǎng)

將5～6周齡C57BL/6J雌性小鼠脫頸處死后,用乙醇浸泡消毒；在超凈臺中分離皮下脂肪,去除脂肪組織中的血管。將分離好的脂肪組織剪碎,轉移至預先加入0.25% Ⅰ型膠原酶的EP管中,在37 ℃水浴鍋中振蕩孵育30 min。用70 μm濾器過濾后,300×g離心5 min,棄上清液,用完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀,接種于培養(yǎng)瓶中,靜置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h換液。待細胞融合度達70%～80%時,消化傳代。第3代至第5代細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 ADSCs鑒定

1.3.1 流式細胞術分析ADSCs表面標志 用胰酶將P3代ADSCs消化成單細胞懸液,每管分裝1×106個細胞,加入不同熒光標記的CD抗體。在冰上避光染色孵育30 min,PBS洗滌3遍后重懸細胞,過濾上機檢測分析。

1.3.2 ADSCs成骨分化能力鑒定 將P3代的ADSCs按每孔1×104個細胞接種于6孔板中,次日換成骨誘導液,每3 d換骨誘導液1次,直至14 d后,用茜素紅染色。

1.3.3 ADSCs成脂分化能力鑒定 將P3代的ADSCs按每孔2×104個細胞接種于24孔板中,待細胞融合度達到90%時,換成脂誘導液A液培養(yǎng)3 d,再換成脂誘導液B液培養(yǎng)1 d,如此交替換液直至21 d后,用油紅O染色觀察脂滴形成情況。

1.4 胞外囊泡的提取及鑒定

1.4.1 胞外囊泡提取 待P3代ADSCs生長至融合度為80%時,用PBS清洗3次,加入不含EVs的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)2 d；收集上清液,于4 ℃行100 000×g超速離心1 h；取沉淀,用PBS重懸,重復上述離心；棄上清液,用BCA法測定ADSC-EVs蛋白濃度,分裝于-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 透射電子顯微鏡觀察ADSC-EVs形態(tài) 將待檢ADSC-EVs充分混勻后,取10 μL滴加在透射電鏡銅網(wǎng)正面；室溫下放置30 min,將銅網(wǎng)放入磷鎢酸鈉溶液中負染5 min；再將銅網(wǎng)放置在白熾燈下烘干；最后,將制備好的銅網(wǎng)放入透射電子顯微鏡載樣器上,進行形態(tài)觀察并拍照。

1.4.3 納米粒徑分析ADSC-EVs粒徑和濃度 將稀釋后的ADSC-EVs緩慢注入Nanosight可視型納米顆粒分析儀中,操作過程避免產(chǎn)生氣泡；然后將樣品池放置于分析儀中,對處于布朗運動中的ADSC-EVs進行捕捉和分析。

1.4.4 蛋白質印跡實驗檢測CD9和CD81蛋白表達 使用RIPA裂解液分別裂解ADSC-EVs和ADSCs,提取總蛋白；采用BCA法測定蛋白濃度；行SDS-PAGE,80 V電泳30 min分離蛋白；再將電泳調至100 V,繼續(xù)電泳1 h；350 mA恒流濕轉90 min至PVDF膜；用5%脫脂牛奶在室溫封閉1～2 h；4 ℃孵育CD9和CD81一抗過夜(稀釋比均為1∶1 000)；TBST漂洗3遍；常溫孵育HRP標記的羊抗兔二抗1 h(稀釋比均為1∶2 000)；TBST漂洗3遍；ECL曝光顯影,凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。

1.5 細胞實驗

1.5.1 細胞培養(yǎng)及分組 ID8細胞用含10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng),將其分為3組,分別用PBS、20 μg/mL和40 μg/mL ADSC-EVs預處理24 h；胰酶消化收集ID8細胞。

1.5.2 平板克隆實驗檢測ID8細胞增殖能力 取“1.5.1”分組細胞,接種于6孔板,調整細胞數(shù)量為200個/孔(2 mL),在37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng),每3 d換液1次,連續(xù)培養(yǎng)7 d；棄培養(yǎng)液,PBS洗滌3遍；4%多聚甲醛固定ID8細胞30 min；PBS洗滌3遍；結晶紫染色10 min；PBS洗滌3遍,拍照并統(tǒng)計分析。

1.5.3 細胞劃痕實驗檢測ID8細胞遷移能力 取“1.5.1”分組細胞,接種于6孔板,調整細胞數(shù)為1×105個/孔(2 mL),在37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)；待細胞融合度達到80%時,棄培養(yǎng)液,用無血清培養(yǎng)液清洗3遍；用200 μL槍頭在6孔板中央筆直畫一條直線,再用無血清培養(yǎng)液清洗3遍；在顯微鏡下觀察劃痕處,拍照并記錄0 h和24 h時間點劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h寬度-24 h寬度)/0 h寬度×100%。

