基于近紅外光譜法建立的模型預(yù)測(cè)維生素B6的含量

陳梓云,彭夢(mèng)俠

(嘉應(yīng)學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,梅州 514015)

維生素B6是維生素B 片劑中重要的活性成分之一,具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂、調(diào)節(jié)人體新陳代謝、維持皮膚和肌肉健康、增強(qiáng)免疫的功能,可預(yù)防貧血,在人體的正常代謝中起著重要作用[1-2];并且維生素B6還可用于治療妊娠嘔吐、痤瘡、脂溢性皮炎[3-4]等多種疾病,因此維生素B6已成為人體補(bǔ)充維生素類產(chǎn)品中必不可少的物質(zhì)。

市售的維生素B 產(chǎn)品分為藥物和保健品兩大類,其中藥物類維生素B 片被稱為復(fù)合維生素B片,保健品類維生素B 片被稱為B 族維生素片,均是補(bǔ)充維生素B6的常見(jiàn)產(chǎn)品,但這兩類維生素B產(chǎn)品中的維生素B6含量參差不齊。

目前測(cè)定維生素B6含量的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[5]、同步熒光法[6]、銀量法[7]、高速離子交換色譜法[8]、薄層掃描法[9]、偏最小二乘法結(jié)合同步熒光法[10]、紫外檢測(cè)器串聯(lián)熒光檢測(cè)器的高效液相色譜法[11]等?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(2015 年版)中測(cè)定維生素B6含量的方法為HPLC,該方法靈敏度高,但操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)、成本高、溶劑用量大,難以完成大批量藥品、食品的監(jiān)測(cè)任務(wù)。近紅外光譜法(NIR)是一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、無(wú)損、無(wú)污染的快速分析檢測(cè)技術(shù),在藥物分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[12-15]。

本工作以HPLC為參比方法,通過(guò)NIR 采集復(fù)合維生素B片和B族維生素片的近紅外光譜圖,結(jié)合偏最小二乘法(PLS)建立維生素B6的定量分析模型,利用模型可實(shí)現(xiàn)對(duì)維生素B6含量的快速預(yù)測(cè)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT 型高效液相色譜儀;AntarisⅡ型傅里葉變換近紅外光譜儀;KQ-25DB 型超聲波清洗器;SS-01型Super-Shak IR 振蕩機(jī)。

維生素B6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:在避光條件下,稱取0.20 mg維生素B6標(biāo)準(zhǔn)品,用水溶解并定容至100 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為2.00 mg·L－1的維生素B6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

己烷磺酸鈉溶液:稱取1 g己烷磺酸鈉,用水溶解并定容至1 L容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為1 g·L－1的己烷磺酸鈉溶液。

維生素B6標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于98.0%;己烷磺酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%;甲醇為優(yōu)級(jí)純;冰乙酸為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

不同藥廠的13種藥物復(fù)合維生素B 片;不同廠家的10種保健品B族維生素片。

1.2 儀器工作條件

1)HPLC 條件 ShimpackVP-ODS C18烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(150 mm×4.6 mm,2μm);柱溫30 ℃;流量1.0 mL·min－1;進(jìn)樣量10μL;流動(dòng)相為體積比14∶6∶1的1 g·L－1的己烷磺酸鈉溶液-甲醇-冰乙酸的混合液,等度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)291 nm;測(cè)定時(shí)間14 min。

2)NIR 條件 掃描范圍4 000～10 000 cm－1;掃描次數(shù)64次;分辨率8 cm－1;優(yōu)化增益為1x;空氣為背景。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HPLC測(cè)定樣品中維生素B6的含量

將同一類型的維生素B片研磨,稱取50 mg樣品粉末,用適量水溶解,在避光條件下超聲10 min,轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中,用水定容,按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)類型維生素B片取兩個(gè)樣本,計(jì)算測(cè)定值的平均值,以該平均值作為樣品中維生素B6的實(shí)測(cè)值。

1.3.2 樣品的近紅外光譜采集

取同一類型的維生素B片6～12片,研磨并以轉(zhuǎn)速4 000 r·min－1振蕩1 min,將樣品粉末分別裝入3個(gè)樣品杯中,采用積分球漫反射分析模塊采集其近紅外光譜圖,每個(gè)樣品采集5次,得到15張近紅外光譜圖。13 種藥物復(fù)合維生素B 片共測(cè)得195張近紅外光譜圖,10種保健品B族維生素片共測(cè)得150張近紅外光譜圖。

