EMR固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蝦肉中性激素殘留的方法建立

辛麗娜，莫東淑，蔣定之，曾 堅(jiān)，梁飛燕，蒙初曦

（廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測中心，廣西南寧 530021）

近年來由于蝦的養(yǎng)殖過程中存在非法過量使用促進(jìn)生長的性激素等不規(guī)范操作，導(dǎo)致蝦肉制品中激素殘留量超標(biāo)時(shí)有發(fā)生[1?4]，諸如“激素蝦事件”等，因此蝦肉的性激素殘留量成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)之一[5?9]。性激素主要是由性腺（睪丸和卵巢）、腎上腺皮質(zhì)及調(diào)控器官產(chǎn)生和分泌的促（抑）性的甾體激素[10]，具有促生長的作用，因此常被用作促進(jìn)生長劑以加快動(dòng)物的生長發(fā)育，提高飼料的轉(zhuǎn)化利用率，但性激素由于穩(wěn)定性強(qiáng)、代謝時(shí)間長，蓄積于人們體內(nèi)會(huì)影響正常生理激素平衡，嚴(yán)重者將引發(fā)癌癥[11?14]。我國在2020年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部250號公告[14]已禁止使用己烯雌酚、甲基睪丸酮、群勃龍等化學(xué)合成類激素，并規(guī)定這些化合物在食品中不得檢出。盡管如此，由于商業(yè)利益驅(qū)動(dòng)，這些禁藥依然屢禁不止[15]。

蝦肉基質(zhì)復(fù)雜、性激素種類繁多，各種類化合物前處理步驟[16?17]不同且復(fù)雜，目前檢測性激素前處理的方法有液液萃取法[18]、固相萃取法[19]和超臨界流體萃取法[20?22]等。固相萃取法操作簡單、分離效果好且具有選擇性，廣泛應(yīng)用于檢測復(fù)雜基質(zhì)的前處理。超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[23?26]具有高效液相色譜法和串聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步提升了靈敏度和分離分析效率，簡化前處理步驟，且可在同一時(shí)間分析多種化合物等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源產(chǎn)品及水產(chǎn)品的藥物殘留檢驗(yàn)[27?28]。

目前，我國有關(guān)水產(chǎn)品的性激素檢測的國家檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)有：《農(nóng)業(yè)部958號公告-10-2007水產(chǎn)品中雌二醇?xì)埩袅康臏y定氣相色譜-質(zhì)譜法》[29]、《SN/T 1980-2007進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中孕激素類藥物殘留量的檢測方法高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜》[30]、《SC/T 3029-2006水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩袅康臏y定液相色譜》[31]、《農(nóng)業(yè)部1163號公告-9-2009動(dòng)物性食品中己烯雌酚殘留檢測氣相色譜-質(zhì)譜法》[32]、《SC/T 3020-2004水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的測定酶聯(lián)免疫法》[33]，均為單一化合物檢測?！禨N/T 3235-2012出口動(dòng)物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[34]對水產(chǎn)品性激素多組分化合物檢測，但此標(biāo)準(zhǔn)對本研究的15種性激素只包括其中2種，因此本研究建立的水產(chǎn)品15種性激素提取方法為首次研究，本研究使用固相萃取法對比兩種SPE萃取凈化柱，對蝦肉樣品的前處理進(jìn)行方法研究，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法分析檢測蝦肉中的15種性激素檢測，為水產(chǎn)品性激素多組分檢測研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮蝦肉 廣西沿海地區(qū)（包括北海市、欽州市、防城港市）共96批，去掉樣品中不可食用部分，取可食用部分，絞碎均質(zhì)后，?20 ℃冷凍保存，待檢測。

15種性激素標(biāo)準(zhǔn)品：雌三醇、雌二醇、炔雌醇、雌酮、炔諾酮、己烯雌酚、左炔諾孕酮、黃體酮、睪丸酮、甲基睪丸酮、群勃龍、醋酸甲羥孕酮、諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍 純度均大于98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、甲酸 色譜純，美國Thermo Fisher 公司；乙二胺四乙酸二鈉、氨水均分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Oasis PRiME HLB （3 mL 60 mg） 美國Waters公司；Captiva EMR-Lipid（3 mL，300 mg） 美國Agilent公司；實(shí)驗(yàn)用水 超純水。

