基于熒光及紫外光譜法對蝦青素與乳清蛋白相互作用的研究

趙英源 ，張勝夢，李一帆，梁 晉，賈慧慧，李紫薇，劉俊霞，李瑞芳,2

（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001；2.河南省小麥生物加工與營養(yǎng)功能重點實驗室，河南鄭州 450001）

蝦青素是一種酮式類胡蘿卜素[1]，廣泛存在于蝦、蟹、魚、藻類、酵母等生物中。蝦青素分子式為C40H52O4，其分子結(jié)構(gòu)為共軛多烯不飽和鏈，常見蝦青素為紫紅色粉末。Lu等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素單體分子在水合溶劑中可以發(fā)生分子聚集，產(chǎn)生頭與頭面對面平行堆積卡包（Card-packed）構(gòu)型的H聚集體（如圖1A）和頭與尾錯位平行堆積頭包尾（Head-totail）構(gòu)型的J聚集體（如圖1B）。LP）等[11]。乳清蛋白在提高免疫力[12]、抗氧化[13]、抗癌[14]、緩解疲勞[15]等方面有多種應(yīng)用。并且乳清蛋白可以與多種小分子或生物大分子發(fā)生作用，具有配體結(jié)合性和可以結(jié)合多種金屬離子的功能特性。乳清蛋白的組成和結(jié)構(gòu)決定了它可作為載體運用，這些功能主要是由α-乳白蛋白、β-乳球蛋白以及牛血清蛋白所提供，所以研究選用了這三種蛋白以及濃縮乳清蛋白（Whey Protein Concentrate，WPC）進行研究。江萍[16]利用乳清蛋白包埋姜黃素形成載藥納米粒，提高了姜黃素在小腸上皮的吸收效率；Shafaei等[17]闡明β-乳球蛋白作為高效多樣載體蛋白的潛力，以及其形成靶向性良好的納米載體體系的能力；賈前生等[18]運用乳鐵蛋白對姜黃素進行包載，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的乳鐵蛋白姜黃素納米載藥遞送系統(tǒng)能夠有效提升姜黃素的生物可利用率。本研究依據(jù)乳清蛋白良好的載體特性，擬構(gòu)建蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物解決蝦青素水分散性差問題，并通過紫外光譜法和熒光光譜法分析蝦青素聚集體與乳清蛋白（α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、濃縮乳清蛋白、牛血清蛋白）的相互作用，探究蝦青素聚集體與乳清蛋白的結(jié)合機制，以期提高蝦青素及其聚集體的水分散性和生物利用度，并為乳清蛋白作為載體特性的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

圖1 蝦青素聚集體示意圖[2]Fig.1 Schematic diagram of astaxanthin aggregates[2]

1 材料與方法

蝦青素抗氧化性極強，并且具有抗腫瘤[3]、防癌癥[4]、抗炎癥[5]、光保護[6]、視力保護[7]、中樞神經(jīng)的保護[8]及預(yù)防心血管疾病[9]等多種對人類有益的生理功能。這些生理功能使其在醫(yī)藥、食品等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。但是蝦青素水分散性較差，并且在光、熱、氧氣等條件下容易發(fā)生分解不穩(wěn)定，導(dǎo)致其生物利用度較低，使蝦青素的應(yīng)用受到限制[10]。乳清蛋白主要生物活性成分包括α-乳白蛋白（α-lactalbumin Solution，α-La）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、免疫球蛋白（Immunoglobulins，Ig）、乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）、乳過氧化物酶（Lactoperoxidase，

1.1 材料與儀器

蝦青素 純度99%，分子量596.84 kDa，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；α-乳白蛋白 純度85%，分子量14.2 kDa，上海源葉生物科技有限公司；β-乳球蛋白（純度90%，分子量18.3 kDa）、牛血清蛋白（純度97%，分子量66.430 kDa） 北京索萊寶科技有限公司；濃縮乳清蛋白粉 蛋白含量80%，美國Glanbia營養(yǎng)有限公司；無水乙醇等 國藥化學(xué)試劑有限公司。

