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    利用代謝組學(xué)揭示脫落酸對(duì)高溫脅迫龍須菜(Gracilariopsis lemaneiformis)的作用機(jī)制*

    2022-01-19 05:54:32羅素雅虞新磊陳瓊琳劉士霞徐年軍
    海洋與湖沼 2022年1期
    關(guān)鍵詞:龍須菜黃嘌呤嘌呤

    羅素雅 虞新磊 陳瓊琳 劉士霞 徐年軍 孫 雪

    利用代謝組學(xué)揭示脫落酸對(duì)高溫脅迫龍須菜()的作用機(jī)制*

    羅素雅 虞新磊 陳瓊琳 劉士霞 徐年軍 孫 雪①

    (寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江寧波 315211)

    大型經(jīng)濟(jì)海藻龍須菜()在我國(guó)南北方海域廣泛栽培, 但其栽培周期與產(chǎn)量受到夏季高溫天氣的制約。植物激素脫落酸(ABA)在高等植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆脅迫中發(fā)揮了重要作用, 但在藻類中研究較少。為揭示ABA對(duì)高溫脅迫下龍須菜的保護(hù)作用及其潛在的作用機(jī)制, 采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)研究了外源ABA對(duì)高溫脅迫下龍須菜代謝產(chǎn)物的影響。結(jié)果表明, ABA處理72 h后龍須菜中104種代謝物發(fā)生變化, 其中黃嘌呤、次黃嘌呤、蘆丁、精氨酰琥珀酸等26種代謝物含量升高, 而23種溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)和35種溶血磷脂酰膽堿(LPC)含量下降; 嘌呤代謝、黃酮和黃酮醇合成以及抗壞血酸和醛酸鹽代謝這3條代謝通路受ABA影響顯著。最后, 利用生理生化方法檢測(cè)了黃嘌呤對(duì)高溫脅迫下龍須菜生長(zhǎng)速率和活性氧(ROS)的影響, 以及ABA添加后兩種溶血磷脂代謝酶活性、精氨酰琥珀酸合成酶及其基因表達(dá)的變化, 發(fā)現(xiàn)藻的生長(zhǎng)、酶活性或基因表達(dá)變化等與代謝組結(jié)果相吻合??梢?jiàn), ABA可以通過(guò)激活嘌呤代謝、黃酮和黃酮醇合成以及抑制溶血磷脂合成等來(lái)保護(hù)高溫脅迫下的龍須菜。研究結(jié)果豐富了藻類中植物激素抗逆脅迫的資料, 為龍須菜耐高溫品系選育提供了新的思路。

    龍須菜; 高溫脅迫; 代謝組學(xué); 脫落酸

    大型海藻龍須菜()隸屬紅藻門(mén)(Rhodophyta)、江蘺目(Gracilariales), 主要用來(lái)生產(chǎn)瓊膠和用作鮑的餌料。野生型龍須菜主要分布在山東半島海域, 其適宜生長(zhǎng)溫度為10~23 °C。而耐高溫龍須菜 981 的生長(zhǎng)適溫范圍在12~26 °C(張學(xué)成等, 2008)。后來(lái), 耐高溫龍須菜2007和魯龍1號(hào)也相繼選育成功。目前, 龍須菜在山東、福建、廣東等沿海地區(qū)大面積栽培, 形成了龍須菜產(chǎn)業(yè)。但南方海區(qū)的高溫仍然會(huì)阻礙龍須菜的生長(zhǎng), 限制龍須菜的生長(zhǎng)周期, 影響了其產(chǎn)量與效益。

    脫落酸(ABA)是一種倍半萜結(jié)構(gòu)的植物激素, 在植物芽休眠、落葉、種子發(fā)育、果實(shí)成熟等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有調(diào)節(jié)作用(Barrero, 2005)。20世紀(jì)60年代, ABA首次在棉鈴中被發(fā)現(xiàn)(Addicott, 1969)。后來(lái)ABA結(jié)合蛋白和合成相關(guān)基因在高等植物中也被檢測(cè)出 (Zhang, 2002; Du, 2010)。相比于高等植物, 藻類中ABA含量更低, 因此檢測(cè)較困難。Yal??n等(2019)利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)在江蘺()、珊瑚藻()中檢測(cè)到微量ABA, 分別為 0.24和0.31 ng/g DW(干重)。Gupta等(2011)在5種石莼屬綠藻中檢測(cè)到ABA、赤霉素(GA3)、吲哚-3-乙酸(IAA)等6種植物激素, 其中ABA含量最高, 為19.68~68.28 nmol/g FW(鮮重)。作為植物生命活動(dòng)過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子, 除了參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程, 內(nèi)源或外源ABA在抵抗外界非生物脅迫方面也發(fā)揮了重要作用(Cutler, 2010)。在鹽脅迫條件下, 單細(xì)胞紅藻中ABA大量積累, 而其ABA缺失突變體對(duì)鹽脅迫則很敏感(Kobayashi, 2016); 10 μmol/L ABA可提高鹽脅迫下生菜()的色素含量、光合作用參數(shù), 從而增強(qiáng)對(duì)鹽脅迫的抗性(Xie, 2018)。除了鹽度和干旱脅迫(Zhou, 2016), ABA在響應(yīng)溫度脅迫中也發(fā)揮了作用。如噴施ABA可促進(jìn)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝來(lái)逆轉(zhuǎn)高溫引起的水稻小穗的花粉敗育(Rezaul, 2019); 外源ABA可通過(guò)增強(qiáng)野生型水稻的碳水化合物含量和熱休克蛋白活性來(lái)增強(qiáng)其耐熱性(Li, 2020a)。在冷脅迫下, 條斑紫菜()中ABA直接合成途徑中的法尼基焦磷酸合成酶基因表達(dá)上調(diào)(Sun, 2015)。

