雨生紅球藻培養(yǎng)基篩選及誘導(dǎo)條件優(yōu)化

張勇 李林品 吳秋瑾

摘要：目的：本文通過篩選有利于雨生紅球藻營養(yǎng)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，優(yōu)化雨生紅球藻內(nèi)蝦青素的積累條件。方法：選用7種培養(yǎng)基對(duì)4株雨生紅球藻分別進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)篩選出最適于4種藻株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。探究雨生紅球藻在光脅迫、缺氧、高鹽3種條件下誘導(dǎo)蝦青素積累情況。結(jié)果：4個(gè)不同雨生紅球藻藻株在配方A培養(yǎng)基中的生物量比其他6種試驗(yàn)培養(yǎng)基的生物量高1.54-6.29倍;在優(yōu)勢(shì)培養(yǎng)基配方A中，HP3的生物量最大，可達(dá)到6.03×106個(gè)/mL;HP3在缺氮的脅迫條件下，蝦青素產(chǎn)量最高，可達(dá)到20.96mg/L，比光誘導(dǎo)獲得的最佳蝦青素產(chǎn)量高0.96倍，比高鹽獲得的最佳蝦青素產(chǎn)量高1.53倍。結(jié)論：該研究中最適于試驗(yàn)藻株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是配方A，當(dāng)脅迫條件為缺氮9%時(shí)蝦青素積累量最大。

關(guān)鍵詞：雨生紅球藻;蝦青素;培養(yǎng)基篩選;誘導(dǎo)條件優(yōu)化

近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對(duì)健康的意識(shí)也在不斷提高。水是水生生物中最重要的組成部分之一。雨生紅藻具有良好的生物學(xué)特性，營養(yǎng)價(jià)值高及無毒等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有前景的生物可以利用資源。雨生紅藻是自然界中廣泛存在的綠藻，屬于團(tuán)藻目紅藻科。雨生紅藻又被稱為湖生紅藻或湖生雪球藻，被公認(rèn)為自然界中生產(chǎn)天然蝦青素的最好生物，因此利用該藻菌提取蝦青素具有很大的應(yīng)用前景已經(jīng)成為當(dāng)前國際研究的熱點(diǎn)。

蝦青素是一種天然的水溶性高分子化合物，具有生物活性。主要存在于藻類、細(xì)菌以及各種植物中。在自然界中，有許多氨基酸被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用到生產(chǎn)生活與食品領(lǐng)域上;蝦類可以作為營養(yǎng)添加劑和保健品等;同時(shí)也可利用其自身所具備的酶特性來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值以增強(qiáng)對(duì)微生物生長(zhǎng)發(fā)育影響而發(fā)揮作用。目前在我國研究較多的是蝦類中提取出來魚粉和甲殼素兩種物質(zhì)作為提取蝦青素原料，但這種方法對(duì)環(huán)境要求較高，且易受菌種的影響。而雨生紅球藻作為提取蝦青素的一種重要來源，在很多領(lǐng)域有著巨大價(jià)值。例如：美容化妝、健康保健、農(nóng)業(yè)飼料中具有很大的價(jià)值，并且也取得了很好效果。

蝦青素是一種天然的抗氧化物質(zhì)，有很強(qiáng)的清除氧自由基能力，可以防止重金屬離子在體內(nèi)富集。目前我國對(duì)蝦類色素主要為酚酸功能型和水溶性非揮發(fā)性合成物型兩大類型;而美國、日本等國家則將其作為食品添加劑使用或直接食用。我國于20世紀(jì)80年代開始對(duì)蝦青素進(jìn)行了研究開發(fā)并投入生產(chǎn)，但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及人們生活水平的提高，對(duì)于健康問題越來越重視起來，而水溶性非揮發(fā)性合成物型和可生物降解性物質(zhì)的研究也日益受到關(guān)注。

在自然界中，紅球藻是一種非常常見的生物，具有很強(qiáng)的生物學(xué)功能和營養(yǎng)價(jià)值。因?yàn)橛晟t球藻能提供大量氮、磷等多種無機(jī)鹽及其他微量元素。所以可以作為優(yōu)質(zhì)餌料;還能夠有效調(diào)節(jié)水體PH值以及微生物生長(zhǎng)繁殖環(huán)境條件等等這些作用都被充分利用起來。因此可以通過培養(yǎng)來篩選出優(yōu)良種質(zhì)資源之一，從而為海洋生態(tài)系統(tǒng)創(chuàng)造良好的生存空間與生態(tài)平衡，促進(jìn)其更好地發(fā)展和保護(hù)生態(tài)環(huán)境發(fā)揮重要作用。

