黃芪/淫羊藿多糖微針制備及免疫效果分析

張學(xué)柏 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730050

微針作為一種新型的經(jīng)皮免疫技術(shù)，具有高效、無痛、安全的特點(diǎn)，能打破角質(zhì)層對(duì)藥物的阻滯作用，提高遞送效率，可用于疫苗遞送[1-2]。微針可分為固體微針、涂布微針、中空微針和可溶性微針。其中可溶性微針的制備材料具有生物相容性的優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)可溶性微針刺入皮膚后針體可以溶解在組織中也不會(huì)給皮膚增加負(fù)擔(dān)。可溶性微針也存在力學(xué)性能較差等問題[3]。目前，可溶性微針的制備方法有兩種，一種方法是將基質(zhì)溶化與所需藥物一起倒入模具中，將模具置于真空條件下，在一定溫度下持續(xù)一定時(shí)間，干燥后即可得到載藥的可降解微針，另一種方法是將藥物和基質(zhì)加入溶劑中，蒸發(fā)除去部分溶劑后，澆入模具中，高速離心，使藥物和基質(zhì)充分填滿模具的空間，采用適當(dāng)?shù)母稍飾l件干燥使其慢慢固化，脫模即成[4]。

研究采用真空法制備聚乙烯吡咯烷酮（PVP）/黃芪多糖微針和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）/淫羊藿多糖微針，通過對(duì)其成型性、機(jī)械強(qiáng)度和免疫效果進(jìn)行分析，以期制備出以中藥多糖為主要材料的微針。

1 試驗(yàn)與方法

1.1 試劑與儀器

黃芪/淫羊藿，甘肅蘭州黃河中藥材市場(chǎng)；聚乙烯吡咯烷酮（分析純），合肥巴斯夫生物科技有限公司；蔗糖（分析純），沈陽市新化試劑廠；吉林五星寵安士佳4聯(lián)疫苗，飄揚(yáng)貓咪寵物醫(yī)院；Vero細(xì)胞，賽默飛世爾科技有限公司；所有其他化學(xué)品均為分析級(jí)，無需進(jìn)一步純化。SD大鼠，雄性，180 g-220 g，SPF級(jí)，購自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

恒溫水浴鍋（B-220型），上海亞榮生化儀器廠；磁力攪拌器（ZF-7），江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；光學(xué)顯微鏡（XSP-3CB），上海光學(xué)儀器一廠；體式顯微鏡（Stemi305），北京普瑞賽司儀器有限公司；真空干燥箱（DZF-6020），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；拉力機(jī)（SMT-5000），揚(yáng)州市賽思檢測(cè)設(shè)備有限公司；冷凍干燥機(jī)(FD-1A-50)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；酶標(biāo)分析儀（DNM9206A），北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.2 黃芪多糖/淫羊藿多糖的提取

分別稱取處理的黃芪根莖和淫羊藿莖葉置于燒杯中，在燒杯中加入80%乙醇（料液比1:10），80 ℃條件下，水浴加熱脫脂三次，每次3h。用四層醫(yī)用紗布將醇提液過濾掉，留下藥渣，將脫脂后的藥渣放入恒溫干燥箱中干燥。干燥好的藥渣繼續(xù)加入圓底燒杯中，并添加蒸餾水（料液比為1:10），在80℃下水浴提取三次，每次3h[5]。三次的提取液合并在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，除去底部沉淀后，將上清液繼續(xù)合并在一起，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮至一定體積，將濃縮液放置室溫，用Sevage法除蛋白，蛋白除完全后，將濃縮液置于透析袋中進(jìn)行透析，時(shí)間為3d，每24h更換一次去離子水，透析結(jié)束后將提前冷凍好的溶液放入冷凍干燥箱中冷凍干燥48h，最終得到初步純化的淫羊藿和黃芪多糖。

