穿心蓮內(nèi)酯對人乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用

傅鶴秀,鹿蓓蓓,陳秋云,高靜

(江蘇大學(xué) 1.藥學(xué)院,2.化學(xué)化工學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

三陰性乳腺癌是一類雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體表達(dá)均為陰性的特殊乳腺癌類型[1],由于腫瘤異質(zhì)性高且缺乏有效治療靶點,極易發(fā)生遷移復(fù)發(fā),是預(yù)后最差、致死率最高的一種乳腺癌類型[2-3]。在正常細(xì)胞中,葡萄糖轉(zhuǎn)化生成的丙酮酸進(jìn)入線粒體,通過丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)氧化脫羧生成乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán),為細(xì)胞提供能量,而在腫瘤細(xì)胞中,葡萄糖轉(zhuǎn)化生成的丙酮酸大部分會生成乳酸維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[4]。尤其在具有遷移性的癌細(xì)胞中,糖酵解產(chǎn)生的大量乳酸最終排出胞外,堆積形成腫瘤生長局部的酸性環(huán)境,利于其自身對周圍組織的侵襲和浸潤性生長[5]。近年研究發(fā)現(xiàn),位于線粒體內(nèi)膜上的解偶聯(lián)蛋白-2(uncoupling protein-2,UCP2)在腫瘤的代謝中發(fā)揮重要作用。有研究表明,通過轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)UCP2的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞,與空白轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞產(chǎn)生了更多的乳酸[6]；此外,當(dāng)UCP2被激活時,可以產(chǎn)生質(zhì)子滲漏,降低線粒體在呼吸時形成的H+梯度,使氧化磷酸化解偶聯(lián),ATP合成降低,導(dǎo)致細(xì)胞代謝中的能量以鈉泵的途徑消耗和以熱能的形式釋放出來[7],可見UCP2在癌細(xì)胞中起到調(diào)節(jié)能量代謝的作用。

穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide)是一種從藥用植物穿心蓮(Andrographispaniculata)中分離出的二萜內(nèi)酯,具有抗炎[8-9]、肝保護(hù)[10]和抗感染[11]作用。近年來,穿心蓮內(nèi)酯的抗癌作用引起研究者的廣泛關(guān)注[12-13],在抑制腫瘤遷移與侵襲方面,穿心蓮內(nèi)酯能夠通過促細(xì)胞凋亡抑制腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞的遷移能力[14]；對于胃癌細(xì)胞來說,穿心蓮內(nèi)酯可能通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑的表達(dá)并降低MMPs的表達(dá)和活性來抑制其增殖和遷移[15]；在以往研究中,穿心蓮內(nèi)酯主要通過抑制MMPs來抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲[16]。本文旨在研究穿心蓮內(nèi)酯是否可以通過調(diào)節(jié)UCP2抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

穿心蓮內(nèi)酯(江西青峰藥業(yè))；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物)；二甲亞砜(DMSO,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；青霉素、鏈霉素(新賽美生物科技有限公司)；Matrigel膠(美國Corning公司)；TBST(北京索萊寶科技有限公司)；甲基噻唑基四唑(MTT,美國Amresco公司)；JC-1探針(德國Sigma-Aldrich 公司)；Trizol試劑(美國Ambion公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix(日本TaKaRa公司)；SYBR Green染料(北京天根生化科技有限公司)；BeyoClickTMEdU-488試劑盒(上海碧云天生物公司)；乳酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；β-肌動蛋白小鼠單克隆抗體、UCP2兔單克隆抗體(上海碧云天生物公司)；PDH兔單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗(武漢三鷹生物公司)；乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購于上海中喬新舟公司。

1.2 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海賽默飛公司)；SW-CJ-2FD型雙人超凈工作臺(上海蘇凈實業(yè)有限公司)；Mini-PROTEIN 3電泳系統(tǒng)、Bio-RAD 525電泳儀(美國Bio-RAD公司)；TS100 Nikon 倒置相差顯微鏡、Ti-E顯微鏡活細(xì)胞工作站(日本Nikon公司)；Spectra MaxGemini酶標(biāo)儀(美國Molecular Device公司)；Sigma 1-13高速臺式離心機(jī)(德國Sigma公司)。

1.3 藥物處理

稱取適量穿心蓮內(nèi)酯,用DMSO稀釋成100 mmol/L的母液,保存于4 ℃冰箱,母液僅可使用1周。進(jìn)行實驗時,將母液用培養(yǎng)基稀釋1 000倍后配成需要的藥物濃度進(jìn)行細(xì)胞處理。

