異位子宮內(nèi)膜組織差異miRNAs 的生物信息學(xué)分析

馬蘭芳 曹莉莉 吳章穎 汪俊濤

1.貴陽市婦幼保健院婦產(chǎn)科，貴州貴陽 550001；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，貴州貴陽 550003

子宮內(nèi)膜異位癥好發(fā)于育齡期女性，是一種常見的慢性婦科疾病，簡稱內(nèi)異癥，在女性人群中，發(fā)病率約為11%[1]。臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的痛經(jīng)、不孕、性交痛、盆腔粘連等[2]。給女性帶來了極大的痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。病理表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜（腺體及間質(zhì)）生長于子宮腔以外的部位，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，存在多種學(xué)說[4-6]。微RNA（microRNA，miRNA）作為轉(zhuǎn)錄后水平的重要調(diào)控小分子RNA，是一類長度為19～24 bp的非編碼內(nèi)源性小分子RNA，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖分化、新陳代謝及細(xì)胞壽命等多個生物過程中發(fā)揮重要作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥患者的異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及血清中均存在miRNA 的差異表達(dá)[8]，且miRNA參與了內(nèi)異癥的病理生理過程，并且這些miRNA有望成為內(nèi)異癥診斷和治療的靶點[9-10]。近年來隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展和大量生物信息數(shù)據(jù)庫的建立，為研究內(nèi)異癥與miRNA 之間的關(guān)系提供了新的思路與方向。本研究從GEO 數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)miRNA 芯片數(shù)據(jù)集，從生物信息學(xué)的分析視角，探討miRNA 參與內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，尋找新的診斷和治療靶點。

1 資料與方法

1.1 miRNA 表達(dá)譜的來源

本研究從美國國立生物信息技術(shù)中心（National Center for Biotechnology information，NCBI）的GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“endometriosis”和“miRNA”為關(guān)鍵詞檢索獲得原始數(shù)據(jù)集GSE105765[11]。該數(shù)據(jù)集是基于平臺GPL11154 的miRNA 表達(dá)譜。該數(shù)據(jù)集包含8 個異位內(nèi)膜樣本和8 個配對的在位內(nèi)膜樣本。所有樣本均采用R 語言軟件進(jìn)行miRNA 差異表達(dá)分析。

1.2 差異表達(dá)的miRNA 分析

運行R 語言腳本讀取從GEO 數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)集，同時對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一標(biāo)準(zhǔn)化。通過R 語言函數(shù)和limma 軟件包對標(biāo)準(zhǔn)化后的芯片表達(dá)譜進(jìn)行差異分析，并使用貝葉斯方法多重檢驗校正，篩選差異表達(dá)的miRNA 以|logFC|>2 和P <0.05 作為標(biāo)準(zhǔn)。對差異表達(dá)的miRNA 進(jìn)行聚類分析，使用R 語言gplots 包繪制熱圖和火山圖。選取表達(dá)倍數(shù)差異最大的前6 位miRNA 進(jìn)行下一步分析。

1.3 miRNA 靶基因預(yù)測

利用在線數(shù)據(jù)庫TargetScan7.2（http：//www.targetscan.org/vert_72/）、miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）和miRDB（http：//mirdb.org/）分別預(yù)測篩選出來的6 個miRNAs 的靶基因，為了提高準(zhǔn)確性，縮小范圍，通過在線網(wǎng)站Bioinformatics &Evolutionary Genomics（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制維恩圖，取交集。

1.4 靶基因的功能和通路富集分析

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對篩選出的交集靶基因進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，篩選條件為P <0.05。根據(jù)GO 進(jìn)行基因功能注釋富集分析，通過分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular components，CC）及生物過程（biological process，BP）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。KEGG 對交集靶基因進(jìn)行注釋，主要包括基因功能、生物途徑、細(xì)胞定位、信號通路等。

1.5 靶基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析

通過STRING 數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/）、Cytoscape 軟件進(jìn)行靶基因PPI 分析和模塊化分析。將靶基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行PPI 分析，繼而使用Cytoscape 軟件的degree 插件對其結(jié)果進(jìn)行模塊分析，并挖掘PPI 中連接最為緊密的模塊，預(yù)測靶基因編碼蛋白之間的相互作用，同時篩選出最為關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)miRNA 的篩選

