黑曲霉產(chǎn)柚皮苷粗酶對柚子汁脫苦工藝研究

肖仔君，鐘瑞敏，陸偉東，張吉剛，林麗芳

（1.韶關(guān)學(xué)院 英東食品學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2.韶關(guān)學(xué)院 化學(xué)與土木工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；3.麗珠集團(tuán)利民制藥廠，廣東 韶關(guān) 512028；4.韶關(guān)市紫背桃源生態(tài)科技有限公司，廣東 韶關(guān) 512000）

柚子是柑橘類果實(shí)的一種，因其風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，香味清爽，口感酸甜涼潤，備受廣大消費(fèi)者的喜愛.廣東省韶關(guān)市地處粵北山區(qū)，土壤肥沃，具有悠久的柚子種植歷史，柚子品種繁多.其中長壩沙田柚因含糖量高，風(fēng)味濃郁，在全國各地頗受歡迎.據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前長壩沙田柚的年產(chǎn)量已超過2 萬噸，近年來其產(chǎn)量也以每年約10%幅度增加[1].因此，發(fā)展和完善沙田柚深加工技術(shù)十分迫切.

生產(chǎn)柚子汁是沙田柚深加工的重要途徑.但柚子汁在加工過程中，柚子中的苦味物質(zhì)主要來源于柚皮、柚囊以及苦味物質(zhì)前體的釋放.現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，柚子汁中的苦味物質(zhì)主要為以柚皮苷、新橙皮苷等為代表的黃烷酮糖苷類化合物，和以檸檬苦素、諾米林等為代表的三萜烯類化合物[1-2].這些苦味物質(zhì)是保持產(chǎn)品特有風(fēng)味所必不可少的，但苦味過強(qiáng)則會影響產(chǎn)品的口感、質(zhì)量和銷售，所以柚子汁脫苦是沙田柚深加工的關(guān)鍵技術(shù).

目前柑橘類果汁中苦味物質(zhì)的脫除方法主要有化學(xué)脫苦[3]、超臨界CO2脫苦[4]、酶法脫苦[5]、樹脂脫苦[6]、吸附脫苦[7]、基因工程脫苦[8]、屏蔽脫苦[9]等方法.這幾種果汁脫苦的方法中，酶法脫苦由于具有操作簡單、作用條件溫和、專一性強(qiáng)、脫苦效率高等優(yōu)點(diǎn)而成為目前最具發(fā)展?jié)摿Φ拿摽喾椒ㄖ籟10].

柚皮苷酶是一種由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成的復(fù)合酶[11]，在柑橘類果汁的加工脫苦具有重要的應(yīng)用價(jià)值.據(jù)課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)商品柚皮苷酶能對柚汁進(jìn)行脫苦（脫苦率為51.5%）[12].但是商品柚皮苷酶價(jià)格較高且脫苦效率偏低.為了開發(fā)新的酶制劑，本研究通過從當(dāng)?shù)罔肿又蟹蛛x出黑曲霉，并利用其產(chǎn)柚皮苷酶后將所得柚皮苷酶對長壩沙田柚柚子汁脫苦，旨在為優(yōu)化粵北地區(qū)長壩沙田柚深加工提供技術(shù)支撐，促進(jìn)果農(nóng)的增收.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑曲霉從柚子中分離純化并保藏于英東食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室備用.長壩沙田柚采摘于韶關(guān)市金柚公司果場.柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（99.8%）、二甘醇、磷酸氫二鉀、無水乙醇、硝酸鉀、檸檬酸、氫氧化鈉等化學(xué)試劑均為分析純.實(shí)驗(yàn)中主要使用儀器設(shè)備有可見分光光度計(jì)（721S，上海棱光）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，常州越新儀器制造有限公司）和pH 計(jì)（pHS-3C）.黑曲霉培養(yǎng)基的配制見參考文獻(xiàn)[13]，配置完畢后用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)其pH 為6.0.柚皮苷酶粗液，自制，酶活為300 IU/mL.