1?資料與方法

1.1?培養(yǎng)條件

目前，國內(nèi)外對(duì)雨生紅球藻的培養(yǎng)技術(shù)主要分為兩種：一種是直接利用藻基質(zhì)中所富含的氮元素;另一種則是從通過不同方法將各種藻類進(jìn)行光合作用。在我國很多地區(qū)都有大量使用，但大多數(shù)都是以自然方式作為其生長(zhǎng)繁殖條件。其中最常見的是人工授粉、浸種和滴灌等三種培育基形式以及混合誘導(dǎo)體系（即單因素培養(yǎng)、多因素聯(lián)合培養(yǎng)或混成分培植），但每種培養(yǎng)基都有其自身的特點(diǎn)，且在不同環(huán)境條件下，所表現(xiàn)出來的效果也是不相同。

1.2?篩選時(shí)期培養(yǎng)

在篩選的過程中，要根據(jù)不同藻類生長(zhǎng)所需營養(yǎng)成分和數(shù)量要求進(jìn)行合理地選擇。一般情況下，可以通過培養(yǎng)基形狀大小、顏色以及細(xì)胞形態(tài)等方面來確定。對(duì)于一些具有特殊生理活性或某些特性的菌株來說其需要經(jīng)過一定周期才能達(dá)到目的;而有些微生物則不能直接利用這些微生物產(chǎn)生有害物質(zhì)或者對(duì)環(huán)境造成污染危害等等，因此在篩選過程中要盡可能避免分離現(xiàn)象發(fā)生，提高微生物的生長(zhǎng)速度。在選擇培養(yǎng)基時(shí)，要考慮到不同種藻類所需營養(yǎng)成分，以及各種因素對(duì)其影響。在實(shí)驗(yàn)中，雨生紅球藻的培養(yǎng)數(shù)量為（2.00×104個(gè)/mL），培養(yǎng)溫度為（23±1）℃，光照強(qiáng)度（1400-1700lx），光照時(shí)間為12h/12h（光/暗），氣體條件為3%（CO2/air，v/v），存放于500mL的器皿中，器皿盛放400mL的培養(yǎng)基。

1.3?條件設(shè)定

首先，需要使用配方A培養(yǎng)HP3藻株。培養(yǎng)條件：溫度（23±1）℃，光照強(qiáng)度為（1400-1700lx），光照時(shí)間為12h/12h（光/暗），氣體條件為3%（CO2/air，v/v），將HP3藻株存放于1000mL的器皿中，器皿盛放700mL藻液。在培養(yǎng)15天后，采用離心技術(shù)（4000r/min，10min）收集藻類細(xì)胞，脅迫濃度5×105-6×105個(gè)/mL，其他條件不變。

在進(jìn)行脅迫研究的過程中，本試驗(yàn)選取缺氮、光照以及高鹽進(jìn)行研究和分析，在研究光照的過程中，設(shè)置不同的光照梯度，例如：8000、10000、12000lx;另外，在研究高鹽脅迫的過程中，需要在光照12000lx的基礎(chǔ)上進(jìn)行分析，在培養(yǎng)基A中加入NaAc，并且設(shè)置不同濃度梯度，例如：20、30、40、50mmol/L;研究缺氮脅迫的方法與高鹽脅迫方法類似，也是需要在光照12000lx的基礎(chǔ)上進(jìn)行研究，將配方A中加入NaNo3原含氮量4mmol/L調(diào)整為培養(yǎng)基4%、8%、12%、16%，不同的脅迫條件進(jìn)行對(duì)比。

1.4?色素提取與測(cè)定

色素細(xì)胞提取的方法有很多種，但是目前常用的提取劑還是水蘇醇提法、堿溶酸沉凝等。堿溶液浸?。豪肗aOH與堿性磷酸氫二鉀進(jìn)行反應(yīng)生成氫氧化鈉和碳酸鈉來除去水中雜質(zhì)離子，然后通過分光光度儀測(cè)定其吸光度;根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以判斷出pH值在4-5之間時(shí)色素細(xì)胞濃度較低甚至為零或極低于10-6mg/L即可達(dá)到培養(yǎng)基要求。

1.5?蝦青素測(cè)定

稱取0.25gNaOH，并加入4.75mL雙蒸水，制得5%溶液待用;取藻液5mL，離心后沉淀，加入700ul?5%NaOH溶液和300ul甲醇，混勻，放入65℃水中15min去除葉綠素，冷卻后離心收集沉淀，隨后用雙蒸水洗滌，加入1mL?DMSO，并在65℃水中加熱5min，隨后冷卻離心，收集上清液，反復(fù)用DMSO提取基本無色，并定容與5mL。

