上海某水庫(kù)水源水中微生物多樣性表征初探

朱宜平， 安 東

(1. 上海城投原水有限公司，上海 200125； 2. 復(fù)旦大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程系，上海 200433)

微生物指標(biāo)可以量化微生物種群屬性之間差異，微生物群落狀況與水質(zhì)狀況有著密切的聯(lián)系，當(dāng)水環(huán)境改變時(shí)，微生物種類(lèi)和多樣性也隨之改變.生物多樣性、優(yōu)勢(shì)種群和群落結(jié)構(gòu)等變化可以反映水質(zhì)受損的程度，與污染物濃度和毒性作用等評(píng)價(jià)相結(jié)合，可以預(yù)測(cè)無(wú)法監(jiān)測(cè)到的水質(zhì)問(wèn)題.由于微生物指標(biāo)在水質(zhì)評(píng)估中有積極作用，研究水源水的微生物種群以及有機(jī)物的影響是十分必要的[1-3].研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)物不僅影響微生物活性，而且在微生物降解過(guò)程中還可能轉(zhuǎn)化為潛在的有毒副產(chǎn)物[4].López-Glvez等[5]研究了農(nóng)產(chǎn)品洗滌水中低氧嗜中性細(xì)菌與高游離氯濃度的關(guān)系，表明洗滌水中高游離氯(FC)和氧化還原電位(ORP)的升高與洗滌產(chǎn)品中微生物負(fù)荷的降低有關(guān).此外，許多研究探討了水源水中微污染物對(duì)微生物群落[6]及對(duì)廢水和飲用水分配系統(tǒng)中微生物的聚集能力和生物膜生長(zhǎng)的影響[7].Wang等[8]研究了飲用水分配系統(tǒng)中的微生物對(duì)抗生素磺胺嘧啶和環(huán)丙沙星的反應(yīng)，在磺胺嘧啶和環(huán)丙沙星的作用下，水中生絲微菌屬(Hyphomicrobium)中16S rRNA的增加與給水管網(wǎng)中抗生素耐藥基因的上升有關(guān).Tong等[9]探究了氧氟沙星對(duì)人工濕地中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，在種植系統(tǒng)中，氧氟沙星增加了節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和腸球菌(Enterococcus)的相對(duì)豐度，這些微生物已被證明可產(chǎn)生耐藥性.

本研究選取上海市某水源水庫(kù)進(jìn)水(UO)和出水(WDE)為研究對(duì)象，通過(guò)微生物多樣性表征方法，初步研究了該水庫(kù)進(jìn)出水中微生物之間的差異和相似之處，為進(jìn)一步研究同類(lèi)型水源水庫(kù)微生物多樣性特征及其與水質(zhì)的關(guān)系提供數(shù)據(jù)支持.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)水樣采集

采集上海市某水庫(kù)的進(jìn)水和出水樣品，采集水樣量為4 L.取1～3 L左右水樣，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，以濾膜上有可見(jiàn)覆蓋物為準(zhǔn)，后置于凍存管中，液氮速凍，置于-80 ℃冰箱冷藏待測(cè).

1.2 微生物測(cè)定方法

1.2.1 DNA的抽提與質(zhì)檢

采用環(huán)境樣本DNA提取試劑盒(OMEGA Bio-tek，美國(guó))完成基因組DNA抽提，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA完整性，Qubit Picogreen熒光定量系統(tǒng)定量DNA濃度.

1.2.2 目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增及產(chǎn)物純化

采用低循環(huán)數(shù)擴(kuò)增，使用TaKaRa EX Taq高保真DNA聚合酶，利用Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)后使用AxyPrep Mag PCR Clean-Up Kit(Axygen公司)磁珠回收純化，檢驗(yàn)合格后定量建庫(kù).

1.2.3 熒光定量

純化后的PCR產(chǎn)物采用Qubit Picogreen熒光定量系統(tǒng)定量濃度，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合，備用于測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建.運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)，基于Illumina HiSeq 2500平臺(tái)對(duì)宏基因組進(jìn)行測(cè)序分析.