FA1004精密電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；AMM-6T多點磁力攪拌器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；Nano-S90馬爾文粒度儀、Nano-Z Zeta電位儀 英國馬爾文儀器有限公司；UPT-II-10T優(yōu)普系列超純水器 四川優(yōu)普超純科技有限公司；DHG-9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MJ-78A高壓滅菌鍋 施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RF-6000熒光分光光度計 日本株式會社島津制作所；UV-3100紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1.1 蝦青素溶液的制備 參考Lu等[2]的方法，略有修改，配制蝦青素母液。準(zhǔn)確稱取0.00250 g蝦青素置于100 mL燒瓶中，加入100 mL無水乙醇溶解蝦青素，在室溫避光的條件下200 r/min磁力攪拌1 h，配制濃度為0.0250 mg/mL的蝦青素溶液，使用時現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.1.2 乳清蛋白的制備 參考江萍[16]的方法，略有修改，配制乳清蛋白母液。

α-乳白蛋白溶液（α-La）的制備：稱取10 mgα-乳白蛋白白色固體粉末，加入到10 mL無菌水中，制備濃度為1 mg/mL的α-乳白蛋白溶液為母液，4 ℃冷藏。取1 mLα-La母液，加入到39 mL無菌水中得到0.025 mg/mLα-La溶液；取1 mLα-La母液加入到31.5 mL無菌水中得到溶液0.03 mg/mLα-La溶液。

β-乳球蛋白（β-Lg）溶液的制備：稱取10 mgβ-乳球蛋白白色固體粉末，加入到10 mL無菌水中，制備濃度為1 mg/mL的β-乳球蛋白溶液為母液，4 ℃冷藏。取1 mLβ-Lg母液，加入到39 mL無菌水中得到0.025 mg/mLβ-Lg溶液；取1 mLβ-Lg母液加入到31.5 mL無菌水中得到0.03 mg/mLβ-Lg溶液。

濃縮乳清蛋白（Whey Protein Concentrate，WPC）溶液的制備：稱取10 mg濃縮乳清蛋白白色固體粉末，加入到10 mL無菌水中，制備濃度為1 mg/mL的濃縮乳清蛋白溶液為母液，4 ℃冷藏。取1 mL 濃縮乳清蛋白母液，加入到39 mL無菌水中得到0.025 mg/mL WPC溶液；取1 mL濃縮乳清蛋白母液加入到31.5 mL無菌水中得到0.03 mg/mL WPC溶液。

牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）溶液的制備：稱取10 mg牛血清蛋白粉末，加入到10 mL無菌水中，制備濃度為1 mg/mL的牛血清蛋白溶液為母液，4 ℃冷藏。取1 mL BSA母液，加入到39 mL無菌水中得到0.025 mg/mL BSA溶液；取1 mL BSA母液加入到31.5 mL無菌水中得到0.03 mg/mL BSA溶液。

以侵權(quán)責(zé)任的承擔(dān)來懲罰未經(jīng)許可演繹人的侵權(quán)行為，以著作權(quán)的賦予來獎勵未經(jīng)許可演繹人的創(chuàng)作行為。這既是對法律規(guī)范的嚴(yán)格遵循，也是對演繹人智力創(chuàng)造勞動的鼓勵，符合知識產(chǎn)權(quán)法立法精神。著作權(quán)行使方式的特點，在保護了未經(jīng)許可演繹人利益的同時，兼顧了原作品著作權(quán)人的利益。

1.2.1.3 H型/J型聚集體蝦青素與乳清蛋白納米復(fù)合物的可控制備 本實驗分別對α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳清蛋白粉、牛血清蛋白包載的蝦青素進行相關(guān)探究。運用分子層層自組裝法進行制備[19]。以下八種納米復(fù)合物溶液所用四種蛋白終濃度均為0.02 mg/mL，所用蝦青素（AST）終濃度均為0.005 mg/mL。

H型/J型蝦青素/α-乳白蛋白納米復(fù)合物（H/J Aggregates Astaxanthin/α-La Nanocomplexes，H/JALaNs）的制備如下。H-ALaNs：吸取2 mL 0.025 mg/mL AST溶液，逐漸滴加到8 mL 0.025 mg/mLα-La溶液，200 r/min避光磁力攪拌10 min；J-ALaNs的制備：吸取10 mL 0.025 mg/mL AST溶液，向其中加入7.5 mL無水乙醇，磁力攪拌10 min后吸取3.5 mL逐滴加入到6.5 mL 0.03 mg/mLα-La溶液中，200 r/min避光磁力攪拌10 min。