    代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的一門(mén)學(xué)科, 它從整體角度對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析, 關(guān)注的多是分子量小于1 000的小分子代謝物。目前在代謝組學(xué)中使用較為廣泛的是UPLC-MS/MS技術(shù), 它具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性高等特點(diǎn), 已成為小分子物質(zhì)定量分析常用的方法。利用代謝組學(xué)方法來(lái)研究ABA對(duì)植物代謝水平的影響已有報(bào)道。如Broekgaarden等(2018)利用代謝組學(xué)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究了甘藍(lán)()對(duì)粉虱抗性的分子機(jī)制, 發(fā)現(xiàn)ABA在其中發(fā)揮了作用; Murcia等(2017)利用代謝組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)外源添加ABA/GA3可以促進(jìn)葡萄()中脯氨酸、單萜和倍半萜的積累, 從而來(lái)抵御生物和非生物脅迫。

    本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)外源添加ABA可以促進(jìn)高溫脅迫下龍須菜的生長(zhǎng), 增加甘露醇、脯氨酸、海藻糖等含量。在此基礎(chǔ)上, 本文利用基于UPLC-MS/MS的代謝組學(xué)方法探究了ABA對(duì)高溫脅迫下龍須菜的整體代謝水平的影響, 為研究藻類植物激素的作用及后續(xù)利用植物激素提高龍須菜抗逆性提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料培養(yǎng)與處理

    本實(shí)驗(yàn)所用龍須菜981于2020年6月采自福建霞浦龍須菜養(yǎng)殖場(chǎng)(26°65′N, 119°66′E)。將充分洗刷去除泥沙、附著生物后的新鮮藻體在0.7%碘化鉀中浸泡10 min, 再用滅菌海水清洗2~3次。取3~5 cm藻體尖端在23 °C、鹽度25的人工海水、光照強(qiáng)度40 μmol/(m2×s)、光周期12L:12D的條件下預(yù)培養(yǎng)2~3 d。然后在高溫(33 °C)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置2組: 對(duì)照組(不加ABA)和ABA組(添加ABA至終濃度為50 μmol/L), 其他培養(yǎng)條件與預(yù)培養(yǎng)條件均相同。每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

    1.2 UPLC-MS/MS樣品制備

    在培養(yǎng)第3天, 稱取3 g龍須菜置于凍干機(jī)(Scientz-IOOF)中真空冷凍干燥。利用研磨儀(MM400, Retsch)研磨(30 Hz) 1.5 min至粉末狀。再稱取100 mg藻粉, 溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中; 每30 min渦旋一次, 每次持續(xù)30 s, 共渦旋6次后置于4 °C冰箱過(guò)夜。再以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后, 吸取上清, 最后用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾樣品后置于進(jìn)樣瓶中, 用于UPLC-MS/MS分析。

    1.3 色譜質(zhì)譜采集條件

    超高效液相色譜采用 Agilent SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)。流動(dòng)相A為超純水(含0.1%的甲酸), B為乙腈(含0.1%的甲酸)。梯度洗脫程序?yàn)? min, 5% B; 0~9 min, 5%~95% B; 9~10 min, 95% B; 10~11.10 min, 95%~5% B; 11.10~14 min, 5% B; 流速為0.35 mL/min。柱溫40 °C, 進(jìn)樣量為4 μL。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源溫度550 °C, 質(zhì)譜電壓5500 V (正離子模式)/–4500 V (負(fù)離子模式), 簾氣為25 psi, 碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級(jí)桿中根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞掃描檢測(cè)每個(gè)離子對(duì)(Chen, 2013)。

    1.4 代謝物定性定量分析

    在三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下篩選出每個(gè)物質(zhì)的特征離子, 在檢測(cè)器中獲得特征離子的信號(hào)強(qiáng)度, 用Multia Quant軟件打開(kāi)樣本下機(jī)質(zhì)譜文件, 進(jìn)行色譜峰的積分和校正工作, 每個(gè)色譜峰的峰面積代表對(duì)應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)含量。

    1.5 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析

    對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行主成分分析(PCA)來(lái)判定各個(gè)樣品的分離情況, 再使用正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)過(guò)濾不相關(guān)變量后篩選差異變量。本研究主要依據(jù)OPLS-DA模型分析的變量投影重要度(VIP)和差異倍數(shù)(fold change)篩選差異代謝物, 篩選條件為VIP≥0.8和fold change≥1.6 (或≤0.625)。對(duì)差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集, 結(jié)果以氣泡圖表示, 其中rich factor為通路中的差異代謝物的個(gè)數(shù)與該通路注釋到的代謝物總數(shù)的比值。再將ABA影響顯著的幾條代謝途徑進(jìn)行代謝通路分析。

    1.6 相對(duì)生長(zhǎng)速率測(cè)定

    在33 °C培養(yǎng)的龍須菜中分別添加0、50、100、200和400 μmol/L的黃嘌呤, 培養(yǎng)3 d后進(jìn)行藻生長(zhǎng)的測(cè)定。準(zhǔn)確稱量龍須菜藻體初始鮮重(g)以及第3天的鮮重, 按照以下公式計(jì)算龍須菜的相對(duì)生長(zhǎng)速率(RGR) (Abreu, 2009):