1.5.4 Transwell實驗檢測ID8細胞遷移能力 取“1.5.1”分組細胞,用無血清培養(yǎng)液調整細胞數(shù)為1×105個/孔(200 μL),加入Transwell上室中,下室內加入完全培養(yǎng)基600 μL,在37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)10 h；用棉簽小心吸干上室內液體,并擦拭未遷移的細胞；將小室轉移到4%多聚甲醛中固定30 min；PBS洗滌3遍；室溫下用結晶紫染色15 min；PBS洗滌3遍；在顯微鏡下觀察ID8細胞遷移情況,拍照計數(shù)并統(tǒng)計分析。

1.5.5 蛋白質印跡實驗檢測上皮-間質轉化(EMT)和AKT相關蛋白表達 取“1.5.1”分組細胞,棄培養(yǎng)液；PBS清洗3遍,置于冰上,加入RIPA裂解液裂解ID8細胞,提取總蛋白；一抗稀釋比為1∶1000,二抗稀釋比為1∶2000,其余步驟同“1.4.4”,用Image J軟件對蛋白條帶進行分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 ADSCs分離與鑒定

小鼠脂肪組織原代培養(yǎng)約24 h后,可見大量的呈現(xiàn)短梭形或成纖維樣的貼壁細胞,其中也摻雜著如成熟的脂肪細胞等雜細胞(圖1A)；經(jīng)過約3次培養(yǎng)傳代后,ADSCs純度越來越高,形態(tài)也呈現(xiàn)典型的長纖維樣,細胞長滿時可見漩渦樣生長(圖1A)。第3代ADSCs通過成骨誘導培養(yǎng)基誘導約14 d后,其形態(tài)從長梭形變成多邊形,茜素紅染色可以將胞質染成橘紅色(圖1B)。通過成脂誘導培養(yǎng)基誘導約7 d后,可見細胞形態(tài)從長梭形變成圓形或橢圓形,且胞質中分布大小不一折光性較強的脂滴,油紅O染色可將脂滴染成橘紅色(圖1B)。通過流式細胞術分析第3代的ADSCs表面標志,該群細胞高表達CD29、CD90和CD105,且陽性率均在95%以上,不表達CD19(圖1C)。以上結果表明,該類細胞在第3代時具有典型的干細胞形態(tài),具有成骨和成脂多向分化能力,表面標志符合ADSCs的一般表面標志特點且具有較高的純度。故選用第3代至第5代細胞用于后續(xù)實驗。

A:原代和第3代ADSCs形態(tài)(原代標尺:100 μm；第3代標尺:200 μm)；B:成骨(標尺:200 μm)和成脂誘導(標尺:50 μm)；C:流式細胞術鑒定ADSCs表面標志圖1 ADSCs多向分化能力和表面標志鑒定

2.2 ADSC-EVs分離與鑒定

通過透射電鏡觀察分離的ADSC-EVs,其形態(tài)呈現(xiàn)圓形或者橢圓形(圖2A)；納米微粒分析儀檢測ADSC-EVs粒徑,結果顯示其平均粒徑為368.6 nm(圖2B)；BCA檢測其蛋白濃度為5 mg/mL。蛋白質印跡結果顯示,ADSC-EVs表達CD9和CD81蛋白分子(圖2C)。由此表明,成功提取出ADSC-EVs。

A:透射電子顯微鏡觀察ADSC-EVs形態(tài)；B:納米微粒分析ADSC-EVs粒徑；C:蛋白質印跡實驗檢測ADSC-EVs表面CD9和CD81表達圖2 ADSC-EVs的形態(tài)及鑒定

2.3 ADSC-EVs促進ID8細胞增殖

平板克隆實驗結果顯示,經(jīng)過約7 d培養(yǎng),20 μg/mL和40 μg/mL ADSC-EVs組細胞克隆數(shù)較PBS組明顯增多(t值分別為11.340和11.090,P均<0.01),且40 μg/mL ADSC-EVs組克隆數(shù)顯著高于20 μg/mL ADSC-EVs組(t=4.656,P<0.01),見圖3。

a:P<0.01,與PBS組比較；b:P<0.01,與20 μg/mL ADSC-EVs組比較圖3 平板克隆實驗檢測ADSC-EVs對ID8細胞增殖能力的影響

2.4 ADSC-EVs促進ID8細胞遷移能力

細胞劃痕實驗結果顯示(圖4A),與PBS組相比,20 μg/mL和40 μg/mL ADSC-EVs組細胞劃痕愈合率明顯升高(t值分別為3.461,11.920,P<0.05或<0.01),且40 μg/mL ADSC-EVs組劃痕愈合率明顯高于20 μg/mL ADSC-EVs組(t=2.740,P<0.05)。Transwell實驗結果顯示(圖4B),與PBS組比較,20 μg/mL和40 μg/mL ADSC-EVs組細胞遷移數(shù)量明顯升高(t值分別為4.593和10.50,P均<0.01),且40 μg/mL ADSC-EVs組細胞遷移數(shù)顯著高于20 μg/mL ADSC-EV組(t=3.328,P<0.05)。