共篩選85 個差異表達(dá)miRNAs，與在位內(nèi)膜組織比較，異位內(nèi)膜組織上調(diào)的miRNA 共30 個，下調(diào)的miRNA 共55 個，并將差異表達(dá)的miRNA 可視化（圖1）。由聚類分析圖可以看出，異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜形成了明顯的聚類群。其中差異最大的前6 位分別為miR-202-5p、miR-514a-3p、miR-615-3p、miR-202-3p、miR-509-3p、miR-509-3-5p（表1）。

表1 異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜組織差異表達(dá)排名前6 位的miRNA

2.2 差異表達(dá)miRNA 的靶基因交集

在線數(shù)據(jù)庫TargetScan7.2、miRWalk 和miRDB預(yù)測miR-202-5p 的交集靶基因43 個（圖2A），miR-514a-3p 的交集靶基因194 個（圖2B），miR-615-3p的交集靶基因2 個（圖2C），miR-202-3p 的交集靶基因598 個（圖2D），miR-509-3p 的交集靶基因209 個（圖2E），miR-509-3-5p 的交集靶基因556 個（圖2F）。

圖2 三個數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測的靶基因交集的維恩圖

2.3 靶基因GO 和KEGG 富集分析結(jié)果

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對1602 個靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，在BP 中，靶基因主要參與了Ras 蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、軸突生成和轉(zhuǎn)運、神經(jīng)元投射導(dǎo)向、促進(jìn)細(xì)胞分解代謝過程等；T 細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞活化、體液免疫反應(yīng)等過程；在CC 方面，靶基因主要富在神經(jīng)元突觸、細(xì)胞質(zhì)等部位；在MF方面，靶基因主要富集在SMAD 結(jié)合、Ras GTPase 結(jié)合、mRNA 3’UTR 結(jié)合、小GTPase 結(jié)合（圖3）。KEGG 信號通路富集分析提示顯著差異基因主要富集在糖代謝途徑（圖4）。GO 和KEGG 富集分析結(jié)果提示與內(nèi)異癥相關(guān)的生物學(xué)功能是軸突轉(zhuǎn)運和糖代謝途徑。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)樞紐基因的篩選

通過STRING 數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 軟件對篩選得到的靶基因進(jìn)行PPI 分析，篩選出排名前15 位的基因定位核心基因，分析結(jié)果顯示，6 個miRNAs 靶基因的核心調(diào)控基因主要有RAC1、EP300、EGFR、CTNNB1、PIK3CA、FYN、KRAS、CUL2、ITCH、PLK1、FBXW11、PPP2CA、ATG7、RAB5C、ANAPC10（圖5），提示RAC1、EP300、EGFR、CTNNB1 蛋白與其他蛋白作用關(guān)聯(lián)較為緊密。

圖5 靶基因PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

本研究利用數(shù)據(jù)集GSE105765 分析內(nèi)異癥患者異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜差異表達(dá)的miRNA 共85 個，其中上調(diào)的miRNA 共30 個，下調(diào)的miRNA 共55 個，差異顯著表達(dá)的前6 位miRNA 分別為miR-202-5p、miR-514a-3p、miR-615-3p、miR-202-3p、miR-509-3p、miR-509-3-5p。研究發(fā)現(xiàn)這些miRNA 生理作用大多是在腫瘤中，miR-202-5p 通過作用其靶基因抑制卵巢癌細(xì)胞及骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[12-13]；Jin等[14]研究提出miR-514a-3p 可以抑制腎臟腫瘤細(xì)胞的生長；Wang 等[15]在胃癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-615-3p 通過作用其靶基因CELF2 促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和遷移，抑制凋亡；miR-202-3p 在甲狀腺乳頭狀癌中發(fā)揮抑癌作用，減少細(xì)胞的遷移和侵襲[16]；Niu 等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-509-3p 能夠增強(qiáng)卵巢癌對鉑類化療藥的敏感性；Zhang 等[18]在2007 年發(fā)現(xiàn)miR-509-3-5p可以靶向PODXL 抑制胃癌侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移，可作為新的胃癌預(yù)后指標(biāo)。由此可以推測，內(nèi)異癥所具有惡性生物學(xué)行為可能是通過miRNA 介導(dǎo)調(diào)控的，但具體調(diào)控機(jī)制尚需基礎(chǔ)研究證實，該結(jié)果為研究內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