QTRAP 4500液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀美國AB公司；Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)德國Millipore公司；PGC753e型電子天平 艾德姆衡器（武漢）有限公司；Multi Reax型全自動(dòng)振蕩器Heidolph公司；X3R型高速冷凍離心機(jī) Thermo公司；Genius NM32LA型氮?dú)獍l(fā)生器 PEAK公司；ATR Autovap S60型多樣品自動(dòng)濃縮儀 力德生物科技（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別精密稱取15種激素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg（精確至0.1 mg），各置于50 mL容量瓶，加適量的甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，配制成濃度為200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各5.00 mL，置同一個(gè)100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10.0 μg/mL）。

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密量取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用空白基質(zhì)提取液稀釋，制得到系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品處理 提?。悍Q取樣品2.5 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入2 mL 0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液，渦旋震蕩提取1 min，使樣品被打散，再加入8 mL乙腈，渦旋震蕩提取5 min，使樣品與提取溶劑充分混合后，超聲提取5 min，?2 ℃冷凍離心10000 r/min 10 min，取上清液4 mL待凈化。

凈化：將4 mL上清液轉(zhuǎn)移至Captiva EMR小柱中，在重力作用下自然洗脫流出，再用1 mL 80%乙腈水沖洗柱子，保持3~5秒每滴流出，同時(shí)收集全部流出液與洗脫液，于45 ℃氮吹至近干，用30%乙腈水溶液定容至1 mL，放入超聲波清洗機(jī)中超聲提取1 min，0.22 μm微孔濾膜過濾置于進(jìn)樣小瓶中，待測。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 正離子模式液相色譜條件 色譜柱：CAPCE LLPAK C18BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）。流動(dòng)相：A：甲醇，B：0.1%甲酸溶液，梯度洗脫條件見表1。柱溫：35 ℃，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。

表1 正離子梯度洗脫程序Table 1 Positive ion gradient elution program

1.2.3.2 正離子模式質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI+）；電噴霧電壓（IS）：4500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣（CUR）流速：30 L/min；霧化氣（GS1）流速：55 L/min；輔助加熱氣（GS2）流速：55 L/min。

1.2.3.3 負(fù)離子模式液相色譜條件 色譜柱：CAPCEL LPAK C18BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）。流動(dòng)相：A：乙腈，B：0.01%氨水溶液，梯度洗脫條件見表2。柱溫：35 ℃，流速：0.4 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。

表2 負(fù)離子梯度洗脫程序Table 2 Negative ion gradient elution program

1.2.3.4 負(fù)離子模式質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI?）；電噴霧電壓（IS）：?4500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣（CUR）流速：35 L/min；霧化氣（GS1）流速：50 L/min；輔助加熱氣（GS2）流速：50 L/min。

15種激素的定性離子、定量離子與碰撞能量見表3。

表3 15種性激素定性、定量離子和質(zhì)譜信息Table 3 15 kinds of qualitative and quantitative ion of sex hormone and mass spectrum information

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用MultiQuant3.0.2分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行定量定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜離子源參數(shù)的選擇

本研究測定目標(biāo)化合物較多，極性相差大，在質(zhì)譜中的響應(yīng)差別也較大，要對化合物進(jìn)行離子源參數(shù)優(yōu)化，將流動(dòng)相與標(biāo)準(zhǔn)溶液注射泵鏈接，同時(shí)將流動(dòng)相與標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀中。發(fā)現(xiàn)雌激素在負(fù)離子掃描模式下響應(yīng)更高，而雄激素和孕激素在正離子掃描模式下響應(yīng)更高。因此在正、負(fù)模式分開掃描下，對質(zhì)譜的電噴霧電壓、離子源溫度、氣簾氣流速、碰撞能量等一系列參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到了化合物響應(yīng)值最大時(shí)離子源條件見1.2.3，得到最佳質(zhì)譜條件見表3。質(zhì)譜圖見圖1、圖2。