H型/J型 蝦 青 素/β-乳 球 蛋 白 納 米 復(fù) 合 物（H/J Aggregates Astaxanthin/β-Lg Nanocomplexes，H/J-ALgNs）的制備：H-ALgNs的制備如下。吸取2 mL 0.025 mg/mL AST溶液，逐漸滴加到8 mL 0.025 mg/mLβ-Lg溶液，200 r/min避光磁力攪拌10 min；J-ALgNs的制備：吸取10 mL 0.025 mg/mL AST溶液，向其中加入7.5 mL無水乙醇，磁力攪拌10 min后吸取3.5 mL逐滴加入到6.5 mL 0.03 mg/mLβ-Lg液中，200 r/min避光磁力攪拌10 min。

H型/J型蝦青素/濃縮乳清蛋白納米復(fù)合物（H/J Aggregates Astaxanthin/Whey protein concentrate Nanocomplexes，H/J-AWNs）的制備如下。H-AWNs的制備：吸取2 mL 0.025 mg/mL AST溶液，逐漸滴加到8 mL 0.025 mg/mL WPC溶液，200 r/min避光磁力攪拌10 min；J-AWNs的制備：吸取10 mL 0.025 mg/mL AST溶液，向其中加入7.5 mL無水乙醇，磁力攪拌10 min后吸取3.5 mL逐滴加入到6.5 mL 0.03 mg/mL WPC溶液中，200 r/min避光磁力攪拌10 min。

H型/J型蝦青素/牛血清蛋白納米復(fù)合物（H/J Aggregates Astaxanthin/Bovine Serum Albumin Nanocomplexes，H/J-ABNs）的制備如下。H-ABNs的制備：吸取2 mL 0.025 mg/mL AST溶液，逐漸滴加到8 mL 0.025 mg/mL BSA溶液，200 r/min避光磁力攪拌10 min；J-ABNs的制備：吸取10 mL 0.025 mg/mL AST溶液，向其中加入7.5 mL無水乙醇，磁力攪拌10 min后吸取3.5 mL逐滴加入到6.5 mL 0.03 mg/mL BSA溶液中，200 r/min避光磁力攪拌10 min。

1.2.2 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的外觀分析 通過1.2.1的方法對蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物進行制備，將新鮮制備的蝦青素納米復(fù)合物懸液裝入適合的玻璃樣品瓶中，密封、室溫25 ℃、避光條件下儲存，觀察其溶液狀態(tài)，對其進行外觀分析。

1.2.3 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的粒徑及電位測量 粒徑、多分散性指數(shù)（PDI）的測定[20]：打開馬爾文粒度儀預(yù)熱30 min。清洗比色皿，并用待測液潤洗兩次，取新鮮制備的納米復(fù)合物1 mL加入粒徑樣品皿中，放入卡槽中，測量角度為90o，測試溫度為25 ℃，平衡時間為120 s，循環(huán)次數(shù)為90次，分散介質(zhì)為水。每個樣品測量四次，取平均值，進行數(shù)據(jù)分析。

Zeta電位的測定：根據(jù)亨利方程（Henry）公式。蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的電位采用動態(tài)光散射的方法，測試時首先測得復(fù)合物的電泳速率UE，然后根據(jù)亨利方程（Henry）求得蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的電位，測試溫度為25 ℃，樣品平衡時間120 s。樣品比色皿為1 cm聚苯乙烯池，采用一對0.45 cm2鉑電極，間距為0.4 cm。每個樣品測量四次，取平均值，進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的透射電鏡觀察按照Preethi等[21]的方法略有調(diào)整。取一滴樣品滴于潔凈的石蠟板上，將銅網(wǎng)輕輕放在液滴表面使液滴浸入銅網(wǎng)格中。大約10 min后取下銅網(wǎng)，用濾紙將銅網(wǎng)表面液體擦干，沾有液體表面的銅網(wǎng)為正面朝上放置。將銅網(wǎng)正面與磷鎢酸液滴接觸染色10 min，取下銅網(wǎng)，室溫下干燥后，放入透射電子顯微鏡中觀察。

