雙酶顯色-紫外-可見分光光度法測定牛奶中組胺與腐胺的含量

姚曉曈 ,徐 斐 ,葉 泰 ,袁 敏* ,劉振民 ,喻東威

(1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海食品快速檢測工程技術(shù)研究中心,上海 200093;2.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436;3.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司,呼和浩特 011500)

生物胺是一類具有生物活性并且相對分子質(zhì)量小的含氮有機(jī)堿,由氨基酸在脫羧酶或氨基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下形成[1-2]。根據(jù)生物胺的組成,可將其分為單胺(如酪胺)、二胺(如組胺、腐胺等)和多胺(如精胺)。其中,組胺和腐胺常存在于發(fā)酵食品和水產(chǎn)品中[3-4]。攝入高濃度的組胺會引起眼結(jié)膜充血、頭昏、惡心、胸悶等中毒癥狀,甚至?xí)氯怂劳?腐胺對眼睛、皮膚、消化道、呼吸道等有強(qiáng)烈的刺激作用[5]。由于生物胺的多樣性和其對人體作用的復(fù)雜性,國際上還沒有較為全面的生物胺膳食攝入評估數(shù)據(jù)。由于組胺的毒性強(qiáng)、分布廣,目前多數(shù)國家對食品中組胺含量進(jìn)行了規(guī)定,如歐盟要求水產(chǎn)品中的組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過100 mg·kg－1。但是,國際上尚未對乳制品中的生物胺提出限量要求。根據(jù)報道,乳制品中組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6～2.1 g·kg－1,腐胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5 g·kg－1[6],因此有必要對乳制品中組胺和腐胺的含量進(jìn)行監(jiān)測。

目前,測定生物胺的方法主要有高效液相色譜法[7]、氣相色譜法[8]、毛細(xì)管電泳法[9]、離子色譜法[10]等。這些方法精密度高、重復(fù)性好,但是存在以下問題:①需用到大型儀器、多種有機(jī)試劑,且操作復(fù)雜,專業(yè)要求高;②前處理時間較長,不利于現(xiàn)場檢測;③成本較高,難以大范圍使用。利用二胺氧化酶(DMO)對二胺類生物胺的催化反應(yīng)測定其含量已有文獻(xiàn)報道。文獻(xiàn)[11]利用DMO 與磁珠結(jié)合的電化學(xué)方法測定組胺、尸胺的含量;文獻(xiàn)[12]以DMO 為生物識別元件,以微流控芯片和化學(xué)發(fā)光分析儀為傳感元件,以魯米諾-鐵氰化物為化學(xué)發(fā)光體系,采用生物酶傳感器法測定腐胺、組胺的含量。

DMO 可與二胺類生物胺發(fā)生催化反應(yīng),生成的過氧化氫能夠與辣根過氧化物酶(HRP)反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基使顯色劑四甲基聯(lián)苯胺(TMB)變?yōu)閛x TMB(TMB的氧化態(tài)),溶液由無色變?yōu)樗{(lán)色,加入鹽酸終止反應(yīng),溶液由藍(lán)色變?yōu)辄S色。利用上述DMO 和HRP的級聯(lián)催化原理,本工作建立了基于DMO-HRP雙酶顯色的紫外-可見分光光度法快速測定牛奶中組胺和腐胺含量的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TU-1901型紫外-可見分光光度計;QL-866 型旋渦混合器;WT100-3型恒溫水浴鍋。

磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4):0.2 mol·L－1,稱取二水合磷酸二氫鈉31.202 g,用水溶解并定容至1 L,獲得A 液;稱取磷酸氫二鈉28.392 g,用水溶解并定容至1 L,獲得B液。將A 液與B液按照體積比19∶81混合均勻,得到濃度為0.2 mol·L－1的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)。

組胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:10 mmol·L－1,稱取組胺11.115 mg,用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)溶解并定容至10 mL,配制成濃度為10 mmol·L－1的組胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。使用時,用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)稀釋至所需濃度。

腐胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:10 mmol·L－1,稱取腐胺8.815 mg,用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)溶解并定容至10 mL,配制成濃度為10 mmol·L－1的腐胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。使用時,用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)稀釋至所需濃度。

DMO標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.0 g·L－1,稱取DMO 0.005 g,用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)溶解并定容至5 mL,配制成質(zhì)量濃度為1.0 g·L－1的DMO 標(biāo)準(zhǔn)溶液。同法制備1.0 g·L－1HRP標(biāo)準(zhǔn)溶液。

TMB標(biāo)準(zhǔn)溶液:0.5 g·L－1,稱取TMB 1 mg,用0.2 mL二甲基亞砜(DMSO)溶解,再加入1.8 mL水混勻,配制成質(zhì)量濃度為0.5 g·L－1的TMB標(biāo)準(zhǔn)溶液。

所用試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。牛奶購自某超市。

1.2 儀器工作條件

掃描范圍400～600 nm;檢測波長450 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

移取10 mL牛奶,加入10 mL 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硝酸鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液,攪拌均勻,得到硝酸鉛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的陽性牛奶樣品;再加入20 mL 0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,混合均勻,以轉(zhuǎn)速7 500 r·s－1離心5 min,取上清液,用2 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH 至7.2,得到待測樣品溶液。

移取1.0 g·L－1DMO 標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL,加入100μL待測樣品溶液,于50℃水浴中反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后,取出,依次加入1.0 g·L－1HRP標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL,0.5 g·L－1TMB 標(biāo)準(zhǔn)溶液200μL 和2 mol·L－1鹽酸溶液50μL,觀察溶液顏色變化,按照儀器工作條件測定體系的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見吸收光譜圖