2.5 ADSC-EVs激活AKT促進ID8細胞EMT

蛋白質印跡結果顯示,與PBS組相比,20 μg/mL和40 μg/mL ADSC-EVs組ID8細胞上皮標志物E-鈣黏蛋白表達顯著降低(t值分別為5.050,9.006,P均<0.05),而間質標志蛋白N-鈣黏蛋白(t值分別為7.133,9.802,P均<0.05)和波形蛋白(t值分別為6.059,7.141,P均<0.05)表達均顯著升高,見圖5 A。進一步檢測AKT相關蛋白的表達水平,結果顯示,與PBS組相比,20 μg/mL和40 μg/mL ADSC-EVs組細胞通路關鍵分子p-AKT表達水平顯著升高(t分別為9.798,22.050,P均<0.05),而AKT表達無顯著差異,見圖5B。

A:劃痕實驗檢測ID8細胞遷移能力；B:Transwell實驗檢測ID8細胞遷移能力；C:定量分析；a:P<0.05,b:P<0.01,與PBS組比較；c:P<0.05,與20 μg/mL ADSC-EVs組比較圖4 ADSC-EVs對ID8細胞遷移能力的影響

A:蛋白質印跡實驗檢測EMT相關蛋白表達；B:蛋白質印跡實驗檢測p-AKT和AKT蛋白表達；a:P<0.05,與PBS組比較；b:P<0.05,c:P<0.01,與20 μg/mL ADSC-EVs組比較圖5 ADSC-EVs對ID8細胞AKT和EMT蛋白水平的影響

3 討論

ADSCs是一類重要的MSCs,越來越多的證據(jù)表明ADSCs在腫瘤微環(huán)境中能夠調節(jié)腫瘤進展,尤其是腫瘤轉移[9-10]。已有文獻報道,ADSCs通過IL-6旁分泌回路促進肺癌的發(fā)生發(fā)展[11]。間質干細胞源胞外囊泡(MSC-EVs)對腫瘤的作用仍存在較大爭議,其既可促進腫瘤生長、血管生成以及腫瘤轉移[12],也可抑制腫瘤進展[13]。

研究發(fā)現(xiàn),MSC-EVs可通過激活細胞外信號調節(jié)激酶1/2(ERK1/2)信號途徑,從而增強腫瘤細胞中血管內皮生長因子的表達[14]。該項研究提供了MSC-EVs可促進腫瘤生長的可能機制。本研究采用酶消化法從C57BL/6J小鼠脂肪組織中成功獲得純度較高的脂肪間質干細胞,并且成功傳代。另外,采用超高速離心法提取脂肪間質干細胞上清液中的EVs,并鑒定其符合EVs一般特征。平板克隆、劃痕實驗以及Transwell實驗結果顯示,40 μg/mL ADSC-EVs組ID8細胞克隆數(shù)和遷移數(shù)量較20 μg/mL ADSC-EVs明顯增多,提示ADSC-EVs能夠有效地促進ID8細胞增殖和遷移。由于本實驗中ADSC-EVs濃度是基于前期數(shù)據(jù)[15],因此,ADSC-EVs的其他作用濃度和作用時間仍可進一步細化研究。

在腫瘤發(fā)生轉移的情況下,可由EMT介導細胞開始失去接觸和黏附,導致腫瘤細胞侵襲和遷移增強[16]。EMT是多種上皮性腫瘤侵襲的關鍵機制,主要涉及腫瘤微環(huán)境、腫瘤細胞以及這兩種成分之間的相互作用等多種信號[17]。本研究發(fā)現(xiàn),ADSC-EVs處理后的ID8細胞E-鈣黏蛋白表達降低,N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達升高,由此提示ADSC-EVs可能通過促進ID8細胞發(fā)生EMT,進而導致細胞遷移能力增強。AKT是PI3K的主要下游效應因子之一,能激活多種信號磷酸化底物,對細胞增殖、黏附、遷移、侵襲、代謝和存活具有重要影響。在60%以上的腫瘤中AKT信號通路呈異常激活,進而刺激腫瘤細胞增殖和血管生成。因此,該通路有望成為腫瘤治療的靶點[18-19]；磷酸化AKT是激活這一通路的主要特征。有研究發(fā)現(xiàn),MSCs來源的外泌體攜帶LINC01559分子可以激活AKT信號通路,從而促進胃癌的惡性程度[20]。另一項研究結果也表明MSCs來源的外泌體通過激活AKT信號通路誘導胃癌細胞EMT并賦予其干細胞特性,且MSCs來源的外泌體可能是胃癌治療中的一個新的治療靶點[21]。在EVs中最重要的成分之一就是外泌體,本研究發(fā)現(xiàn)ADSC-EVs處理后的ID8細胞AKT信號通路中的p-AKT表達明顯增加,即受到明顯激活。由此表明,ADSC-EVs可能通過激活AKT信號途徑促進ID8細胞發(fā)生EMT,但具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)ADSC-EVs可能通過激活AKT信號途徑促進卵巢癌ID8細胞增殖、遷移和EMT等。由此推測,腫瘤微環(huán)境中的腫瘤源MSCs可能通過分泌EVs影響腫瘤細胞生物學特性,從而促進腫瘤的發(fā)展進程。