1.2 試驗(yàn)方法

柚皮苷含量和脫苦率的測定按照參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行.柚皮苷酶粗液和柚皮苷酶活力的測定：按照參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行測定.

柚子汁制備流程為：

柚子→去皮→破碎→榨汁→加入果膠酶→攪勻→抽濾→離心（4 000 r/min、10 min）→原果汁.1.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.酶解時間對脫苦效果的影響

分別取4.0 mL 柚子汁裝入6 根試管中，并向各試管中添加25%的粗酶液，在40 ℃條件下分別酶解30、60、90、120、150 和180 min，酶解結(jié)束后，測定各反應(yīng)體系中柚皮苷的含量，并計(jì)算其脫苦率.

2.酶解溫度對脫苦效果的影響

分別取4.0 mL 柚汁裝入6 根試管中，并向各試管中添加25%的粗酶液，分別在20、30、40、50、60 ℃條件下酶解90 min 后，測定各反應(yīng)體系中柚皮苷的含量，并計(jì)算其脫苦率.

3.酶液量對脫苦效果的影響

分別取4.0 mL 柚汁裝入6 根試管中，并向試管中分別添加15%、20%、25%、30%和35%的粗酶液，在40 ℃溫度條件下酶解90 min，酶解結(jié)束后測定各反應(yīng)體系中柚皮苷的含量，并計(jì)算其脫苦率.

4. pH 對脫苦效果的影響

分別取pH 為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 的柚汁4.0 mL 裝入6 根試管中，并向各試管中添加25%的粗酶液，在40 ℃溫度條件下酶解90 min，酶解結(jié)束后測定各反應(yīng)體系中柚皮苷的含量，并計(jì)算其脫苦率.

1.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取反應(yīng)時間（A）、反應(yīng)溫度（B）和酶液量（C）為試驗(yàn)因素，以柚皮苷的脫苦率為試驗(yàn)指標(biāo)，設(shè)計(jì)了3 因素3 水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其水平編碼表見表1.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶解時間對脫苦效果的影響

酶解時間對柚汁脫苦率的影響如圖1 所示.脫苦率隨著時間的延長而提高，在酶解時間為90 min 時脫苦率達(dá)到最高值.隨著酶解時間延長，脫苦率呈逐步降低趨勢.其可能原因?yàn)槊附鈺r間較短時，底物濃度較高，限制了酶解反應(yīng)的產(chǎn)率.隨著酶解反應(yīng)時間增加，酶與底物充分接觸，酶解反應(yīng)的速率達(dá)到最大.當(dāng)酶解反應(yīng)產(chǎn)率達(dá)到最大后，導(dǎo)致果汁中其他物質(zhì)轉(zhuǎn)成后苦味物質(zhì)[14]，說明柚皮苷酶的酶解反應(yīng)為可逆反應(yīng)，此結(jié)果與鄧媛等人的研究結(jié)論一致[15].故本研究采用的酶解較優(yōu)時間為90 min.

圖1 酶解時間對脫苦效果的影響

2.1.2 酶解溫度對脫苦效果的影響

酶解溫度對柚汁脫苦效率如圖2 所示.脫苦率隨著溫度的升高而增大.當(dāng)酶解溫度達(dá)到40 ℃時脫苦率最高.繼續(xù)升高酶解溫度，脫苦率顯著降低.其主要原因?yàn)檩^高的反應(yīng)溫度有利于酶與底物分子碰撞次數(shù)增加，提高酶促反應(yīng)速度.但過高的反應(yīng)溫度，將嚴(yán)重抑制柚皮苷酶活性，進(jìn)而降低酶促反應(yīng)的效率，脫苦效率降低[16]，故較優(yōu)酶解溫度為40 ℃.