按照試驗(yàn)方法對0.2 mol·L－1磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)、50 μmol·L－1組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和50μmol·L－1腐胺標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行測定,結(jié)果見圖1。

圖1 紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectrum

結(jié)果表明:僅磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)存在的情況下,體系在可見光區(qū)未出現(xiàn)吸收峰;當(dāng)加入50μmol·L－1組胺或腐胺標(biāo)準(zhǔn)溶液后,體系在450 nm 處出現(xiàn)一個明顯的吸收峰,并且在試驗(yàn)過程中,體系顏色發(fā)生了由無色到藍(lán)色再到黃色的變化。據(jù)此,可建立基于DMO-HRP 雙酶顯色的紫外-可見分光光度法測定組胺和腐胺含量的方法。

2.2 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

由于組胺和腐胺具有相同的反應(yīng)原理,因此本工作以組胺為研究對象進(jìn)行條件優(yōu)化。試驗(yàn)考察了反應(yīng)溫度分別為25,30,40,50,60,70,80,90℃時對體系吸光度的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 反應(yīng)溫度對體系吸光度的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on absorbance of system

結(jié)果顯示:隨著反應(yīng)溫度的升高,體系的吸光度呈先增大后減小的趨勢;當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時,體系的吸光度較大。這是由于反應(yīng)前期,隨著溫度的升高,DMO 的活性逐漸增強(qiáng);當(dāng)反應(yīng)溫度過高時,DMO 的活性降低,催化反應(yīng)被抑制,導(dǎo)致體系的吸光度減小。因此,試驗(yàn)選擇的反應(yīng)溫度為50 ℃。

2.3 反應(yīng)時間的優(yōu)化

試驗(yàn)考察了反應(yīng)時間分別為5,10,15,20,25,35,45,55 min時對體系吸光度的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 反應(yīng)時間對體系吸光度的影響Fig.3 Effect of reaction time on absorbance of system

結(jié)果顯示:隨著反應(yīng)時間的延長,體系的吸光度逐漸增大;當(dāng)反應(yīng)時間為5～15 min時,體系的吸光度增大速率較快,這是由于DMO 與組胺在5～15 min內(nèi)反應(yīng)較為迅速;繼續(xù)延長反應(yīng)時間,體系的吸光度逐漸達(dá)到平穩(wěn)。為了滿足快速分析的需要,試驗(yàn)選擇的反應(yīng)時間為15 min。

2.4 TMB質(zhì)量濃度的優(yōu)化

試驗(yàn)考察了TMB 質(zhì)量濃度分別為0.2,0.5,0.8,1.0,1.5,2.0 g·L－1時對體系吸光度的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 TMB質(zhì)量濃度對體系吸光度的影響Fig.4 Effect of mass concentration of TMB on absorbance of system

結(jié)果顯示,隨著TMB質(zhì)量濃度的增加,體系的吸光度呈先增大后減小的趨勢。造成這種現(xiàn)象的原因可能是TMB標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有一定量的DMSO,DMSO 會導(dǎo)致DMO 失活,隨著TMB 質(zhì)量濃度的增加,DMSO 的濃度也隨之上升,進(jìn)而導(dǎo)致體系的吸光度減小。因此,試驗(yàn)選擇的TMB 質(zhì)量濃度為0.5 g·L－1。

2.5 選擇性試驗(yàn)

由于牛奶中含有豐富的氨基酸,并且氨基酸的分子結(jié)構(gòu)與生物胺非常相似,組氨酸和精氨酸通過脫羧作用和轉(zhuǎn)氨基作用可形成組胺和腐胺,因此DMO 對組胺和腐胺的選擇性十分重要。分別以200μmol·L－1的精氨酸、賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸溶液為研究對象,考察了上述氨基酸在DMO 作用下,體系在450 nm 處吸光度的變化,結(jié)果見圖5。

圖5 DMO 與不同氨基酸反應(yīng)后的體系吸光度Fig.5 Absorbance of system after reaction between DMO and different amino acids

結(jié)果顯示,精氨酸、賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸與DMO 反應(yīng)后,體系的吸光度很小,而組胺或腐胺與DMO 反應(yīng)后,體系的吸光度明顯增大,說明DMO 對組胺和腐胺具有較高的選擇性。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

移取適量的10 mmol·L－1組胺或腐胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)逐級稀釋,配制成組胺濃度為0,2.5,10,20,30,40,50,70,90,100,120,150,200,250,300,400μmol·L－1,腐胺濃度為0,5,10,20,30,40,50,70,90,100,120,140,150,170,200,250,300,350,400μmol·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按照試驗(yàn)方法對上述標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定。以組胺或腐胺的濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性參數(shù)見表1。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.7 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對空白牛奶樣品進(jìn)行低、中、高等3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n=5)

由表2可知:組胺的回收率為80.5%～88.3%,測定值的RSD 為2.5%～4.4%;腐胺的回收率為89.5%～92.3%,測定值的RSD 為4.4%～5.1%。

2.8 方法比對

將本法與文獻(xiàn)報道的其他方法進(jìn)行比對,結(jié)果見表3。

表3 不同方法比對結(jié)果Tab.3 Comparison of results by different methods

結(jié)果顯示,與其他方法比對,本法靈敏度高,組胺和腐胺的檢出限較低,且不需要使用大型儀器。

本工作建立了基于DMO-HRP 雙酶顯色的紫外-可見分光光度法測定牛奶中組胺和腐胺含量的方法,該方法無需對生物胺樣品進(jìn)行衍生,分析快速、操作簡單,結(jié)果準(zhǔn)確度好,精密度高,為乳制品等發(fā)酵產(chǎn)品中組胺和腐胺的測定提供了參考。