基于Miseq測(cè)序平臺(tái)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接及質(zhì)控過(guò)濾，獲得優(yōu)化序列；區(qū)分樣本后進(jìn)行操作分類(lèi)單元(Operational Taxonomic Units， OTU)聚類(lèi)，得到樣品與OTU豐度矩陣；選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為OTU的代表序列，與物種分類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋?zhuān)@得樣品與物種豐度的矩陣.基于上述兩個(gè)矩陣的信息，開(kāi)展多樣性指數(shù)分析，并在各個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì).包括Alpha多樣性分析[10]、Beta多樣性分析[11]、物種組成分析等.

2 結(jié)果與討論

2.1 Alpha多樣性分析

對(duì)目標(biāo)水樣進(jìn)行了Alpha多樣性指數(shù)分析，單個(gè)樣品的物種多樣性結(jié)果如表1所示.物種豐富度指數(shù)(Richness、Chao、ACE)[12]和多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)是反映微生物群落變化的綜合量.此外Good’s Coverage(覆蓋度指數(shù))驗(yàn)證了痕量測(cè)序量合理性，即被檢測(cè)到的物種的比例.

表1 不同樣品Alpha多樣性指數(shù)Tab.1 Alpha diversity index for different water samples

通過(guò)高通量測(cè)序分析了6個(gè)樣品的微生物群落多樣性和系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu).稀釋曲線(xiàn)(圖1(a))說(shuō)明該樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，同時(shí)也可以比較不同樣本的物種豐富度.在該測(cè)序條件下，每個(gè)樣品可測(cè)的物種數(shù)在400～500左右，見(jiàn)表1.將序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，用所抽到的序列數(shù)表示的OTU的數(shù)量用于構(gòu)建稀釋性曲線(xiàn).如圖1(a)所示，樣本的稀釋性曲線(xiàn)趨于平緩，表明測(cè)序數(shù)據(jù)趨于飽和，測(cè)序深度足以反映樣本中的所有OTU信息.物種累積曲線(xiàn)用于判斷樣本量是否充分以及物種豐富度的估計(jì)，如圖1(d)所示，在一定范圍內(nèi)，隨著樣本量的加大，曲線(xiàn)趨于平緩，表明抽樣充分，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.Rank abundance(相對(duì)豐度)曲線(xiàn)反映物種豐度和物種均勻度，如圖1(c)所示.對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理繪制出的稀釋曲線(xiàn)、相對(duì)豐度曲線(xiàn)和物種累積曲線(xiàn)表明樣品中物種的豐富度和多樣性可以滿(mǎn)足進(jìn)一步研究要求.此外，所有樣本的覆蓋度指數(shù)(Good’s Coverage)平均為99.7%±1.5%，說(shuō)明測(cè)序深度足以進(jìn)行群落分析.結(jié)果表明：不同取樣點(diǎn)的物種總數(shù)有所差異，進(jìn)水口所檢測(cè)到的OTU總數(shù)分別為433、421和431，而出水口OTU總數(shù)分別為423、409和417.

圖1 樣本稀釋曲線(xiàn)、Shannon曲線(xiàn)、相對(duì)豐度曲線(xiàn)和物種累積曲線(xiàn)Fig.1 Curves of sample rarefaction, Shannon, rank abundance and species accumulation

結(jié)果表明，進(jìn)出口的物種豐富度較高，出水口物種豐富度較低.Chao指數(shù)和ACE指數(shù)是估計(jì)群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，表示物種的豐富度，值越大代表物種總數(shù)越多.由表1可知，ACE指數(shù)的變化范圍為432.6～457.2，Chao指數(shù)的變化范圍為439.5～464.2，最小值為出水口WDE2，該樣本點(diǎn)出現(xiàn)的種類(lèi)數(shù)為409種，也為各采樣點(diǎn)最小，最大值樣本點(diǎn)為進(jìn)水口UO1，種類(lèi)數(shù)為433.Shannon和Simpson多樣性指數(shù)綜合考慮了物種的豐富度和分布均勻度，Shannon和Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越高.進(jìn)水口Shannon多樣性指數(shù)的變化范圍是4.43～4.73，Simpson指數(shù)的變化范圍是0.96～0.98，出水口Shannon多樣性指數(shù)的變化范圍是4.20～4.42，Simpson指數(shù)的變化范圍是0.96～0.97.結(jié)果表明各樣品間的OTU數(shù)目分布差異不大，進(jìn)出水的種類(lèi)和數(shù)目有差異，進(jìn)水口物種多樣性均大于出水口且多樣性的均勻度(Evenness)也稍高于出水口樣品.