1.3.3 維生素B6的定量分析模型的建立

以HPLC為參比方法,以不同類型維生素B片為建模的訓(xùn)練集樣品,每個(gè)樣品中,任取12張光譜圖作為訓(xùn)練集樣本,余下3張光譜圖作為內(nèi)部驗(yàn)證集樣本,采用TQ Analyst 9.0軟件中的PLS,用一階導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)據(jù)形式,各選擇3個(gè)波段(藥物復(fù)合維生素B 片4 700.46～5 125.86 cm－1,5 444.60～5 708.26 cm－1,5 754.69～6 159.52 cm－1;保健品B族維生素B片4 133.67～5 512.28 cm－1,5 944.17～ 6 495.08 cm－1,8 105.85～9 005.94 cm－1)對(duì)藥物復(fù)合維生素B 片和保健品B族維生素B 片分別進(jìn)行建模,使用諾里斯導(dǎo)數(shù)濾噪,節(jié)段長(zhǎng)度為5,段間間隙為5(藥物復(fù)合維生素B片)或6(保健品B族維生素B片),剔除可疑的光譜圖,再通過(guò)內(nèi)部驗(yàn)證、交互驗(yàn)證等方式優(yōu)化,從而建立不同類型維生素B 片中維生素B6的定量分析模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC分析結(jié)果

在避光條件下,分別移取維生素B6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.1,0.2,0.5,0.7,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 mL于一組10 mL 棕色容量瓶中,用水稀釋,配制成質(zhì)量濃度為0.02,0.04,0.10,0.14,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20 mg·L－1的維生素B6標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,以維生素B6的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,維生素B6的質(zhì)量濃度在0.02～1.20 mg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y＝2.144×104x＋408.5,相關(guān)系數(shù)為0.999 2。

按照試驗(yàn)方法,對(duì)13種藥物復(fù)合維生素B 片和10 種保健品B 族維生素片進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,13種藥物復(fù)合維生素B片中維生素B6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.186 7%～0.282 7%;10種保健品B 族維生素片中維生素B6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.050 5%～2.044 3%。

2.2 不同樣品的近紅外光譜圖

按照試驗(yàn)方法,使用積分球漫反射分析模塊采集13種藥物復(fù)合維生素B 片和10種保健品B 族維生素片的近紅外光譜圖,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 近紅外光譜圖Fig.1 Near infrared spectra

2.3 維生素B6 的定量分析模型

2.3.1 混合維生素B片

以10種藥物復(fù)合維生素B 片和8種保健品B族維生素片(兩者組成混合維生素B 片)為建模的訓(xùn)練集樣品,共得到216個(gè)訓(xùn)練集樣本和54個(gè)內(nèi)部驗(yàn)證集樣本?；旌暇S生素B 片中維生素B6的定量分析模型(模型1)的最佳建模條件為:用一階導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)據(jù)形式;選擇4 204.26～4 958.60 cm－1,5 869.63～6 267.52 cm－1,7 709.93～8 921.09 cm－1等3個(gè)波段同時(shí)進(jìn)行建模;使用諾里斯導(dǎo)數(shù)濾噪,節(jié)段長(zhǎng)度為5,段間間隙為4。在此條件下,模型1的校正均值方差(RMSEC)為0.106 0,校正相關(guān)系數(shù)(Rc)為0.971 1,預(yù)測(cè)均值方差(RMSEP)為0.069 0,預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)(Rp)為0.987 9,交叉驗(yàn)證均值方差(RMSECV)為0.167 0,交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(Rcv)為0.927 6,性能指數(shù)為87.4。模型1中混合維生素B片樣本預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的關(guān)系見(jiàn)圖2。

圖2 混合維生素B片樣本中維生素B6 的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值(模型1)Fig.2 Predicted and measured values of vitamin B6 in mixed vitamin B tablet samples(model 1)

2.3.2 藥物復(fù)合維生素B片

以不同藥廠的10種藥物復(fù)合維生素B 片為建模的訓(xùn)練集樣品,共得到120個(gè)訓(xùn)練集樣本和30個(gè)內(nèi)部驗(yàn)證集樣本。藥物復(fù)合維生素B 片中維生素B6的定量分析模型(模型2)的最佳建模條件為:用一階導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)據(jù)形式;選擇4 700.46～5 125.86 cm－1,5 444.60～5 708.26 cm－1,5 754.69～6 159.52 cm－1等3 個(gè)波段同時(shí)進(jìn)行建模;使用諾里斯導(dǎo)數(shù)濾噪,節(jié)段長(zhǎng)度為5,段間間隙為5。在此條件下,模型2的RMSEC為0.003 0,Rc為0.994 7,RMSEP 為0.002 9,Rp為0.995 4,RMSECV為0.005 2,Rcv為0.994 1,性能指數(shù)為92.8。模型2中藥物復(fù)合維生素B 片樣本的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的關(guān)系見(jiàn)圖3。