1.2.5 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的紫外吸收光譜測量 按照Qiao等[22]的方法略有調(diào)整，打開紫外可見分光光度計，預(yù)熱15 min，用待測溶液潤3次石英比色皿。參數(shù)設(shè)置掃描范圍為200~800 nm；間距為1.0 nm；精度為10。測定樣品的紫外光譜，用滅菌超純水做基線校準(zhǔn)。

1.2.6 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的熒光檢測 按照Liu等[23]的方法略有調(diào)整，將制備的蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物以及α-乳白蛋白溶液、β-乳球蛋白溶液、濃縮乳清蛋白溶液、牛血清蛋白溶液分別進行熒光光譜掃描。發(fā)射光譜掃描的參數(shù)設(shè)置如下，設(shè)置激發(fā)波長固定為280 nm，發(fā)射光譜范圍設(shè)置為290~450 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度固定在10 nm，掃描速度為6000 nm/min。在上述參數(shù)設(shè)置下得到其相應(yīng)的熒光光譜。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文運用Microsoft Excel 2020等軟件處理試驗數(shù)據(jù)，獲得蝦青素與乳清蛋白相互作用的紫外可見光吸收光譜、熒光光譜，并且由譜圖分析兩者相互作用機制。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的外觀分析

研究選用了α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg）、牛血清蛋白（BSA）三種單一蛋白及濃縮乳清蛋白（WPC），由1.2.1所示的分子自組裝方法，制備出H/J-ALaNs、H/J-ALgNs、H/J-AWNs、H/J-ABNs溶液。如圖2所示四種蛋白所構(gòu)建的納米復(fù)合物當(dāng)中，其中H型-蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物均為淺黃色均一透明溶液、無沉淀、無絮凝；J型-蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物均為粉紫均一透明溶液、無沉淀、無絮凝。四種復(fù)合物在顏色深淺上存在差異。Lu等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素單體分子以“面對面”平行的共軛鏈堆疊而成H聚集體，相對于蝦青素游離單體的最大吸收波長發(fā)生藍移，H聚集體顏色為黃色。以松散的蝦青素單體分子錯位平行堆疊組成的J聚集體，相對于蝦青素游離單體的最大吸收波長發(fā)生紅移，顯現(xiàn)粉紫色[24]。根據(jù)實驗室前期的研究[25]可知，蝦青素H聚集體和J聚集體可被包裹在DNA-殼聚糖構(gòu)建的疏水微區(qū)中，使形成的納米懸液呈現(xiàn)出相應(yīng)的顏色。參考李敬等[26]的研究，推測蝦青素以H聚集體或J聚集體嵌入蛋白的疏水微區(qū)中，后期可以通過紫外光譜或熒光光譜等方法進行進一步的分析。

圖2 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物樣品圖Fig.2 Sample diagram of astaxanthin/whey protein nanocomplex

2.2 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的粒徑及電位

利用動態(tài)光散射儀測量蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的粒徑及電位，得到結(jié)果如表1。

表1 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的粒徑及電位Table 1 Particle size and potential of astaxanthin/whey protein nanocomplex

表1 為乳清蛋白與蝦青素制備的納米復(fù)合物所對應(yīng)的粒徑、多分散性指數(shù)（PDI）、電位。因蛋白空間結(jié)構(gòu)不同，其中α-乳白蛋白相較于其他三種蛋白與J聚集體蝦青素所形成的納米復(fù)合物的粒徑相較較小，β-乳球蛋白相較于其他三種蛋白與H聚集體蝦青素形成的納米復(fù)合物的粒徑小，導(dǎo)致不同蛋白與蝦青素相互作用程度不同，多分散指數(shù)有所差異。由表1可知H聚集體的粒徑普遍小于J聚集體，且前者的PDI和電位大于后者，猜測是因為H聚集體蝦青素與J聚集體蝦青素的結(jié)構(gòu)不同所造成的。Zhao等[27]分析了首尾相連結(jié)構(gòu)的J-AST和層層堆疊結(jié)構(gòu)的H-AST。其中首尾相連的結(jié)構(gòu)相對于層層堆疊，形成的復(fù)合物的粒徑較大。體系粒徑減少會導(dǎo)致乳液中分散粒子的相互作用增大，從而提高乳液的穩(wěn)定性[24]。乳液的穩(wěn)定是由液滴間的靜電排斥維持的，因此體系電位值可側(cè)面反映體系穩(wěn)定性[26]。由表1可知四種蛋白與蝦青素形成復(fù)合物的電位也有較為明顯的差異，其中H型/J型蝦青素/α-乳白蛋白納米復(fù)合物有較高電位，一定程度上表明其穩(wěn)定性較高。由表1數(shù)據(jù)可知，蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物粒徑均在150~430 nm之間，PDI分散性良好，電位在?12~?1 mV之間。參考劉俊麗等[28]的研究，說明實驗成功制備出蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物。