圖2 酶解溫度對脫苦效果的影響

2.1.3 酶液量對脫苦效果的影響

酶液添加量對柚子汁脫苦效率的影響如圖3 所示.在酶液量為25%時達(dá)到最大脫苦率，隨后在隨著酶用量增加有所下降.這是可能是因?yàn)槊敢毫坎蛔?，柚皮苷水解不能完全，脫苦率不高；若酶液量過多，底物濃度相對降低，則反應(yīng)物與酶接觸不充分，并且酶與酶之間也會產(chǎn)生競爭性抑制[17].故較優(yōu)的酶液量為25%.

圖3 酶液量對脫苦效果的影響

2.1.4 pH 對脫苦效果的影響

本研究中柚子汁的pH 與柚皮苷酶對長壩沙田柚汁脫苦效率的關(guān)系如圖4 所示.當(dāng)柚子汁的pH 值不超過4 時，柚皮苷酶對柚子汁的脫苦率隨著pH 值的升高而增大.當(dāng)pH 值大于4.0 后，柚皮苷酶對柚子汁脫苦與pH 值負(fù)相關(guān).其原因主要在于pH 直接影響酶蛋白的構(gòu)象，以及影響底物和酶活性中心部位基團(tuán)的解離，進(jìn)而影響酶反應(yīng)的速度，甚至導(dǎo)致柚皮苷酶變性而失活[18-19].故本研究中底物酶解較適pH 為4.0.

圖4 果汁的pH 對酶法脫苦的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

采用Design-expert 8 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共產(chǎn)生了17 個試驗(yàn)，其中12 個試驗(yàn)為析因試驗(yàn)，5個為中心試驗(yàn)以估計(jì)誤差.試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2 所示.

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

表2 中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，相關(guān)系數(shù)R2=0.915 1，說明響應(yīng)面（脫苦率）的變化有91.51%來源于所選變量，即反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和酶液量.因此，回歸方程可以較好的描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用回歸方程確定最佳提取工藝條件.

2.2.2 響應(yīng)面交互及優(yōu)化

通過回歸模型預(yù)測的柚皮苷酶解工藝最佳條件為：酶解溫度為40.7 ℃，酶解時間為83.7 min，酶液量26.8%.在此條件下，脫苦率理論上可以達(dá)到70.5%，考慮到實(shí)際操作的可行性，將回歸方程得到的理論值修正為：酶解溫度為40 ℃，酶解時間為85 min，酶液量為27.5%.在此酶解條件下重復(fù)3 次試驗(yàn)，平均脫苦率為70.4%，與理論值相差甚微，說明采用響應(yīng)面得到的柚皮苷酶對柚子汁脫苦的工藝參數(shù)是準(zhǔn)確可靠.此外，本研究采用的自有黑曲酶產(chǎn)柚皮苷酶顯著高于商品柚皮苷酶（600 IU/g）對長壩沙田柚子汁脫苦率（51.5%）[12]，進(jìn)一步提高了柚皮苷酶用于柚子汁脫苦的經(jīng)濟(jì)性，為其工業(yè)應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

3 結(jié)論

本文通過利用黑曲霉（從柚子中分離）的柚皮苷酶對粵北長壩柚子汁進(jìn)行脫苦試驗(yàn)研究.響應(yīng)面優(yōu)化研究結(jié)果表明，酶液添加量為柚子汁27.5%、酶解溫度40 ℃、柚子汁pH 值為4.0、酶解時間85 min 時，柚皮苷酶對柚子汁的脫苦率達(dá)到最大值70.4%，顯著高于商品柚皮苷酶對柚子汁的脫苦效率，為粵北長壩柚子脫苦加工生產(chǎn)提供重要技術(shù)支撐.但由于本研究所采用的是粗酶液，純化后柚皮苷酶脫苦效果仍有待于進(jìn)一步研究.另外，柚子果實(shí)品種繁多，柚子中所含的苦味成分以及其含量與其栽種的環(huán)境密切相關(guān).因此，黑曲霉產(chǎn)柚皮苷酶對于不同品種的柚子脫苦效果有待進(jìn)一步研究.