1.3 黃芪/淫羊藿多糖微針的制備及形態(tài)觀察

分別配置2%的黃芪/淫羊藿多糖溶液，25% PVP溶液，分別以黃芪/淫羊藿多糖溶液與PVP溶液體積比為1:1制備成混合溶液，并在混合溶液中添加0.15 g蔗糖。使用真空法，在室溫干燥的條件下制備黃芪/淫羊藿多糖微針，然后將黃芪多糖制備的可溶性微針命名為HQ-1，淫羊藿多糖制備的命名為YYH-1，使用光學(xué)顯微鏡和體視顯微鏡觀察微針的形態(tài)。

1.4 黃芪/淫羊藿多糖微針的機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定

使用拉力機(jī)測(cè)定微針的機(jī)械強(qiáng)度，分別將HQ-1，YYH-1針尖朝上放在下壓頭上，設(shè)置移動(dòng)速度為1 mm/min，測(cè)定不同比例下黃芪多糖微針的最大斷裂力度，選出具有最大機(jī)械強(qiáng)度的黃芪多糖微針，拉力機(jī)的力與位移會(huì)被記錄在電腦上，每個(gè)樣品測(cè)試三次。

1.5 黃芪/淫羊藿多糖微針的免疫效果試驗(yàn)

1.5.1 負(fù)載犬四聯(lián)疫苗的兩種多糖微針的制備本次購買的疫苗是犬疫苗，需將狗的藥用量換算成大鼠的藥用量。因此，采用動(dòng)物的體表面積計(jì)算法Meeh-Rubner氏公式進(jìn)行換算[6]：

A:體表面積[m2]；K:常數(shù)，K狗為11.2，K大鼠為9.1；W：體重[g]

稱取適量犬四聯(lián)疫苗粉末分別溶于提前制備好的兩種多糖混合液中混勻。用真空法制備微針，由于犬四聯(lián)疫苗的最適溫度為2–8℃，因此用真空法制備好微針后將微針放入4℃硅膠盒中干燥，干燥結(jié)束后取出，即得負(fù)載犬四聯(lián)疫苗的黃芪/淫羊藿多糖微針，記為QHQ-1和QYH-1，制備三組。

1.5.2 兩種多糖微針的免疫效果試驗(yàn)

試驗(yàn)采用SD雄性大鼠作為免疫效果評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型。首先，對(duì)SD大鼠腹腔注射10%的水合氯醛溶液（0.3 mL/100 g）進(jìn)行術(shù)前麻醉、固定，并用苦味酸進(jìn)行標(biāo)記。麻醉扎針時(shí)應(yīng)有落空感，回抽時(shí)無尿液或血液[7]。給大鼠背部剃毛并用75%酒精消毒，將制備好的HQ-1、YYH-1、QHQ-1、QYH-1分別用大拇指按壓1min，并用無菌紗布及彈性繃帶包扎，處理結(jié)束后將老鼠放入籠中觀察[8]。

將犬四聯(lián)疫苗干粉溶于PBS溶液中，攪拌均勻，對(duì)大鼠皮下注射。其中陽性對(duì)照組為皮下注，陰性對(duì)照組為HQ-1，空白對(duì)照組為不做任何處理的健康大鼠。初次免疫時(shí)間10d后對(duì)大鼠進(jìn)行眼眶取血，分離血清，存入-20℃冰箱中。繼續(xù)重復(fù)初次免疫的操作步驟，進(jìn)行二次免疫，20d后對(duì)大鼠進(jìn)行眼眶取血，分離血清，存入-20℃冰箱中。

犬四聯(lián)疫苗中包含犬瘟、細(xì)小、犬副流感、犬腺病毒四種，本實(shí)驗(yàn)選用犬四聯(lián)疫苗中的犬副流感作為檢測(cè)對(duì)象來檢測(cè)大鼠體內(nèi)的免疫效果。

1.6 細(xì)胞毒性檢測(cè)

分別配置淫羊藿多糖溶液，黃芪多糖溶液，PVP溶液，蔗糖溶液（每種溶液設(shè)置低，中，高三個(gè)濃度），分別記為Y-1、Y-2、Y-3、H-1、H-2、H-3、Z-1、Z-2、Z-3、P-1、P-2、P-3。

非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）的復(fù)蘇：Vero細(xì)胞活化后，加入DMEM培養(yǎng)基，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[9]。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 微針的形態(tài)觀察