    RGR(%/d)=(lnW–ln0)/×100%, (1)

    式中,0和W分別為開(kāi)始培養(yǎng)和第天時(shí)藻體鮮重,為實(shí)驗(yàn)天數(shù)(3 d)。

    1.7 活性氧(ROS)測(cè)定

    按照與1.6相同的濃度設(shè)置添加黃嘌呤, 在培養(yǎng)3 d后進(jìn)行藻體ROS的測(cè)定。稱取0.15 g 龍須菜, 采用活性氧酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海江萊)測(cè)定藻體ROS活性。

    1.8 酶活性分析

    設(shè)置與1.1相同的對(duì)照組和ABA組進(jìn)行龍須菜的培養(yǎng), 分別取0、12、24、48和72 h培養(yǎng)的龍須菜0.1 g, 按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行酶活性測(cè)定。使用磷脂酶A2(PLA2)試劑盒(蘇州科銘)測(cè)定磷脂酶A2酶活性; 分別使用溶血磷脂酰膽堿?;D(zhuǎn)移酶1(LPCAT1)酶聯(lián)免疫分析試劑盒和植物精氨酰琥珀酸合成酶(ASS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒來(lái)測(cè)定LPCAT1和ASS活性, 以上兩個(gè)試劑盒均購(gòu)自上??婆d。

    1.9 基因表達(dá)量分析

    設(shè)置與1.1相同的對(duì)照組和ABA組進(jìn)行龍須菜的培養(yǎng), 分別取0、12、24、48和72 h培養(yǎng)的龍須菜0.1 g在液氮中研磨成粉末用于總RNA提取。使用Plant RNA Kit (OMEGA)來(lái)提取總RNA, 使用iScript cDNA Synthesis Kit (BIO-RAD)來(lái)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)龍須菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中基因序列, 利用 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)該基因的正反向引物(其序列分別為5′-ATGTCCAAAGGCAAAGTCGT-3′和5′-GTCTGCGATGTAGCAAATGA-3′)。使用基因作為內(nèi)參, 在Eppendorf熒光定量PCR儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 內(nèi)參引物序列、擴(kuò)增程序等參考孫鵬等(2019)。采用2–ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量(Livak, 2001)。

    1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    使用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示。采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)和Tukey多重比較分析, 以<0.05為差異顯著水平。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCA和OPLS-DA結(jié)果

    本研究采用UPLC-MS/MS進(jìn)行廣泛靶向代謝組分析, 在龍須菜中共檢測(cè)到 419 種代謝物, 包括114種脂質(zhì)、65種氨基酸及其衍生物、52種核苷酸及其衍生物、45種有機(jī)酸等。對(duì)這些代謝物進(jìn)行了主成分分析(圖1a), 第一主成分(PC1)占比44.8%, 第二主成分(PC2)占比18.6%。以上結(jié)果說(shuō)明ABA組與對(duì)照組樣本分離良好, 兩個(gè)組存在顯著差異。

    在構(gòu)建的OPLS-DA模型中(圖1b),2為0.952,2為0.65,2為0.997。2>0.9說(shuō)明我們構(gòu)建的模型較好。從圖中可以看出對(duì)照組和ABA組樣品之間差異明顯。

    圖1 主成分分析(a)和正交偏最小二乘法判別分析(b)

    2.2 高溫下龍須菜響應(yīng)ABA的代謝物

    以VIP值以及差異倍數(shù)為條件, 我們共篩選到104種差異代謝物(部分差異代謝物見(jiàn)表1), 其中26種物質(zhì)含量上升, 78種物質(zhì)含量下降。

    表1 UPLC-MS/MS方法篩選到的部分差異代謝物

    注: *表示該物質(zhì)具有同分異構(gòu)體

    在26種上調(diào)差異代謝物中(圖2a), 核苷酸及其衍生物數(shù)量最多(7種), 包括9-次黃嘌呤、別嘌呤醇、次黃嘌呤、黃嘌呤等, 占總差異代謝物的26.92%; 其次為黃酮類化合物(6種, 23.08%), 包括蘆丁、槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素-7-O-蕓香糖苷及異槲皮素等。除了以上兩類代謝物之外, 還檢測(cè)到精氨酰琥珀酸等3種有機(jī)酸、原花青素B2等3種鞣質(zhì)以及2種酚酸和1種氨基酸(甲硫氨酸)上調(diào)。在上調(diào)的差異代謝物中, 蘆丁上調(diào)幅度最大(11.36倍); 而在3種有機(jī)酸中, 精氨酰琥珀酸上調(diào)幅度最大(2.45倍)。

    在78種下調(diào)差異代謝物中(圖2b), 脂質(zhì)數(shù)量最多, 共68種(87.18%), 其中有23種溶血磷脂酰乙醇胺(LPE), 包括溶血磷脂酰乙醇胺15:0、16:0、18:2等, 以及35種溶血磷脂酰膽堿(LPC), 包括溶血磷脂酰膽堿14:0、15:0、16:2等(表1中未列出)。其次為3種核苷酸及其衍生物、2種生物堿(D-葡萄糖醇衍生物、3-氧基-2-羥丙基棕櫚酸酯)、1種酚酸(松柏醛)及1種鞣質(zhì)(肉桂單寧D1)。

