中空纖維膜液相微萃取-高效液相色譜法測定醬油、食醋及碳酸飲料中苯甲酸和山梨酸的含量

丁明珍,顧興靈,劉 霄,徐茜茜,陳岱威,彭 璟

(南京大學 金陵學院 化學與生命科學學院,南京 210089)

苯甲酸(BA)和山梨酸(SA)因價格低廉,抑菌效果好,常被作為防腐劑廣泛應用于食品中。然而過量食用防腐劑可能會引起哮喘、蕁麻疹、代謝酸中毒和驚厥,對人體健康產(chǎn)生潛在的危害[1-2]。國家標準GB 2760－2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中規(guī)定醬油、食醋中BA 和SA 的限量均為1.0 g·kg－1,飲料中BA 和SA 的限量分別為0.2,0.5 g·kg－1[3]。因此,建立簡便、準確、成本低的測定食品中BA 和SA 含量的分析方法尤為重要。

文獻報道測定食品中BA 和SA 含量的方法有氣相色譜法[4-7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、高效液相色譜法[9-12]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[13]、毛細管電泳法[14-15]、紫外光譜法[16]、超臨界流體色譜[17]以及核磁共振法等[18]。但上述方法大多需要復雜的前處理過程,有機溶劑消耗量大,儀器昂貴,一般實驗室難以負擔。雖然固相微萃取(SPME)前處理方法環(huán)境友好,不需要使用有機溶劑,但通常需要衍生化操作,精密度不高[5]。

中空纖維膜液相微萃取是一種以多孔的中空纖維為載體的液膜分離技術,由PEDERSEN-BJERGAARD 等[19]于1999年首次提出。該技術可一步完成樣品的采集、萃取和濃縮,操作簡便,成本低,有機溶劑使用量極少(μL 級),且樣品中的大分子物質(zhì)、雜質(zhì)不能進入纖維孔,具有良好的樣品凈化能力[20]。文獻[21]將該技術結合液相色譜-質(zhì)譜法測定了飲料中BA 和SA 的含量,但該方法采用外標法定量,精密度有待提高。由于肉桂酸的結構和性質(zhì)與BA 和SA 接近,且醬油、食醋及碳酸飲料中通常不含肉桂酸,因此本工作以肉桂酸為內(nèi)標(IS),通過優(yōu)化液相微萃取條件,建立了中空纖維膜液相微萃取-高效液相色譜法測定醬油、食醋及碳酸飲料中BA 和SA 的方法,以期為食品中BA 和SA 的日常監(jiān)控提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-600 型高效液相色譜儀,配紫外檢測器;KQ-50B 型超聲波儀;ZNCL-GS 型磁力攪拌器;Milli-Q 型純水系統(tǒng);FP-T0008型聚偏氟乙烯中空纖維膜(外徑1.2 mm,內(nèi)徑0.6 mm,孔徑0.1μm)。

乙酸銨溶液:0.02 mol·L－1,稱取乙酸銨1.540 0 g,用水溶解并定容至1 000 mL,經(jīng)濾膜過濾后備用。

混合標準儲備溶液:分別稱取BA 和SA 各0.100 0 g于100 mL棕色容量瓶中,加入1 mL甲醇溶解,用水稀釋至刻度,配制成1 000 mg·L－1混合標準儲備溶液,于4 ℃保存。

IS儲備溶液:稱取肉桂酸0.050 0 g于100 mL棕色容量瓶中,加入1 mL甲醇溶解,用水稀釋至刻度,配制成500 mg·L－1IS儲備溶液。

混合標準溶液系列:移取適量的混合標準儲備溶液和IS儲備溶液,用水逐級稀釋,配制成BA 和SA質(zhì)量濃度均為0.01,0.05,0.10,0.50,1.00,5.00,10.00 mg·L－1,IS質(zhì)量濃度為1.00 mg·L－1的混合標準溶液系列。