內(nèi)異癥典型的臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的痛經(jīng)。內(nèi)異癥疼痛的病理生理過程為逆流的內(nèi)膜組織或者細(xì)胞到達(dá)腹膜表面，建立血供并侵犯周圍組織，刺激感覺神經(jīng)、交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)，從而出現(xiàn)炎癥反應(yīng)性疼痛。異位內(nèi)膜分泌雌二醇和前列腺素E2，前列腺素E2能夠刺激疼痛纖維，通過刺激神經(jīng)生長因子和其他神經(jīng)營養(yǎng)因子，增強(qiáng)侵襲病變的神經(jīng)敏感性，刺激傷害感受器，從而導(dǎo)致持續(xù)性炎癥疼痛并抑制神經(jīng)元凋亡[2]。GO 與KEGG 的分析結(jié)果顯示，6 個miRNAs的交集靶基因與神經(jīng)軸突轉(zhuǎn)運關(guān)系密切。推測miRNA可能通過靶基因介導(dǎo)了內(nèi)異癥的神經(jīng)疼痛。如果該調(diào)控機(jī)制可以被闡釋清楚的話，可能指導(dǎo)研究者找到內(nèi)異癥疼痛的治療靶點，為尋找內(nèi)異癥疼痛的治療靶點提供了新思路。

關(guān)于內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制需要更深入地闡明，有待于結(jié)合遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)和免疫學(xué)等方面的研究成果[1]，這需要進(jìn)一步的流行病學(xué)研究及更加完善的動物模型。目前所提出的學(xué)說里，尚無提及糖代謝參與內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制。內(nèi)異癥雖是良性疾病，但轉(zhuǎn)移、侵襲、種植等能生物學(xué)特性類似于腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)糖代謝途徑參與了腫瘤代謝的重塑或異常改變[19-20]。本研究中GO 與KEGG 的分析結(jié)果顯示，靶基因與糖代謝途徑關(guān)系密切，miRNA 可能靶向這些靶基因參與調(diào)節(jié)糖代謝，從而調(diào)控內(nèi)異癥的這些生物學(xué)特性。這一假設(shè)的提出，有助于推進(jìn)內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制中表觀遺傳學(xué)方向的研究，為探討更多表觀遺傳學(xué)方向提供思路，同時為基礎(chǔ)或臨床研究提供新方向。

靶基因PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選結(jié)果顯示，RAC1 及EGFR 作用最核心，這兩種基因參與細(xì)胞的多種生物學(xué)過程[21-24]。已有研究發(fā)現(xiàn)，卵巢子宮內(nèi)膜異位囊壁組織細(xì)胞中RAC1 呈高表達(dá)狀態(tài)，它可以通過RHOGTP 酶信號級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)卵巢子宮內(nèi)膜異位囊壁組織細(xì)胞的遷移[25]。Ping 等[26]通過生物信息學(xué)分析顯示，EGFR 和RAC1同為內(nèi)異癥組及對照組差異表達(dá)基因，共同參與了細(xì)胞黏附、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、MAPK 細(xì)胞信號通路，且RAC1還參與了轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。本研究結(jié)果提示，RAC1 及EGFR 在內(nèi)異癥的蛋白調(diào)控網(wǎng)中的作用途徑可能是通過miRNA 介導(dǎo)的，但具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)需要更多的研究去闡釋。

綜上所述，本研究從生物信息學(xué)的角度，揭示了miRNA 可能通過作用靶基因參與了內(nèi)異癥的病理過程。本研究分析篩選的6 個miRNAs 及其對應(yīng)的靶基因發(fā)現(xiàn)，軸突轉(zhuǎn)運及糖代謝為主要作用方式參與了內(nèi)異癥的發(fā)生，從新的視角探索了內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制，這些miRNA 及途徑可能成為內(nèi)異癥治療的潛在靶點，具有重要臨床意義。