2.3 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的透射電鏡觀察

由前期實驗探究發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白、濃縮乳清蛋白不能形成穩(wěn)定的納米粒，α-乳白蛋白市價較貴，所以選用牛血清蛋白進行接下來的實驗。采用1.2.1.3中的方法成功制備H-ABNs和J-ABNs納米復(fù)合物，通過TEM觀察制備的樣品的樣貌，其結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出H/J-ABNs溶液近似為球形，這與Wu等[29]制備的納米復(fù)合物形狀相似。如圖3，形成的納米復(fù)合物中間為黑色的，結(jié)合緊密的實心球狀物，球狀物外部呈灰色且結(jié)合較為疏松，推測是牛血清白蛋白形成了核-殼結(jié)構(gòu)排列在外部，中間黑色球狀物為蝦青素，被包裹在牛血清蛋白的核-殼納米結(jié)構(gòu)中。由圖3中對比可以看出J-ABNs溶液的納米粒徑要大于H-ABNs溶液的納米粒徑，通過2.2中對于H/J-ABNs溶液的粒徑的測量可知，H-ABNs溶液的水合粒徑為251 nm，J-ABNs溶液的水合粒徑為357 nm，J-ABNs溶液的水合粒徑大于H-ABNs溶液的水合粒徑。DLS測得的水合粒徑大于透射電鏡所測得的納米粒徑，這可能是由于電鏡測量時需要脫水造成的[30]。該透射電鏡圖表明，蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物（H/J-ABNs）的納米粒子分布均勻，蝦青素被包裹在乳清蛋白形成的核-殼納米結(jié)構(gòu)中，說明蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物（H/J-ABNs）成功制備。

圖3 H/J-ABNs復(fù)合物透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy of H/ J-ABNs complex

2.4 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的紫外可見光譜分析

對蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物進行紫外光譜掃描，在300~800 nm得到光譜如圖4。

由圖4可知H型-蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物普遍在388 nm左右存在一個吸收峰，因H聚集體不穩(wěn)定，向J聚集體進行轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致A、C、D的H聚集體在480 nm處存在另外一個吸收峰，而J-ALaNs在519和556 nm左右有兩處顯示并肩峰。乳清蛋白中的酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）在300~800 nm沒有吸收峰[31]，而本研究中蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的吸收峰明顯，這一變化與Zhao等[32]研究的H型/J型蝦青素/DNA/殼聚糖納米復(fù)合物的紫外可見吸收光譜基本相似，這是蝦青素所造成的。蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物中蝦青素H聚集體光譜由單體480 nm藍移至388 nm，蝦青素J聚集體光譜紅移，并顯示出519和556 nm左右的并肩峰，表明蝦青素對乳清蛋白產(chǎn)生了影響，兩者結(jié)合形成了納米復(fù)合物。

圖4 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的紫外光譜Fig.4 Ultraviolet spectrogram of astaxanthin/whey protein nanocomplex

2.5 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的熒光光譜分析

在270~300 nm激發(fā)光下可發(fā)出內(nèi)源熒光的蛋白質(zhì)分別為酪氨酸、色氨酸、苯丙酸這三種氨基酸的殘基，其中色氨酸的熒光強度最大[33]。三種發(fā)光基團的熒光峰特征見表2。氨基酸殘基的熒光發(fā)射波長與其所處的微環(huán)境有關(guān)，環(huán)境極性增加則發(fā)生峰紅移，疏水性增加則發(fā)生峰藍移[34]。對α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、濃縮乳清蛋白、牛血清蛋白形成的蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物以及α-乳白蛋白溶液、β-乳球蛋白溶液、濃縮乳清蛋白溶液、牛血清蛋白溶液分別進行熒光掃描，得到的熒光強度如圖5所示。

表2 三種發(fā)光基團的熒光峰特征Table 2 Fluorescence peak characteristics of three luminescent clusters