BA、SA 和肉桂酸的純度均大于99%;甲醇為色譜純;乙酸銨、正辛醇、丁醇、乙酸乙酯和磷酸三丁酯(TBP)均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Agilent XDB ODS 色 譜 柱(250 mm ×0.46 mm,5μm);柱溫30 ℃;流動相為體積比3∶7的甲醇-0.02 mol·L－1乙酸銨溶液的混合液;流量1.0 mL·min－1;進樣量20μL;檢測波長225 nm。

1.3 試驗方法

稱取樣品(醬油、食醋或超聲脫氣后的碳酸飲料)0.100 0 g于50 mL容量瓶中,加入0.1 mL IS儲備溶液,用水稀釋至刻度。取上述樣品溶液10 mL于萃取小瓶中,用1 mol·L－1鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH 至2.5,加入0.50 g 氯化鈉,振 蕩溶解。

將聚偏氟乙烯中空纖維膜剪成6.0 cm 小段,在丙酮中超聲洗滌3 min,晾干。將清洗后的纖維膜小段在TBP中超聲浸潤3 min,使中空纖維孔中浸滿TBP,然后取出纖維小段,棄去多余的TBP,用50μL高效液相色譜微量進樣針吸取pH 13.0的氫氧化鈉溶液注滿中空纖維膜腔體,再用加熱過的鑷子將纖維膜兩端封口,浸入裝有樣品溶液的萃取小瓶中,以轉(zhuǎn)速1 000 r·min－1萃取25 min。測定時,剪開中空纖維膜的一端,按照儀器工作條件,吸取20μL萃取后的溶液進樣分析。根據(jù)實際情況,可將樣品溶液稀釋至線性范圍內(nèi)進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對BA、SA 質(zhì)量濃度均為1.00 mg·L－1,IS質(zhì)量濃度為1.00 mg·L－1的混合標準溶液和經(jīng)中空纖維膜液相微萃取后的醬油樣品進行測定,并按照GB 5009.28－2016《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》中的液相色譜法對同一醬油樣品進行分析,所得色譜圖見圖1。

圖1 色譜圖Fig.1 Chromatograms

結果顯示,各目標物與IS均達到基線分離,而采用GB 5009.28－2016中的方法測定時,目標物出峰前的雜峰較多,表明本方法中使用的中空纖維膜對樣品起到了良好的凈化效果。

2.2 中空纖維膜液相微萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 鹽效應

在樣品溶液中加入鹽可以降低BA 和SA 在水中的溶解度,從而提高萃取效率[20]。試驗考察了氯化鈉添加量分別為0,0.20,0.50,0.70,1.00 g時對醬油樣品中BA 和SA 峰面積的影響,結果見圖2。

圖2 氯化鈉添加量對BA 和SA 峰面積的影響Fig.2 Effect of additive amount of sodium chloride on peak areas of BA and SA

結果顯示:當氯化鈉添加量小于0.50 g時,BA和SA 的峰面積均隨著氯化鈉的增加而增大,這可能是由于氯化鈉的加入,增加了溶液的離子強度,從而降低了目標物在水中的溶解度,使BA 和SA 更容易被TBP萃取出來;繼續(xù)增大氯化鈉,BA 和SA的峰面積逐漸下降,這可能是由于鹽的加入量過大使樣品溶液的黏度大幅度提高,阻礙了目標物向中空纖維膜中有機相的擴散。因此,試驗選擇氯化鈉的添加量為0.50 g。

2.2.2 萃取劑

試驗考察了4種萃取劑(乙酸乙酯、正辛醇、丁醇、TBP)對醬油樣品中BA 和SA 峰面積的影響,結果見圖3。

圖3 萃取劑對BA 和SA 峰面積的影響Fig.3 Effect of extraction agent on peak areas of BA and SA

結果顯示:以乙酸乙酯為萃取劑時,BA 和SA未出峰;以正辛醇、丁醇為萃取劑時,目標物的峰面積較大;以TBP為萃取劑時,目標物的峰面積更大,表明TBP的萃取效果較好。因此,試驗選擇的萃取劑為TBP。