2?結(jié)果

2.1?培養(yǎng)基篩選

在篩選過程中，需要對(duì)所選培養(yǎng)基成分進(jìn)行分析，篩選出符合實(shí)驗(yàn)要求的優(yōu)良基因。試驗(yàn)首先通過單因素法確定出紅球藻細(xì)胞必需生長(zhǎng)量、pH值以及溫度等條件;然后將選擇好后的培養(yǎng)基的接種到離心管中加入適量穩(wěn)定劑并設(shè)置攪拌器和壓塊以保證其均勻性及穩(wěn)定性;其次在篩選過程中將要控制變量濃度，因?yàn)榘l(fā)酵液會(huì)與水發(fā)生反應(yīng)生成沉淀物從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此控制變量濃度是非常重要;最后在pH值、溫度以及等條件均不變時(shí)，將雨生紅球藻培養(yǎng)基和純化后得到的混合型生物藻類所需要添加量進(jìn)行對(duì)比，篩選出符合實(shí)驗(yàn)要求且營養(yǎng)豐富、生長(zhǎng)繁殖旺盛且具有較高生物學(xué)價(jià)值優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)基，并且將純化后得到的混合型生物藻類所需要添加量控制在10-12mg/L，且pH值、溫度及等條件均不變時(shí)，分別加入5g和7ml這兩種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。HP1細(xì)胞數(shù)目最多為6.44×106個(gè)/mL。改良后，細(xì)胞數(shù)目最低為1.73×106個(gè)/mL;HP2細(xì)胞數(shù)目為5.44×106個(gè)/mL，OHM細(xì)胞數(shù)目2.56×106個(gè)/mL;HP3細(xì)胞數(shù)目最多為7.19×106個(gè)/mL，是改良MCM后的7.29倍。如圖1所示。

2.2?蝦青素誘導(dǎo)

蝦青素是一種天然的綠色抗氧化劑，能夠抑制細(xì)胞中各種核酸和蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜上發(fā)生氧化反應(yīng)。其主要來源為水溶性氨基酸、肽鍵或其他化合物。由于這種物質(zhì)具有很強(qiáng)的生物穩(wěn)定性，所以可以利用這個(gè)特性來進(jìn)行篩選培養(yǎng)基成分及單糖含量較高或者不溶于水中等多種酶系而被廣泛使用;另外還能與亞硝酸根離子結(jié)合形成抗?fàn)I養(yǎng)因子和降低細(xì)胞的低聚物誘導(dǎo)生長(zhǎng)發(fā)育，提高細(xì)胞的抗氧化能力。然而，在實(shí)際生產(chǎn)操作中，有許多因素都影響了其結(jié)果。如pH、溫度和光照等;而本實(shí)驗(yàn)以水溶性生物堿作為培養(yǎng)基成分并通過正交試驗(yàn)篩選出雨生紅球藻為誘餌進(jìn)行篩選及誘導(dǎo)條件優(yōu)化是非常具有現(xiàn)實(shí)意義的方法之一。

通過研究表明，光照強(qiáng)度10000lx下，類胡蘿卜素最高為12.10mg/L;10000lx條件下，高鹽9d后，30mmol/L?NaAc類胡蘿卜素最高為8.91mg/L，50mmol/L?NaAc最低為5.87mg/L;10000lx下，缺氮9d后，類胡蘿卜素梯度為10%（21.35mg/L）、5%（20.24mg/L）、15%（17.51mg/L）、20%（13.13mg/L）。如圖2所示。

3討論

目前，對(duì)雨生紅藻的研究主要集中于其生物特性以及環(huán)境適應(yīng)性等。生物學(xué)方面：在生物界中，許多學(xué)者都發(fā)表了大量關(guān)于如何利用與開發(fā)和提高對(duì)植物生長(zhǎng)影響因素進(jìn)行試驗(yàn)或研究的理論論文、實(shí)驗(yàn)報(bào)告及相關(guān)文獻(xiàn);而對(duì)于一些已經(jīng)有一定規(guī)模并且具有代表性并能取得較好經(jīng)濟(jì)效益且可以應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的雨生紅球藻資源來說，其研究也是非常重要，且有很高的研究?jī)r(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以雨生紅藻為材料，利用pH法和紅外光譜等方法，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)的方式來確定最佳培養(yǎng)基。結(jié)果表明：在影響雨生紅球藻生長(zhǎng)環(huán)境條件（溫度、光照強(qiáng)度及氮磷比）中選取三種最為適宜的初始濃度;其次是梯度處理下不同時(shí)間段光照度對(duì)其生物量以及產(chǎn)量均有很大程度上不同變化;最后則是從pH值和紅外光譜反應(yīng)得到最適酸堿度，從而達(dá)到比較好地效果，即pH值在0-9時(shí)，其生物量最高，紅外光譜反應(yīng)則為最適偏酸堿度。通過對(duì)不同初始濃度和時(shí)間下的雨生紅球藻培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比分析得出結(jié)論：當(dāng)pH大于8且氮磷比小于4時(shí)才會(huì)出現(xiàn)較好地變化。