    圖2 差異代謝物歸類

    注: a. 上調(diào)代謝物; b. 下調(diào)代謝物

    2.3 高溫下龍須菜響應(yīng)ABA的代謝途徑

    將龍須菜中差異代謝物映射至PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得匹配的代謝物信息, 并搜索擬南芥()代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析(圖3)。KEGG富集結(jié)果表明, 代謝途徑(metabolic pathways)和次級(jí)代謝物的合成(biosynthesis of secondary metabolites)這兩個(gè)途徑富集到的差異代謝物最多, 分別有16種和9種; 其次為嘌呤代謝(purine metabolism)和抗壞血酸和醛酸鹽代謝(ascorbate and aldarate metabolism), 分別有5種和3種代謝物。從富集程度上來(lái)看, 嘌呤代謝、黃酮和黃酮醇合成(flavone and flavonol biosynthesis)、抗壞血酸和醛酸鹽代謝通路富集程度較高。

    將受ABA影響顯著富集的嘌呤代謝、黃酮和黃酮醇合成代謝途徑用簡(jiǎn)單的通路圖表示(圖4)。如圖所示, ABA的添加顯著促進(jìn)了高溫下龍須菜的嘌呤代謝, 其代謝途徑中的部分代謝物含量顯著上升, 如2′-脫氧肌苷-5′-單磷酸、次黃嘌呤和黃嘌呤, 分別是對(duì)照組的2.08倍、2.26倍、2.10倍。

    在黃酮和黃酮醇合成途徑中, 其中間產(chǎn)物蘆丁和異槲皮素分別上調(diào)至對(duì)照組的11.36倍、2.03倍, 表明ABA顯著促進(jìn)了高溫下龍須菜中黃酮和黃酮醇的合成。

    2.4 黃嘌呤對(duì)高溫下龍須菜生長(zhǎng)和ROS的影響

    在表1中, ABA添加后龍須菜中黃嘌呤的含量顯著上升(2.10倍)。為了探究黃嘌呤對(duì)高溫脅迫下龍須菜的影響, 我們比較了不同濃度黃嘌呤對(duì)龍須菜生長(zhǎng)和ROS的影響(圖5)。結(jié)果表明, 100和200 μmol/L黃嘌呤顯著促進(jìn)了高溫下龍須菜的生長(zhǎng), 其RGR分別是對(duì)照組的1.35倍和2.13倍(<0.05)。同時(shí), 100和200 μmol/L黃嘌呤也降低了ROS活性, 比對(duì)照組分別下降了22.32%、26.89%(<0.05)。這說(shuō)明合適濃度的黃嘌呤能促進(jìn)高溫下龍須菜的生長(zhǎng), 并且有助于清除高溫下產(chǎn)生的ROS。

    圖3 ABA影響的龍須菜中顯著富集的代謝通路

    注: 橫坐標(biāo)表示每個(gè)通路對(duì)應(yīng)的rich factor, 縱坐標(biāo)為通路名稱。氣泡顏色表示富集程度; 氣泡大小表示富集代謝物的數(shù)目

    圖4 ABA影響的龍須菜中嘌呤代謝(a)和黃酮和黃酮醇合成(b)通路

    注: 方框內(nèi)數(shù)字表示代謝物的變化倍數(shù), 紅色表示上調(diào)倍數(shù)。實(shí)線箭頭代表一步完成的反應(yīng), 虛線箭頭代表需要多步反應(yīng)

    圖5 黃嘌呤對(duì)高溫脅迫下龍須菜生長(zhǎng)(a)和ROS(b)的影響

    注: 不同小寫(xiě)字母表示不同黃嘌呤濃度組之間差異顯著(<0.05)

    2.5 ABA對(duì)高溫下龍須菜ASS活性及其基因表達(dá)的影響

    在表1中, 龍須菜中精氨酰琥珀酸含量受ABA影響顯著上升(2.45倍), 因此我們對(duì)其合成酶ASS活性及其基因表達(dá)水平進(jìn)行了分析(圖6)。在高溫脅迫的72 h內(nèi), ABA組藻的ASS活性在12 h和72 h時(shí)分別較對(duì)照組提高了8.21%和11.60% (<0.05), 而其他時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組無(wú)顯著差異。在高溫脅迫的48 h內(nèi), ABA組藻的表達(dá)水平增加, 為對(duì)照組的1.36~2.73倍(<0.05)。以上結(jié)果表明高溫脅迫下外源添加ABA可一定程度地促進(jìn)龍須菜ASS活性及其基因表達(dá)量的升高。ASS活性及其轉(zhuǎn)錄水平的變化與代謝組結(jié)果中精氨酰琥珀酸含量上升的結(jié)果一致。

    2.6 ABA對(duì)高溫下龍須菜PLA2和LPCAT1活性的影響

    在篩選到的差異代謝物中, 大量LPC受ABA影響下調(diào), 因此我們對(duì)LPC的合成酶PLA2和降解酶LPCAT1進(jìn)行了分析(圖7)。在高溫脅迫12 h時(shí), 對(duì)照組和ABA組藻中的PLA2活性無(wú)差別, 而在24、48、72 h時(shí), ABA組中龍須菜PLA2活性降低, 分別比對(duì)照組下降13.39%、34.30%、21.03% (<0.05)。與PLA2不同, LPCAT1活性在12 h時(shí)顯著下降, 但在24和48 h時(shí)ABA組藻的LPCAT1活性升高, 分別是對(duì)照組的1.62和1.38倍(<0.05), 而在72 h時(shí)沒(méi)有顯著差異。該結(jié)果表明外源ABA可通過(guò)抑制PLA2活性、激活LPCAT1活性來(lái)降低LPC含量。