1.4 MTT法檢測MDA-MB-231細(xì)胞活力

將MDA-MB-231細(xì)胞(5×104/mL)接種于96孔板中,每孔100 μL細(xì)胞懸液,待貼壁后給藥組分別加入不同濃度穿心蓮內(nèi)酯(0,5,10,20,40和80 μmol/L),對照組僅更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔加入100 μL的 MTT溶液(1 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清液,每孔再加入100 μL的DMSO,放置搖床直至藍(lán)紫色結(jié)晶消失,并使用酶標(biāo)儀在562 nm處測量光密度(D)值,計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(D給藥組-D空白組)/(D對照組-D空白組)×100%

1.5 BeyoClickTM EdU-488試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力

將處于對數(shù)生長的細(xì)胞(5×104/mL)接種于24孔板中,每孔500 μL,培養(yǎng)24 h,待貼壁后分別加入不同濃度穿心蓮內(nèi)酯(0,5,10,20,40和80 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)24 h,給藥結(jié)束后用移液槍將24孔板中原有培養(yǎng)基吸掉375 μL后加入 125 μL EdU工作液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h后,去掉板內(nèi)的培養(yǎng)基,加入1 mL 4%的多聚甲醛室溫固定15 min。每孔加入1 mL洗滌液洗滌細(xì)胞3次,每次3～5 min,再加入1 mL通透液,室溫孵育15 min。再次洗滌細(xì)胞后每孔加入100 μL的Click反應(yīng)液室溫避光孵育30 min。用移液槍吸除Click反應(yīng)液,洗滌細(xì)胞后每孔加1×Hoechst 33342溶液250 μL,室溫避光孵育10 min。再次洗滌后每孔加入500 μL PBS,將24孔板置于倒置熒光顯微鏡下拍照,以熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞增殖情況。

1.6 傷口愈合實驗檢測細(xì)胞遷移能力

將處于對數(shù)生長的細(xì)胞(5×104/mL)接種于6孔板中,待其鋪滿皿底后用10 μL移液管尖端制成恒定寬度的劃痕,用PBS洗滌細(xì)胞2次以除去懸浮的細(xì)胞,不同濃度穿心蓮內(nèi)酯(0,10,20,40 μmol/L)作用于細(xì)胞,分別在給藥后0,12,24 h于倒置顯微鏡下拍照,計算不同時間的劃痕寬度。Δ劃痕寬度(μm)=0 h劃痕寬度(μm)-12 h或24 h劃痕寬度(μm)。

1.7 Transwell小室實驗檢測細(xì)胞侵襲能力

取不同濃度穿心蓮內(nèi)酯(0,10,20,40 μmol/L)處理24 h后的細(xì)胞,用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞混懸液作為上室,每小室加200 μL,預(yù)先用Matrigel凝膠覆蓋板底的24孔板作為下室,每孔加500 μL含10% FBS DMEM培養(yǎng)基,37 ℃孵育24 h后取出 Transwell 小室,棄去孔中培養(yǎng)液,PBS洗2遍,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞,再用4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色1 h,PBS清洗至溶液澄清,高倍顯微鏡下每個濃度選擇5個視野計數(shù)并取平均值,計算經(jīng)不同濃度穿心蓮內(nèi)酯作用后,侵入到下室的細(xì)胞數(shù)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡檢測細(xì)胞UCP2和PDH蛋白水平

用不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯(0,10,20,40 μmol/L)處理后提取細(xì)胞總蛋白,進(jìn)行蛋白定量后,加入5×SDS凝膠上樣緩沖液,煮沸5 min。將等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行15% SDS-PAGE,并將分離的蛋白質(zhì)遷移到PVDF膜上。使用脫脂奶粉(5%)將膜封閉1 h,并將UCP2及PDH抗體以1∶ 1 000稀釋度4 ℃過夜,TBST洗3次,二抗室溫孵育1 h,TBST 清洗3次,ECL發(fā)光液發(fā)光,Minichemi 發(fā)光成像儀曝光,并使用Quantity One軟件分析蛋白相對灰度值。

1.9 RT-PCR檢測細(xì)胞UCP2 mRNA表達(dá)

使用Trizol試劑提取總RNA,用PrimeScriptTMRT Master Mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照說明書操作,使用SYBR Green染料進(jìn)行RT-PCR。引物序列如下,GAPDH上游:5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′,下游:5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；UCP2上游:5′-GTGGTCAAGACGAGATACATGA-3′,下游5′-CTGCT-CATAGGTGACGAACATC-3′。熱循環(huán)反應(yīng):95 ℃持續(xù)10 min,95 ℃循環(huán)40次,每次15 s,60 ℃延伸1 min。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法計算相對表達(dá)量。