通過在顯微鏡下觀察制備的兩種多糖微針，可以看到微針成四棱錐型，其中每個(gè)微針的針長為550 μm，針體底部尺寸為250×250 μm，相鄰每兩個(gè)針的針尖距離為600 μm，每個(gè)微針陣列的針體數(shù)目是225個(gè)，微針背襯部面積為9.5×9.5mm。并且微針的形態(tài)完整均一，微針的背襯部具有適當(dāng)?shù)暮穸群腿彳浶浴?/p>

2.2 機(jī)械強(qiáng)度分析

通過拉力機(jī)來測(cè)定微針的機(jī)械強(qiáng)度見圖1。由力與位移的受力圖可知，制備的微針具有一定的抗壓性能，隨著位移的增加，所受的力也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)微針完全破碎時(shí)，曲線會(huì)出現(xiàn)一個(gè)拐點(diǎn)，該點(diǎn)的力即為微針?biāo)艹惺艿淖畲髩毫?，隨后曲線呈直線上升。其中HQ-1的最大受力為768 N, YYH-1能承受的最大壓力為676 N，這表明所制備的微針具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，可以用于微針疫苗。

圖1 黃芪多糖微針圖（a）和淫羊藿多糖微針圖（b）的機(jī)械強(qiáng)度圖

2.3 免疫效果評(píng)價(jià)與分析

通過酶聯(lián)免疫間接法對(duì)微針進(jìn)行免疫效果的定性檢測(cè)，分別是QYH-1組，QHQ-1組，皮下注射組，HQ-1組，健康大鼠組，試劑盒中的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。結(jié)果顯示HQ-1組與健康大鼠組兩次免疫后測(cè)得血清的OD值幾乎沒有變化，均小于0.343，PIV-Ab呈陰性。QYH-1組，QHQ-1組和皮下注射組初次免疫后各有一組血清的OD值大于0.343，PIV-Ab呈陽性，且QYH-1組和QHQ-1組測(cè)得血清的OD值略高于皮下注射組血清的OD值。二次免疫后QYH-1組和QHQ-1組的血清OD值均大于0.343，PIV–Ab呈陽性，并且OD值明顯高于皮下注射組。這表明QYH-1和QHQ-1使大鼠產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，并且免疫效果高于皮下注射。黃芪多糖，淫羊藿多糖具有免疫增強(qiáng)作用，可能起到了佐劑的功效，這為黃芪多糖和淫羊藿多糖作為佐劑應(yīng)用在微針疫苗中提供了可能性。

2.4 細(xì)胞毒性結(jié)果分析

培養(yǎng)72 h后，H-1，H-2，H-3，Y-1，Y-2，Y-3，Z-1，Z-2，Z-3，P-1，P-2，P-3對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率分別為100.84±12.94%，69.94±15.87%，76.58±11.20%，65.9±15.14%，54.66 ±8.77%，217.12 ±38.15%，141.72±16.99%，126.7±20.92%，84.4 8 ±20.95%，290.5±42.87%，243.28±39.17%，1 47.32±21.86%，其中H-2，Y-1，Y-2的細(xì)胞存活率在50%～75%的范圍內(nèi)。根據(jù)細(xì)胞毒性的評(píng)級(jí)劃分2級(jí)，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)后，判為合格，其余的微針材料溶液根據(jù)細(xì)胞毒性的評(píng)級(jí)劃分0級(jí)或1級(jí)，判為合格。根據(jù)黃芪多糖，淫羊藿多糖，PVP，蔗糖溶液的低、中、高濃度的細(xì)胞毒性測(cè)量結(jié)果顯示，此次制備的黃芪多糖微針和淫羊藿多糖微針的水溶性材料無細(xì)胞毒性。

結(jié)語

淫羊藿多糖微針，其具有適當(dāng)?shù)臋C(jī)械強(qiáng)度和生物相容性，可以在大鼠體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。目前，市場(chǎng)上沒有黃芪多糖和淫羊藿多糖作為佐劑用于微針疫苗，研究對(duì)中藥多糖作為輔料兼佐劑用于微針疫苗及對(duì)微針疫苗的開發(fā)具有啟發(fā)意義。