圖3 藥物復(fù)合維生素B片樣本中維生素B6 的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值(模型2)Fig.3 Predicted and measured values of vitamin B6 in compound vitamin B tablet samples for drug(model 2)

2.3.3 保健品B族維生素片

以不同廠家的8種保健品B 族維生素片為建模的訓(xùn)練集樣品,共得到96個(gè)訓(xùn)練集樣本和24個(gè)內(nèi)部驗(yàn)證集樣本。保健品B 族維生素片中B6的定量分析模型(模型3)的最佳建模條件為:用一階導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)據(jù)形式;選擇4 133.67～5 512.28 cm－1,5 944.17～6 495.08 cm－1,8 105.85～9 005.94 cm－1

等3個(gè)波段同時(shí)進(jìn)行建模;使用諾里斯導(dǎo)數(shù)濾噪,節(jié)段長(zhǎng)度為5,段間間隙為6。在此條件下,模型3的RMSEC 為0.031 4,Rc為0.998 7,RMSEP 為0.035 8,Rp為0.998 7,RMSECV 為0.038 8,Rcv為0.998 1,性能指數(shù)為93.5。模型3中保健品B族維生素片樣本的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的關(guān)系見(jiàn)圖4。

圖4 保健品B族維生素片樣本中維生素B6 的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值(模型3)Fig.4 Predicted and measured values of vitamin B6 in vitamin B complex tablet samples for health products(model 3)

通過(guò)比較模型1～3 的相關(guān)模型參數(shù),可以發(fā)現(xiàn),模型1的RMSEC、RMSEP、RMSECV 均偏大,而Rc、Rp、Rcv及性能指數(shù)均偏小。這可能是由于復(fù)合維生素B片為復(fù)方制劑,主要含有維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺、泛酸鈣等成分,輔料為淀粉、糊精、磷酸氫鈣、硬脂酸鎂等,不同藥廠生產(chǎn)的藥物復(fù)合維生素B片的組成成分基本一致;而保健品B族維生素片的主要成分除了含有維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺、泛酸鈣外,通常還含有甲鈷胺、葉酸、微晶纖維素,輔料為淀粉、糊精、磷酸氫鈣、硬脂酸鎂、香精、礦物質(zhì)等,不同廠家生產(chǎn)的保健品B族維生素片組成成分各有不同。由于不同類型維生素B片的成分存在較大差異,采用混合維生素B片進(jìn)行建模時(shí),兩者會(huì)互相干擾,導(dǎo)致模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性較差,因此采用單一類型的維生素B片進(jìn)行建模,可更準(zhǔn)確地分析其中維生素B6的含量。

3 模型的外部驗(yàn)證

對(duì)模型2和模型3進(jìn)行外部驗(yàn)證,進(jìn)一步確定所建模型的準(zhǔn)確性。以未參與建模的3種藥物復(fù)合維生素B 片為外部驗(yàn)證集,對(duì)模型2 進(jìn)行外部驗(yàn)證,得到維生素B6含量的預(yù)測(cè)值;以未參與建模的2種保健品B 族維生素片為外部驗(yàn)證集,對(duì)模型3進(jìn)行外部驗(yàn)證,得到維生素B6含量的預(yù)測(cè)值。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 外部驗(yàn)證結(jié)果Tab.1 External validation results

結(jié)果顯示:模型2對(duì)藥物復(fù)合維生素B片中維生素B6的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的絕對(duì)誤差為－0.004 4%～0.008 0%,相對(duì)誤 差為－1.7%～3.3%;模型3對(duì)保健品B 族維生素片中維生素B6的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的絕對(duì)誤差為－0.007 1%～0.049 7%,相對(duì)誤差為－1.9%～5.0%,表明單一類型維生素B片的模型對(duì)維生素B6含量的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較高,可用于藥物復(fù)合維生素B片和保健品B族維生素片中維生素B6含量的快速分析。

本工作以HPLC 為參比方法,采用NIR 結(jié)合PLS,分別建立了藥物復(fù)合維生素B 片和保健品B族維生素片中維生素B6的定量分析模型。在實(shí)際應(yīng)用中,首先采集待測(cè)樣品的近紅外光譜圖,然后根據(jù)維生素B 片產(chǎn)品的類型分別導(dǎo)入相應(yīng)的模型進(jìn)行分析。該方法無(wú)需使用大量的溶劑和對(duì)照品,并且不需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理,操作簡(jiǎn)單、環(huán)保高效、準(zhǔn)確度高,可快速預(yù)測(cè)不同類型維生素B 片中維生素B6的含量。