圖1 15組分正離子總流圖Fig.1 15 component positive ion total flow diagram

圖2 15組分負(fù)離子總流圖Fig.2 15 negative ion total flow diagram of components

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇 分別考察CAPCELL PAK C18 MGⅢ-H （3 μm，2.0 mm×100 mm） 、CORTECS?UPLC?HILIC （1.6 μm，2.1 mm×100 mm）、Agilent SB-Aq RRHD （1.8 μm，2.1 mm × 100 mm）、CAPCELLPAK C18 BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）等4 種不同型號色譜柱對相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液掃描分析，考察其保留時(shí)間和分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四根柱子中CAPCELLPAK C18BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）測定正離子項(xiàng)目組分保留時(shí)間明顯縮短，分離度更好，測定負(fù)離子項(xiàng)目組分的峰型更好，且可在高pH下使用，因此選用CAPCELLPAK C18BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）色譜柱進(jìn)行蝦肉樣品性激素的檢測。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇 在流動(dòng)相系統(tǒng)選擇中，考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.01%氨水（負(fù)離子）4組流動(dòng)相，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，正離子模式采用乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)分離度和響應(yīng)值最高，而負(fù)離子模式采用乙腈-0.01%氨水作為流動(dòng)相時(shí)分離度和響應(yīng)值較高。所以采用多反應(yīng)監(jiān)測模式分開對正、負(fù)離子進(jìn)行測定，梯度洗脫時(shí)，通過改變流動(dòng)相的比例，使15種性激素均獲得有效分離，且峰形良好，靈敏度高，利于分辨。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的設(shè)計(jì)

2.3.1 提取溶劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、80%乙腈、0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉-乙腈、0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉-2%甲酸乙腈4組溶劑的提取效果，如圖3所示，0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉-乙腈提取溶液的平均回收率為93.29%，高于乙腈提取溶液，且實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蝦肉在0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉-乙腈較易散開，從而提高了結(jié)果準(zhǔn)確性。因此選擇0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉-乙腈為提取溶液。

圖3 不同提取劑對15種性激素回收率的影響Fig.3 Effects of different extractants on recovery rates of 15 sex hormones

2.3.2 凈化條件的選擇 本研究選用Oasis PRiME HLB和Captiva EMR這兩種SPE固相萃取小柱進(jìn)行凈化效果的對比，通過對比各類化合物回收率來選擇最優(yōu)的凈化條件。PRiME HLB具有特殊設(shè)計(jì)的填料，蛋白和磷脂基質(zhì)干擾去除率可達(dá)90%以上，因此有效地保護(hù)了色譜柱的使用壽命，且樣品經(jīng)提取后可直接過柱，簡化了凈化過程。Captiva EMR作為一種新型的固相萃取柱，具有高選擇性的去除脂質(zhì)基質(zhì)，且不會(huì)造成分析物損失的特點(diǎn)，因此能最大程度減少目標(biāo)分析物的基質(zhì)干擾，具有高效的凈化效果。

由圖4可以看出，用EMR柱凈化的回收率比用HLB柱凈化的回收率高，且相對穩(wěn)定，所以選用EMR作為凈化柱進(jìn)行樣品凈化。

圖4 不同凈化柱對15種性激素回收率的影響Fig.4 Effects of different purification columns on recovery rates of 15 sex hormones

2.3.3 固相小柱上樣體積的選擇 實(shí)驗(yàn)還分別考察了樣品離心后的上清液吸取量2、2.5、3、4、5 mL上Captiva EMR過濾柱后回收率的對比，由圖5可以看出，上清液取4 mL時(shí)的回收率最高。所以選擇取上清液4 mL轉(zhuǎn)移至Captiva EMR過濾柱中按1.2.2凈化操作。

圖5 洗脫液體積對15種性激素回收率的影響Fig.5 Influence of eluent volume on recovery rates of 15 sex hormones

2.3.4 淋洗溶液的選擇 淋洗方式進(jìn)行了直接收集流出液不進(jìn)行洗脫、1 mL 80%乙腈水沖洗柱子、2 mL 80%乙腈水沖洗柱子三種方式的對比。

由圖6可以看出，洗脫方式為收集全部流出液后，再用80%乙腈水沖洗柱子比直接收集全部流出液的回收率高，其中1 mL比2 mL的洗脫液回收率數(shù)據(jù)接近，但1 mL洗脫液回收率較高，因此選用的洗脫液體積為1 mL。

圖6 淋洗方式對15種性激素回收率的影響Fig.6 Influence of rinsing methods on recovery rates of 15 sex hormones