由圖5看出，四種蛋白形成蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物后的熒光強度與對應(yīng)的蛋白相比均增強。蝦青素作為一種含共軛雙鍵的短鏈多烯類生物分子，和其他類胡蘿卜素分子一樣有寬帶熒光[35]。蝦青素有兩個β-紫羅蘭酮環(huán)和11個共軛雙鍵，這種結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物熒光強度的增加。同時蝦青素本身可發(fā)生分子自聚集形成具有內(nèi)源熒光的蝦青素H聚集體和蝦青素J聚集體，使蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的熒光強度增強。這與魯瑞梅等[36]發(fā)現(xiàn)共軛聚合物會使熒光增強的實驗結(jié)果一致，并且與通過改變溫度和加入聚合乳清蛋白導(dǎo)致的蛋白質(zhì)熒光強度增加[33]結(jié)果相似。

α-乳白蛋白形成的兩種納米復(fù)合物H/J-ALaNs的最大發(fā)射波長發(fā)生紅移，表明形成的納米復(fù)合物使色氨酸等殘基的光強猝滅，且所處的微環(huán)境極性更強[37]。蝦青素與α-乳白蛋白結(jié)合后形成的納米復(fù)合物與張明等[38]發(fā)現(xiàn)的乳白蛋白結(jié)合油酸或亞油酸后的熒光光譜的變化相似，乳白蛋白中的色氨酸所處微環(huán)境的極性增強。同時β-乳球蛋白形成的兩種納米復(fù)合物，J-ALgNs的最大發(fā)射波長相對于β-Lg發(fā)生紅移；H-ALgNs相對于β-Lg發(fā)生藍移。其中JALgNs的紅移說明β-Lg疏水性下降，結(jié)合位點的氨基酸殘基部分可能暴露在溶劑中，H-ALgNs發(fā)生較少藍移，推測是蝦青素H聚集體的特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致β-Lg疏水性增強。由圖5可知，濃縮乳清蛋白的最大發(fā)射波長為335 nm。H/J-AWNs納米復(fù)合物的最大發(fā)射峰仍在335 nm左右，與濃縮乳清蛋白的最大發(fā)射峰為335 nm相比，幾乎未發(fā)生移動。參考Burstezin等[39]的研究，色氨酸殘基的最大發(fā)射峰在335 nm，部分色氨酸殘基處于蛋白質(zhì)內(nèi)部非極性區(qū)域，另一部分可能處于蛋白質(zhì)表面區(qū)域，并與水溶液的相互接觸受到限制或整體處于水溶液中。由圖5得牛血清蛋白的熒光峰位于342 nm處，符合表2中色氨酸發(fā)射波長范圍，可以確定牛血清蛋白中的主要發(fā)光基團為色氨酸殘基。且牛血清蛋白與蝦青素H/J聚集體形成納米復(fù)合物后峰值出現(xiàn)藍移，溶液疏水性增加[40]。根據(jù)發(fā)射波長的移動判斷，蝦青素與牛血清蛋白結(jié)合，導(dǎo)致色氨酸所處微環(huán)境發(fā)生改變。

圖5 蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of the whey protein/astaxanthin nanocomplex

3 結(jié)論

本文選用乳清蛋白與蝦青素構(gòu)建納米復(fù)合物，并實現(xiàn)乳清蛋白對蝦青素H聚集體和J聚集體的可控載運。本實驗主要采用紫外可見分光光譜法和熒光光譜法對乳清蛋白與蝦青素聚集體的相互作用機制進行探究。研究表明蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物的水合粒徑均在150~430 nm范圍內(nèi)，且J-ABNs納米復(fù)合物的粒徑要大于H-ABNs納米復(fù)合物的粒徑。在蝦青素/乳清蛋白納米復(fù)合物中，蝦青素H聚集體紫外可見吸收波長λmax由蝦青素單體480藍移至388 nm，蝦青素J聚集體紫外可見光譜發(fā)生紅移，并顯示出519和556 nm左右的并肩峰。蝦青素聚集體與乳清蛋白的相互作用能改變芳香族氨基酸殘基在空間結(jié)構(gòu)中所處的微環(huán)境的極性變化，引起乳清蛋白的構(gòu)象變化。本研究為提高蝦青素及其聚集體的水分散性和拓展乳清蛋白載體特性的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。