    圖6 ABA對(duì)高溫脅迫下龍須菜ASS活性(a)和ass基因表達(dá)(b)的影響

    注: 不同小寫(xiě)字母表示相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與ABA組差異顯著(<0.05)

    圖7 ABA對(duì)高溫脅迫下龍須菜PLA2活性(a)和LPCAT1活性(b)的影響

    注: 不同小寫(xiě)字母表示相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與ABA組差異顯著(<0.05)

    3 討論

    隨著溫室效應(yīng)的加劇, 海水溫度逐年上升。在高溫脅迫下, 高等植物和藻類的代謝活動(dòng)如光合作用、呼吸代謝、營(yíng)養(yǎng)元素轉(zhuǎn)運(yùn), 以及代謝酶的活性和有機(jī)物的積累等都會(huì)受到影響。高溫可使長(zhǎng)心卡帕藻()、異枝卡帕藻()的實(shí)際光合效率和相對(duì)光合電子傳遞效率顯著下降(趙素芬等, 2011)。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中, 植物已形成一系列包括植物激素在內(nèi)的應(yīng)對(duì)外界不利環(huán)境的應(yīng)激防御機(jī)制。如ABA可抑制高溫下水稻丙二醛含量增加從而來(lái)降低熱損害對(duì)膜脂的損傷(Li, 2014)。水楊酸可提高龍須菜抗氧化酶活性和脯氨酸含量來(lái)增強(qiáng)藻體對(duì)高溫的抗性(王重彬等, 2015)。24-表油菜素內(nèi)酯可顯著增加黃瓜()脯氨酸含量以降低鹽脅迫對(duì)其產(chǎn)生的負(fù)面影響(Fariduddin, 2013)。

    3.1 嘌呤代謝對(duì)逆境脅迫和激素的響應(yīng)

    在高等植物中, 嘌呤參與了氮代謝、黃酮合成及植物激素合成等代謝過(guò)程(Aguey-Zinsou, 2003; Irani, 2018)。黃嘌呤脫氫酶(XDH)是嘌呤代謝過(guò)程的重要酶, 可以催化黃嘌呤和次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿囊素等酰脲類化合物(吳自明等, 2012), 它可通過(guò)調(diào)節(jié)氮代謝、活性氧代謝來(lái)幫助植物應(yīng)對(duì)不良環(huán)境(Brychkova, 2008)。如在高溫脅迫下擬南芥通過(guò)升高XDH1活性來(lái)清除葉綠體中過(guò)氧化氫(H2O2) (Ma, 2016)。XDH還參與了植物激素如ABA、IAA等代謝過(guò)程(Taylor, 2001; Watanabe, 2014a)。此外, 嘌呤代謝的中間產(chǎn)物尿囊素也參與了ABA代謝過(guò)程, 它在非生物脅迫下可以大量積累啟動(dòng)ABA合成, 從而提高對(duì)逆境脅迫的耐受性(Watanabe, 2014b)。在本研究中, ABA顯著增強(qiáng)了龍須菜嘌呤代謝, 其中間代謝物2′-脫氧肌苷-5′-單磷酸、次黃嘌呤和黃嘌呤均為對(duì)照組的2倍以上。我們推測(cè)ABA添加促使嘌呤代謝向下游途徑進(jìn)行, 使其積累更多尿囊素等抗逆代謝物質(zhì)。

    在高溫脅迫下, ABA能夠提高植物的抗氧化能力和H2O2含量。H2O2作為信號(hào)分子可以調(diào)節(jié)熱應(yīng)激反應(yīng)減少過(guò)量的ROS產(chǎn)生(Driedonks, 2015)。在本研究中, ABA可以促使黃嘌呤顯著積累, 而外源添加黃嘌呤也能顯著促進(jìn)高溫下龍須菜生長(zhǎng)、降低ROS活性。因此推測(cè)ABA可能通過(guò)促進(jìn)嘌呤代謝中間代謝物的積累來(lái)抑制ROS活性, 從而參與了抗高溫的逆境應(yīng)答。

    3.2 黃酮類化合物對(duì)逆境脅迫和激素的響應(yīng)

    黃酮類化合物廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子中, 包括黃酮、黃酮醇、蘆丁、花青素等。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中, 黃酮類化合物能調(diào)控生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)、影響花粉發(fā)育、調(diào)節(jié)葉片氣孔開(kāi)度等(Stracke, 2010; Silva-Navas, 2016)。此外, 黃酮類化合物具有增強(qiáng)植物抗逆性和化學(xué)防御功能。如在水分脅迫下, 高粱()中的黃酮含量從0.14 μg/g增加到157.2 μg/g (Pinheiro, 2021)?;ㄇ嗨氐拇罅糠e累可以減緩干旱脅迫下擬南芥內(nèi)ROS的積累(Nakabayashi, 2015)。蘆丁和蘆丁水解酶還參與了植物對(duì)抗紫外線、低溫和干旱等抗逆防御反應(yīng)(Suzuki, 2015)。

    外源植物激素可以促進(jìn)黃酮類化合物的積累及其合成相關(guān)基因的表達(dá)。如噴施ABA可以增加葡萄()果皮中花青素的含量(Yamamoto, 2015)。100 μmol/L水楊酸的添加使貫葉連翹()總黃酮含量較對(duì)照組提高了2.7倍(Wang, 2015)。外源ABA誘導(dǎo)了苦蕎麥()中大部分蘆丁合成相關(guān)基因如查爾酮合酶()、黃烷酮-3-羥化酶()和黃酮醇合成酶()等的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(Li, 2020b)。在本文中, ABA處理使高溫下龍須菜中蘆丁、異槲皮素含量顯著積累, 尤其是前者積累量達(dá)到對(duì)照組的11.36倍。這表明ABA可能通過(guò)促進(jìn)黃酮和黃酮醇合成代謝來(lái)保護(hù)高溫脅迫下的龍須菜。