在雨生紅藻培養(yǎng)基中，最重要的就是篩選，而如何選擇合適的培養(yǎng)基的成為了一個(gè)難點(diǎn)。首先是要對(duì)不同濃度（如：磷、鉀等）和pH值下生長(zhǎng)良好并符合要求較高溫度和光照強(qiáng)度大且無毒性物質(zhì)污染水體。因?yàn)樗旧砭哂腥鯄A性或強(qiáng)酸性。所以可以通過改變氮肥比例或者在一定條件下使pH降低來達(dá)到去除水中含有的鉛離子，使水體中的鉛離子濃度降低;其次是對(duì)不同pH值下培養(yǎng)基的優(yōu)化。通過實(shí)驗(yàn)?zāi)M研究得出最適合雨生紅率生長(zhǎng)條件;最后就是根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析出合適量與PH梯度相同時(shí)間段來確定其最佳操作方法及參數(shù)范圍，為以后雨生紅率的生長(zhǎng)和培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

在自然界中，水藻生物作為一種重要的植物，是其主要生長(zhǎng)環(huán)境。由于各種原因?qū)е掠晟t球藻不能大量繁殖。因此要將其利用起來就要有一定量的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選和培育以適應(yīng)各種不同種類與數(shù)量以及所需氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素含量豐富多變而具有較高產(chǎn)量?jī)r(jià)值且適合工業(yè)化生產(chǎn)條件要求（如：高溫下發(fā)酵）;其次，還可以在合適季節(jié)對(duì)水藻進(jìn)行處理使其能夠快速生長(zhǎng)發(fā)育。根據(jù)研究結(jié)果表明，雨生紅藻可以通過生物法、化學(xué)合成以及物理處理三種途徑來培養(yǎng)，其中最主要的方式是利用其生長(zhǎng)條件和營養(yǎng)元素等方面進(jìn)行篩選，篩選得到最佳培養(yǎng)基，從而為其后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)，使其能在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)揮更好作用。

蝦青素是一種在自然界中含量豐富、具有生物活性的天然高分子化合物，其廣泛存在于植物當(dāng)中，在水產(chǎn)品加工和醫(yī)藥領(lǐng)域有著重要意義。然而隨著科技發(fā)展及人類生活水平提高以及食品安全問題的日益突出使得人們對(duì)食物健康質(zhì)量提出了越來越高標(biāo)準(zhǔn)。而超強(qiáng)抗氧化性是指能清除自由基并防止細(xì)胞衰老或破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)從而達(dá)到延長(zhǎng)壽命等一系列要求;另外還包括具有很強(qiáng)耐受脅迫作用、不改變營養(yǎng)成分，且對(duì)人體無害的特性。因此，超強(qiáng)抗氧化性是食品安全問題中最重要因素之一。而藻酸鹽就是其中一種天然生物活性成分，在自然界和生活當(dāng)中都有廣泛存在的應(yīng)用。

蝦青素是一種廣泛存在于自然界的天然高分子化合物，含有大量氨基酸、維生素等，具有一定生物活性。在很多領(lǐng)域都有應(yīng)用。近年來人們對(duì)其提取分離純化方法進(jìn)行了研究和探索性探討發(fā)現(xiàn)：用超濾法、水相萃取技術(shù)處理得到的魚鱗狀海藻紅球蛋白可用于食品行業(yè)中;利用蝦青素來作為抗氧化物質(zhì)添加劑應(yīng)用于化妝品行業(yè)，使之達(dá)到安全標(biāo)準(zhǔn)并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn);利用超濾技術(shù)可用于提取生物堿，使其在化妝品中的應(yīng)用更廣。

4?總結(jié)

近年來，隨著生物技術(shù)的迅捷發(fā)展，在水環(huán)境中，各種類型藻類不斷地應(yīng)運(yùn)而生。目前我國很多地區(qū)都建立了大量的人工濕地。但是由于缺乏相應(yīng)配套設(shè)施和管理體制等因素影響下無法大面積種植雨生紅球藻種源及產(chǎn)量;其次是由于雨生條件對(duì)生物材料生長(zhǎng)所造成阻礙導(dǎo)致許多種類細(xì)菌繁殖速度慢、質(zhì)量差甚至死亡現(xiàn)象嚴(yán)重等等一系列問題也制約著其生產(chǎn)應(yīng)用，因此，如何提高雨生紅球藻的產(chǎn)量和質(zhì)量成為當(dāng)前急需解決的問題，而誘導(dǎo)條件則是實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵，是實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵。

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作者簡(jiǎn)介：張勇（1971—??），男，漢族，上海人，博士，高級(jí)經(jīng)濟(jì)師，研究方向：雨生紅球藻產(chǎn)業(yè)化。