1.10 乳酸試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)乳酸含量

將MDA-MB-231細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng),穿心蓮內(nèi)酯(0,10,20,40 μmol/L)處理24 h后,按照乳酸試劑盒說明書操作,將樣品充分混勻,37 ℃反應(yīng)30 min,置于1 cm玻璃比色皿中,空白管調(diào)零,用可見分光光度計測定530 nm處D值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計算樣品細(xì)胞內(nèi)乳酸含量。乳酸含量(mmol/L)=(樣品D值-空白D值)/(標(biāo)準(zhǔn)D值-空白D值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L)×樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.11 JC-1探針染色檢測線粒體膜電位

將MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板中,用不同濃度穿心蓮內(nèi)酯(0,10,20,40 μmol/L)處理24 h后,每孔加入100 μL 稀釋后的JC-1探針(5 g/L),37 ℃、5% CO2避光孵育30 min,通過熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長488 nm/發(fā)射波長535 nm用于JC-1綠色,激發(fā)波長488 nm/發(fā)射波長595 nm用于JC-1紅色),用紅、綠熒光比值反映線粒體膜電位。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯對MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞存活率的影響

與0 μmol/L組相比,5 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯的細(xì)胞存活率為79.99%(t=10.42,P<0.05)。隨著濃度的升高,細(xì)胞存活率逐漸降低；當(dāng)穿心蓮內(nèi)酯濃度為10,20,40,80 μmol/L時,細(xì)胞存活率分別為64.73%,43.55%,26.27%,24.83%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.91,t=57.75,t=64.02,t=80.08,P均<0.01),通過軟件計算可得IC50為22.36 μmol/L。見圖1。

a:P<0.05,b:P<0.01,與0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組比較圖1 穿心蓮內(nèi)酯對MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

除80 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯對細(xì)胞有明顯的抑制作用外(t=7.257,P<0.05),5,10,20,40 μmol/L組對細(xì)胞均無顯著的抑制作用。結(jié)合MTT結(jié)果,其IC50為22.36 μmol/L,即選擇10,20,40 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行后續(xù)實驗。見圖2。

Hoechst染細(xì)胞核,EdU染細(xì)胞內(nèi)的DNAa:P<0.05,與0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組比較圖2 穿心蓮內(nèi)酯對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響(×20)

2.3 穿心蓮內(nèi)酯對MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響

在單層培養(yǎng)細(xì)胞間制作劃痕以產(chǎn)生愈傷區(qū)域,然后觀察該傷口周圍細(xì)胞向劃痕遷移的現(xiàn)象,即傷口愈合。細(xì)胞遷移能力越弱,意味著傷口愈合速度減慢,也就是劃痕寬度減少。傷口愈合實驗結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的增加或處理時間延長,其細(xì)胞的傷口愈合速度逐漸減慢；給予不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯后,Transwell小室結(jié)果顯示,MDA-MB-231細(xì)胞侵襲到下室的數(shù)量隨著藥物濃度的增加逐漸減少(t=5.237,P<0.05；t=12.66,P<0.01；t=18.08,P<0.01)。見圖3。

a:P<0.05,b:P<0.01,與0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組比較；標(biāo)尺=100 μm圖3 穿心蓮內(nèi)酯對MDA-MB-231細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響

2.4 穿心蓮內(nèi)酯對UCP2 mRNA以及蛋白表達(dá)的影響

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫查到人UCP2的編碼為PDB:2LCK,使用AutoDock 4.2程序進(jìn)行分子對接,通過計算機(jī)分子模擬顯示,穿心蓮內(nèi)酯與UCP2有一定的結(jié)合力,且與UCP2的Gly151結(jié)合力較強(qiáng)。隨后收集穿心蓮內(nèi)酯(0,10,20,40 μmol/L)處理的蛋白和RNA檢測UCP2的表達(dá)水平。RT-PCR結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的升高,UCP2mRNA表達(dá)下調(diào)(t=7.267,P<0.05；t=24.23,P<0.01；t=15.53,P<0.01)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示,不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯(0,10,20,40 μmol/L)處理細(xì)胞24 h后,實驗組中UCP2的蛋白表達(dá)下調(diào)(t=9.435,P<0.05；t=14.76,P<0.01；t=19.73,P<0.01)。見圖4。

a:P<0.05,b:P<0.01,與0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組比較圖4 穿心蓮內(nèi)酯對UCP2 mRNA以及蛋白表達(dá)的影響