    3.3 脂質(zhì)對(duì)逆境脅迫和激素的響應(yīng)

    細(xì)胞膜是植物維持正常生命活動(dòng)的基本結(jié)構(gòu), 當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí), 體內(nèi)的ROS含量上升導(dǎo)致脂膜質(zhì)過(guò)氧化, 從而破壞細(xì)胞膜的完整性。在高溫環(huán)境中, 壇紫菜()中ROS顯著積累, 對(duì)細(xì)胞造成損害甚至抑制藻的生長(zhǎng)(Yang, 2013)。但植物可以通過(guò)膜脂質(zhì)的重塑和膜脂不飽和度的降低來(lái)適應(yīng)高溫環(huán)境(Zheng, 2011)。擬南芥在17 °C時(shí)脂肪酸的雙鍵指數(shù)為2.39, 而在36 °C時(shí)則下降了38.91% (Falcone, 2004); 煙草()可以通過(guò)提高半乳糖脂含量和降低脂肪酸不飽和度來(lái)增強(qiáng)其耐熱性(Murakami, 2000)。

    溶血磷脂廣泛存在于生物體的細(xì)胞膜中, 主要作用是參與各種磷脂的合成等(Simons, 2011)。按其底物來(lái)源不同, 溶血磷脂主要包括LPC、LPE、溶血磷脂酸(LPA)等。溶血磷脂有較強(qiáng)的表面活性, 過(guò)高濃度溶血磷脂會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)(李招等, 2018)。本研究利用代謝組方法檢測(cè)到大量LPC和LPE含量降低, 這可能與ABA能夠減緩細(xì)胞膜的損傷有關(guān)。LPC可以由磷脂酰膽堿(PC)通過(guò)PLA2等磷脂酶水解形成, 而LPC在LPCAT作用下得到一個(gè)脂?;挚缮蒔C (Lands, 1960)。PC是一種甘油醇磷脂, 它不僅是細(xì)胞膜的組成成分, 還是脂質(zhì)信號(hào)分子合成的前體物質(zhì)。在對(duì)代謝組結(jié)果的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中, 我們發(fā)現(xiàn)高溫下龍須菜中PLA2活性下降, 而LPCAT1酶活性多上升, 兩者的變化均使LPC含量降低。因此, 我們推測(cè)ABA添加后龍須菜中兩種溶血磷脂代謝酶的活性變化使更多的LPC向累積PC的方向進(jìn)行。而PC的增加有利于維持藻細(xì)胞膜的穩(wěn)態(tài), 減輕高溫帶來(lái)的不利影響。

    4 結(jié)論

    在高溫脅迫下, 50 μmol/L ABA添加后龍須菜中有104個(gè)代謝物發(fā)生變化, 其中黃嘌呤、次黃嘌呤、蘆丁、槲皮素衍生物、精氨酰琥珀酸等物質(zhì)含量升高, 而大量LPC和LPE含量降低, 這些差異代謝物直接或間接參與了龍須菜抵抗高溫脅迫的應(yīng)答。本文結(jié)果為植物激素在藻類抗高溫中的作用研究提供了理論資料。

    王重彬, 鄒同雷, 孫雪, 等, 2015. 水楊酸和茉莉酸甲酯對(duì)高溫龍須菜()理化及基因表達(dá)的影響[J]. 海洋與湖沼, 46(5): 1132-1138.

    孫鵬, 杜宇, 呂燕, 等, 2019. 龍須菜鹵代烷烴脫鹵酶基因的轉(zhuǎn)錄及原核表達(dá)[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 43(12): 2468-2475.

    李招, 谷克仁, 張海臣, 等, 2018. 溶血磷脂的制備、分離、檢測(cè)及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)油脂, 43(6): 132-136, 143.

    吳自明, 譚雪明, 韓瑞才, 等, 2012. 高等植物黃嘌呤脫氫酶的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 28(21): 159-163.

    張學(xué)成, 費(fèi)修綆, 2008. 全國(guó)水產(chǎn)原良種審定委員會(huì)審定品種-981龍須菜及其栽培技術(shù)介紹[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚(yú)(6): 21-22.

    趙素芬, 何培民, 2011. 高溫對(duì)兩種卡帕藻的酶活性、色素含量與葉綠素?zé)晒獾挠绊慬J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 31(22): 6845-6852.

    ABREU M H, VARELA D A, HENRíQUEZ L,, 2009. Traditional vs. integrated multi-trophic aquaculture ofC. J. Bird, J. McLachlan & E. C. Oliveira: productivity and physiological performance [J]. Aquaculture, 293(3/4): 211-220.

    ADDICOTT F T, LYON J L, 1969. Physiology of abscisic acid and related substances [J]. Annual Review of Plant Physiology, 20: 139-164.

    AGUEY-ZINSOU K F, BERNHARDT P V, LEIMKüHLER S, 2003. Protein film voltammetry ofxanthine dehydrogenase [J]. Journal of the American Chemical Society, 125(50): 15352-15358.

    BARRERO J M, PIQUERAS P, GONZáLEZ-GUZMáN M,, 2005. A mutational analysis of thegene ofhighlights the involvement of ABA in vegetative development [J]. Journal of Experimental Botany, 56(418): 2071-2083.