2.2.3 供相酸度

由于食品中BA 和SA 多以苯甲酸鈉和山梨酸鉀的形式存在,調(diào)節(jié)樣品溶液(供相)酸度可使目標物以BA 和SA 分子的形式存在,降低其在水中的溶解度,從而提高萃取效率。BA 和SA 的pKa值分別為4.19和4.76,當pH 小于pKa時,目標物則以BA、SA 分子的形式存在,反之會被電離。試驗考察了供相酸度(pH 2.0,2.5,3.0,3.5,4.0)對醬油樣品中BA 和SA 峰面積的影響,結果見圖4。

圖4 供相酸度對BA 和SA 峰面積的影響Fig.4 Effect of acidity of donor phase on peak areas of BA and SA

結果顯示:當供相pH 為2.0,2.5時,目標物峰面積較大,且基本保持不變;繼續(xù)增大供相pH,BA和SA 的峰面積迅速減小。因此,試驗選擇的供相pH 為2.5。

2.2.4 接收相酸度

由于BA 和SA 均是酸性物質(zhì),因此接收相應為堿性,以便將它們轉(zhuǎn)化為離子形式從有機相TBP中反萃取出來。試驗考察了氫氧化鈉溶液(接收相)酸度(pH 10.0,11.0,12.0,13.0,14.0)對醬油樣品中BA 和SA 峰面積的影響,結果見圖5。

圖5 接收相酸度對BA 和SA 峰面積的影響Fig.5 Effect of acidity of acceptor phase on peak areas of BA and SA

結果顯示,當接收相pH 為13.0時,BA 和SA的峰面積較大,說明此時萃取效果較佳,因此試驗選擇的接收相pH 為13.0。

2.2.5 萃取時間

試驗考察了萃取時間分別為10,20,25,30,40 min時對醬油樣品中BA 和SA 峰面積的影響,結果見圖6。

圖6 萃取時間對BA 和SA 峰面積的影響Fig.6 Effect of extraction time on peak areas of BA and SA

結果顯示,隨著萃取時間的延長,BA 和SA 的峰面積呈先增大后減小的趨勢,當萃取時間為25 min時,目標物的峰面積較大,這可能是由于萃取時間較長導致中空纖維孔內(nèi)的有機萃取劑溶解到樣品溶液中。因此,試驗選擇萃取時間為25 min。

2.3 標準曲線和檢出限

按照儀器工作條件對混合標準溶液系列進行測定,以各目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標,其對應的峰面積與IS峰面積比值為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示,BA 和SA 標準曲線的線性范圍均為0.01～10.00 mg·L－1,線性參數(shù)見表1。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限,結果見表1。

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.4 精密度試驗

按照試驗方法對醬油樣品平行測定6次,計算測定值的相對標準偏差(RSD),以考查方法的日內(nèi)精密度;并連續(xù)6 d測定同一醬油樣品,計算測定值的RSD,以考查方法的日間精密度,結果見表2。

表2 精密度試驗結果(n=6)Tab.2 Results of test for precision(n=6)%

2.5 回收試驗

按照試驗方法對實際醬油樣品進行低、中、高等3個濃度水平的加標回收試驗,計算回收率,結果見表3。

表3 回收試驗結果Tab.3 Results of test for recovery

2.6 樣品分析

按照本方法和GB 5009.28－2016中的方法對市售的不同醬油、食醋及碳酸飲料樣品進行測定,結果見表4。

表4 樣品分析結果Tab.4 Analytical results of samples

結果顯示:BA 在醬油、食醋和碳酸飲料中均被檢出,檢出量未超過國家規(guī)定的最高限量(1 000 mg·kg－1),而SA 僅在1種醬油中被檢出,并且兩種方法所得結果基本一致。

本工作通過優(yōu)化鹽效應、萃取劑、供相及接受相酸度、萃取時間等條件,以肉桂酸為IS,建立了中空纖維膜液相微萃取-高效液相色譜法同時測定醬油、食醋和碳酸飲料中BA 和SA 含量的方法,該方法準確度高、精密度好、成本低且環(huán)境友好,可用于市售醬油、食醋及碳酸飲料中BA 和SA 含量的測定。