2.5 穿心蓮內(nèi)酯對MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞能量代謝的影響

給予穿心蓮內(nèi)酯(0,10,20,40 μmol/L)后,與0 μmol/L組相比,細(xì)胞內(nèi)乳酸水平降低(t=7.559,P<0.05；t=10.04,P<0.05；t=19.4,P<0.01)；細(xì)胞的紅綠熒光比呈顯著性升高(t=11.74,P<0.05；t=8.416,P<0.05；t=30.51,P<0.01)。此外,蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示,實驗組中PDH蛋白表達(dá)上調(diào)(t=8.012,t=11.07,t=11.69,P均<0.05),提示MDA-MB-231細(xì)胞的氧化磷酸化水平升高。見圖5。

a:P<0.05,b:P<0.01,與0 μmol/L 穿心蓮內(nèi)酯組比較圖5 穿心蓮內(nèi)酯對MDA-MB-231細(xì)胞能量代謝的影響

3 討論

惡性腫瘤細(xì)胞代謝的重要特征之一就是以糖酵解作為主要的能量獲取方式,主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)化生成的丙酮酸通過乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)變成乳酸,供自身合成時的能量需要,這種代謝方式稱為Warburg效應(yīng)[17]。三陰性乳腺癌可以利用糖酵解產(chǎn)生的大量乳酸促進(jìn)遷移與侵襲能力,使其死亡率較其他類型乳腺癌高。因此,探究通過調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌代謝方式來抑制其遷移與侵襲能力成為研究的重點方向。

本研究首先通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn),穿心蓮內(nèi)酯在較低濃度下能夠抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的活力,通過EdU試劑盒檢測可以看出高濃度的穿心蓮內(nèi)酯(40 μmol/L)不會抑制細(xì)胞的增殖作用,并且傷口愈合以及Transwell小室實驗初步證明了穿心蓮內(nèi)酯可以抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移與侵襲能力。

Pelicano等[18]研究表明,與非三陰性乳腺癌細(xì)胞相比,三陰性乳腺癌細(xì)胞的耗氧量顯著降低,而葡萄糖的攝取和乳酸的產(chǎn)生則顯著增加,說明糖酵解在三陰性乳腺癌中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明,穿心蓮內(nèi)酯能夠下調(diào)三陰性乳腺癌細(xì)胞內(nèi)乳酸含量,并且用穿心蓮內(nèi)酯處理后的細(xì)胞線粒體膜電位升高,PDH的蛋白表達(dá)升高,PDH表達(dá)的上調(diào)預(yù)示著有較多的丙酮酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化磷酸化,穿心蓮內(nèi)酯改善了乳腺癌細(xì)胞的代謝方式。因此推測穿心蓮內(nèi)酯抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力可能是通過下調(diào)糖酵解實現(xiàn)的。

UCP2作為線粒體內(nèi)膜上的解偶聯(lián)蛋白,在許多人類癌癥中高表達(dá),包括胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和皮膚癌[19]。Ohkouchi等[20]研究表明,UCP2在腫瘤中的高表達(dá)能夠提高腫瘤利用糖酵解水平,促進(jìn)其生成更多的乳酸。而利用葡萄糖類似物2-脫氧葡萄糖作用于UCP2過表達(dá)的HCT116細(xì)胞,則明顯抑制了腫瘤細(xì)胞糖酵解進(jìn)程,從而抑制腫瘤細(xì)胞生長[21]。由此可見,UCP2參與腫瘤細(xì)胞的能量代謝與糖酵解密切相關(guān)。

為進(jìn)一步探究這種下調(diào)糖酵解作用是否與UCP2相關(guān),本研究采用分子對接軟件分析,發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯能與UCP2的多個蛋白位點結(jié)合,其中與Gly151結(jié)合力最強(qiáng)。RT-PCR以及蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明,穿心蓮內(nèi)酯處理后的細(xì)胞UCP2mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)。因此推測穿心蓮內(nèi)酯下調(diào)糖酵解的作用可能與UCP2有關(guān)。

綜上所述,穿心蓮內(nèi)酯可能通過抑制三陰性乳腺癌的糖酵解和改變能量代謝的方式抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移與侵襲,其機(jī)制可能與UCP2有關(guān)。