    BROEKGAARDEN C, PELGROM K T B, BUCHER J,, 2018. Combining QTL mapping with transcriptome and metabolome profiling reveals a possible role for ABA signaling in resistance against the cabbage whitefly in cabbage [J]. PLoS One, 13(11): e0206103.

    BRYCHKOVA G, ALIKULOV Z, FLUHR R,, 2008. A critical role for ureides in dark and senescence-induced purine remobilization is unmasked in theArabidopsismutant [J]. The Plant Journal, 54(3): 496-509.

    CHEN W, GONG L, GUO Z,,2013. A novel integrated method for large-scale detection, identification, and quantification of widely targeted metabolites: application in the study of rice metabolomics [J]. Molecular Plant, 6(6): 1769-1780.

    CUTLER S R, RODRIGUEZ P L, FINKELSTEIN R R,, 2010. Abscisic acid: emergence of a core signaling network [J]. Annual Review of Plant Biology, 61: 651-679.

    DRIEDONKS N, XU J M, PETERS J L,, 2015. Multi-level interactions between heat shock factors, heat shock proteins, and the redox system regulate acclimation to heat [J]. Frontiers in Plant Science, 6: 999.

    DU H, WANG N L, CUI F,, 2010. Characterization of the β-carotene hydroxylase geneconferring drought and oxidative stress resistance by increasing xanthophylls and abscisic acid synthesis in rice [J]. Plant Physiology, 154(3): 1304-1318.

    FALCONE D L, OGAS J P, SOMERVILLE C R, 2004. Regulation of membrane fatty acid composition by temperature in mutants of Arabidopsis with alterations in membrane lipid composition [J]. BMC Plant Biology, 4(4): 17.

    FARIDUDDIN Q, KHALIL R R A E, MIR B A,, 2013. 24-Epibrassinolide regulates photosynthesis, antioxidant enzyme activities and proline content ofunder salt and/or copper stress [J]. Environmental Monitoring and Assessment, 185(9): 7845-7856.

    GUPTA V, KUMAR M, BRAHMBHATT H,, 2011. Simultaneous determination of different endogenetic plant growth regulators in common green seaweeds using dispersive liquid-liquid microextraction method [J]. Plant Physiology and Biochemistry, 49(11): 1259-1263.

    IRANI S, TODD C D, 2018. Exogenous allantoin increasesArabidopsis seedlings tolerance to NaCl stress and regulates expression of oxidative stress response genes [J]. Journal of Plant Physiology, 221: 43-50.

    KOBAYASHI Y, ANDO H, HANAOKA M,, 2016. Abscisic acid participates in the control of cell cycle initiation through heme homeostasis in the unicellular red alga[J]. Plant and Cell Physiology, 57(5): 953-960.

    LANDS W E, 1960. Metabolism of glycerolipids. Ⅱ. The enzymatic acylation of lysolecithin [J]. The Journal of Biological Chemistry, 235(8): 2233-2237.

    LI G Y, ZHANG C X, ZHANG G H,, 2020a. Abscisic acid negatively modulates heat tolerance in rolled leaf rice by increasing leaf temperature and regulating energy homeostasis [J]. Rice, 13(1): 18.

    LI H, LIU S S, YI C Y,, 2014. Hydrogen peroxide mediates abscisic acid-induced HSP70 accumulation and heat tolerance in grafted cucumber plants [J]. Plant Cell & Environment, 37(12): 2768-2780.

    LI X, WU Z, XIAO S,, 2020b. Characterization of abscisic acid (ABA) receptors and analysis of genes that regulate rutin biosynthesis in response to ABA in[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 157: 432-440.

    LIVAK K J, SCHMITTGEN T D, 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod [J]. Methods, 25(4): 402-408.

    MA X F, WANG W M, BITTNER F,, 2016. Dual and opposing roles of xanthine dehydrogenase in defense-associated reactive oxygen species metabolism in Arabidopsis [J]. The Plant Cell, 28(5): 1108-1126.

    MURAKAMI Y, TSUYAMA M, KOBAYASHI Y,,2000. Trienoic fatty acids and plant tolerance of high temperature [J]. Science, 287(5452): 476-479.

    MURCIA G, FONTANA A, PONTIN M,, 2017. ABA and GA3regulate the synthesis of primary and secondary metabolites related to alleviation from biotic and abiotic stresses in grapevine [J]. Phytochemistry, 135: 34-52.

    NAKABAYASHI R, YONEKURA-SAKAKIBARA K, URANO K,, 2015. Enhancement of oxidative and drought tolerance in Arabidopsis by overaccumulation of antioxidant flavonoids [J]. The Plant Journal, 77(3): 367-379.

    PINHEIRO S S, DE MORAIS CARDOSO L, ANUNCIA??O P C,, 2021. Water stress increased the flavonoid content in tannin-free sorghum grains [J]. Journal of Food Composition and Analysis, 100: 103892.

    REZAUL I M, FENG B H, CHEN T T,, 2019. Abscisic acid prevents pollen abortion under high-temperature stress by mediating sugar metabolism in rice spikelets [J]. Physiologia Plantarum, 165(3): 644-663.

    SILVA-NAVAS J, MORENO-RISUENO M A, MANZANO C,, 2016. Flavonols mediate root phototropism and growth through regulation of proliferation-to-differentiation transition [J]. The Plant Cell, 28(6): 1372-1387.

    SIMONS K, SAMPAIO J L, 2011. Membrane organization and lipid rafts [J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 3(10): a004697.