2.3.5 定容液的選擇 因?yàn)槎ㄈ萑軇┛赡軙?huì)使檢測中出現(xiàn)溶劑效應(yīng)，產(chǎn)生溶劑峰、峰展寬、峰分叉，增加噪音響應(yīng)并降低化合物的靈敏度等現(xiàn)象，所以樣品經(jīng)過提取、凈化和氮吹濃縮后,定容溶劑的選擇尤為重要。本研究選擇用乙腈定容，考察了乙腈濃度為10%、20%、30%、40%、50%時(shí)回收率的影響。

由圖7可以看出，乙腈濃度為10%、20%、40%、50%時(shí)回收率較低，濃度為30%時(shí)回收率較高，數(shù)據(jù)較為平穩(wěn)，因此選用30%乙腈水為定容濃度。

圖7 定容液對15種性激素回收率的影響Fig.7 Effect of constant volume solvent on recovery of 15 sex hormones

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用UPLC-MS/MS分析樣品時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)是影響定量結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素?；|(zhì)效應(yīng)（ME）是指在樣品測定過程中，由于待測物以外其他物質(zhì)的存在或其他物理、化學(xué)因素直接或間接影響離子化效果，從而影響待測物響應(yīng)的現(xiàn)象?；|(zhì)效應(yīng)的計(jì)算公式：其中，Sm和Ss分別表示基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。負(fù)的結(jié)果表示基質(zhì)抑制效應(yīng)，正的結(jié)果表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。當(dāng)ME為?20%~20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；ME為?50%~?20%或20%~50%時(shí)為中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。表4為部分藥物的基質(zhì)效應(yīng)。

由表4可以看出，正離子模式下的化合物表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，負(fù)離子模式下的化合物表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng)。其中除丙酸睪酮、醋酸甲羥孕酮、苯丙酸諾龍表現(xiàn)為基質(zhì)增加效應(yīng)外，其余均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配的方法，消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表4 部分性激素的基質(zhì)效應(yīng)Table 4 Part of the matrix effect of sex hormones

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限 由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，存在基質(zhì)效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，可以消除基質(zhì)干擾。以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取2.5 g蝦肉樣品空白基質(zhì)，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.2方法處理樣品，制得質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、30、50 μg/kg的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比（S/N=3）對應(yīng)的空白樣品添加質(zhì)量濃度作為檢出限（limit of detection, LOD），10倍信噪比（S/N=10）為定量限（limit of quantitation，LOQ）。15種性激素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見表5。

表5 15種性激素的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)Table 5 Linear equation, linear range and correlation coefficient of 15 sex hormones

本實(shí)驗(yàn)在線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，線性良好，檢出限范圍0.0015~0.436 μg/kg， 定量限范圍是0.0051~1.453 μg/kg。

2.5.2 方法回收率和精密度 為評價(jià)分析方法的準(zhǔn)確性和可靠性,考察了蝦肉樣品的空白基質(zhì)在2、4、40 μg/kg加標(biāo)濃度下15種藥物的回收率，每個(gè)加標(biāo)濃度平行測試6次，外標(biāo)法定量，計(jì)算平均回收率與精密度。結(jié)果表明，15種藥物的平均加標(biāo)回收率為85.31%~119.84%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.11%~9.86%，見表6。

表6 15種性激素的平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 6 Average spiked recovery and relative standard deviation of 15 sex hormones

3 結(jié)論

本研究建立EMR固相萃取高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蝦肉中15種性激素的檢測方法。通過設(shè)計(jì)前處理方法的提取溶劑的選擇、凈化條件的選擇：對比了Oasis PRiME HLB和Captiva EMR的凈化效果、淋洗溶液的選擇、定容液的選擇、如何更好消除基質(zhì)效應(yīng)等。結(jié)果顯示，1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉-乙腈是最合適的提取試劑，Captiva EMR柱的凈化效果最佳，取4 mL上清液過柱后，1 mL 80%乙腈淋洗，30%乙腈定容的提取方法在1~50 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99，方法檢出限為0.0015~0.436 μg/kg，定量限為0.0051~1.453 μg/kg，平均回收率在85.31%~119.84%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.11%~9.86%（n=6）。本方法簡單快速，為食品檢測機(jī)構(gòu)檢測應(yīng)對大批量蝦肉中多組分性激素檢測提供了技術(shù)參考。