    STRACKE R, FAVORY J J, GRUBER H,, 2010. The Arabidopsis bZIP transcription factor HY5 regulates expression of thegene in response to light and ultraviolet-B radiation [J]. Plant, Cell & Environment, 33(1): 88-103.

    SUN P P, MAO Y X, LI G Y,, 2015. Comparative transcriptome profiling of(Ueda) M.S. Hwang & H.G. Choi in response to temperature stresses [J]. BMC Genomics, 16(1): 463.

    SUZUKI T, MORISHITA T, KIM S J,, 2015. Physiological roles of rutin in the buckwheat plant [J]. Japan Agricultural Research Quarterly, 49(1): 37-43.

    TAYLOR N, COWAN K, 2001. Plant hormone homeostasis and the control of avocado fruit size [J]. Plant Growth Regulation, 35(3): 247-255.

    WANG J, QIAN J, YAO L Y,, 2015. Enhanced production of flavonoids by methyl jasmonate elicitation in cell suspension culture of[J]. Bioresources and Bioprocessing, 2(1): 5.

    WATANABE S, KOUNOSU Y, SHIMADA H,, 2014a. Arabidopsis xanthine dehydrogenase mutants defective in purine degradation show a compromised protective response to drought and oxidative stress [J]. Plant Biotechnology, 31(2): 173-178.

    WATANABE S, MATSUMOTO M, HAKOMORI Y,, 2014b. The purine metabolite allantoin enhances abiotic stress tolerance through synergistic activation of abscisic acid metabolism [J]. Plant, Cell & Environment, 37(4): 1022-1036.

    XIE Y D, SUN G C, WANG L M,, 2018. Effects of spraying abscisic acid on photosynthetic physiology of lettuce seedlings under salt stress [J]. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, 199(5): 052011.

    YAL?IN S, OKUDAN E ?, KARAKA? ?,, 2019. Identification and quantification of some phytohormones in seaweeds using UPLC-MS/MS [J]. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 42(15/16): 475-484.

    YAMAMOTO L Y, DEASSIS A M, ROBERTO S R,, 2015. Application of abscisic acid (S-ABA) to cv. Isabel grapes (′) for color improvement: effects on color, phenolic composition and antioxidant capacity of their grape juice [J]. Food Research International, 77: 572-583.

    YANG R, LIU W, ZHANG X L,, 2013. Sequences of-gene from(Bangiales, Rhodophyta) and its expression under heat shock [J]. Botanica Marina, 56(3): 249-259.

    ZHANG D P, WU Z Y, LI X Y,, 2002. Purification and identification of a 42-kilodalton abscisic acid-specific-binding protein from epidermis of broad bean leaves [J]. Plant Physiology, 128(2): 714-725.

    ZHENG G W, TIAN B, ZHANG F J,,2011. Plant adaptation to frequent alterations between high and low temperatures: remodelling of membrane lipids and maintenance of unsaturation levels [J]. Plant, Cell & Environment, 34(9): 1431-1442.

    ZHOU Y L, SUN X D, YANG Y Q,, 2016. Expression ofinenhances salt and drought tolerance and regulates abscisic acid signaling [J]. International Journal of Molecular Sciences, 17(6): 966.

    METABOLOMICS REVEALED THE POTENTIAL MECHANISM OF ABSCISIC ACID INUNDER HIGH TEMPERATURE STRESS

    LUO Su-Ya, YU Xin-Lei, CHEN Qiong-Lin, LIU Shi-Xia, XU Nian-Jun, SUN Xue

    (School of Marine Sciences, Ningbo University, Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang Province, Ningbo 315211, China)

    The economic seaweedis widely cultivated in the southern and northern coasts of China, yet its cultivation cycles and yields are restricted by high temperature in summer. Plant hormone abscisic acid (ABA) plays an important role in the growth, development, and stress resistance of higher plants, but the research onto algae is scarce. To reveal the protective role and potential mechanism of ABA on high-temperature stressed seaweed, the effect of exogenous ABA on metabolites of heat-resistant strain981 was analyzed using ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The results show that 104 metabolites were influenced after ABA addition, among them, 26 compounds including xanthine, hypoxanthine, rutin, argininosuccinic acid were accumulated; however, the contents of 23 lysophosphatidylethanolamines and 35 lysophosphatidylcholines were decreased. In addition, three pathways of flavone and flavonol biosynthesis, purine metabolism, ascorbate, and aldarate metabolism were significantly affected by ABA. Physiological and biochemical methods were used to verify the effects of xanthine on the growth and reactive oxygen species (ROS) ofunder high temperature stress, and the effects of ABA addition on the activities of two lysophosphatidic metabolic enzymes and one enzyme of argininosuccinate synthetase and its gene expression. It was found that the changes in algal growth, enzyme activity or gene expression were consistent with the metabolome outcome. Therefore, ABA could protect high-temperature stressedby up-regulating flavone and flavonol biosynthesis, purine metabolism and inhibiting lysophosphatide synthesis. This research provided a new insight for understanding the mechanism of plant hormones in algae against high temperature.

    ; high temperature stress; metabolomics; abscisic acid

    Q946; Q789; S968.4

    10.11693/hyhz20210800173

    *國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目, 2018YFD0901502號(hào); 浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目, LY19C190003號(hào); 寧波市重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目, 2019B10009號(hào)。羅素雅, 碩士研究生, E-mail: a986644857@163.com

    孫 雪, 博士, 研究員, E-mail: sunxue@nbu.edu.cn

    2021-08-02,

    2021-09-27

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