2.2 物種組成分析

為了表征水源水樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)，使用樸素貝葉斯分類(lèi)器(Ribosomal Database Project，RDP)進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析.物種豐度比例圖分別根據(jù)物種分類(lèi)單元的界、門(mén)、綱、目、科、屬、種層次對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算相對(duì)比例并作圖.各樣本門(mén)級(jí)、屬級(jí)物種組成如圖2和圖3(見(jiàn)第808頁(yè))所示.結(jié)果表明，在門(mén)水平上的優(yōu)勢(shì)微生物組成種類(lèi)基本相似，變形桿菌(Proteobacteria)、放線(xiàn)菌(Actinobacteria)、藍(lán)藻/葉綠體(Cyanobacteria/Chloroplast)、擬桿菌(Bacteroidetes)等豐度較高.其中進(jìn)水口的Proteobacteria豐度最高為40.6%，與進(jìn)水口相比，出水口具有較低豐度(25.1%)；出水口Actinobacteria的豐度占比高達(dá)了50.7%.從分類(lèi)結(jié)果來(lái)看，Actinobacteria在出水樣品中占主導(dǎo)地位，進(jìn)水口僅為38.6%.

圖2 樣品的優(yōu)勢(shì)門(mén)相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of source water samples on the dominant phylum level

圖3 樣品的優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of source water samples on the dominant genus level

進(jìn)出水樣品在屬水平上的優(yōu)勢(shì)微生物組成種類(lèi)相似，Ilumatobacter、Gplla、Actinobacteria、洋桿菌(Pelagibacter)等豐度較高.其中Ilumatobacter在各樣品上的豐度最高，進(jìn)水口為20.2%，出水口為27.8%，其次是Actinobacteria，進(jìn)水口和出水口分別為13.2%和22.9%.進(jìn)水口Proteobacteria的豐度最高，Proteobacteria可與水中的蛋白質(zhì)發(fā)生氨化反應(yīng)，由于進(jìn)水口受人類(lèi)活動(dòng)影響較大，生活污水和工業(yè)污水排入河流中，導(dǎo)致河流中蛋白類(lèi)有機(jī)物的增加，使得水庫(kù)進(jìn)水口含有較多蛋白類(lèi)有機(jī)物.進(jìn)出水中的優(yōu)勢(shì)微生物有差異，這可能是因?yàn)樗畮?kù)出水口受人類(lèi)活動(dòng)影響較小，使Proteobacteria豐度低于進(jìn)水口.與進(jìn)水口相比，出水口的Actinobacteria豐度占比較高，在出水樣品中占主導(dǎo)地位，Actinobacteria具有降解纖維素及各種有機(jī)物質(zhì)(包括芳香族化合物)的能力，表明出水樣品中含有的芳香族化合物高于進(jìn)水口.

進(jìn)一步通過(guò)熱圖分析該區(qū)段屬水平的進(jìn)出水樣品中高豐度微生物，結(jié)果如圖4所示.結(jié)果表明：Ilumatobacter、Actinobacteria、Pelagibacter在進(jìn)出水樣品中都顯示出了較高的豐度，微生物群落結(jié)構(gòu)略有差異，出水口樣品的微生物豐度高于進(jìn)水口樣品.此外，通過(guò)維恩圖(圖5)可以看出進(jìn)出水樣本中共有的核心物種有429種，進(jìn)水樣本中獨(dú)有的OTU有41中，而出水樣本中則有30種.

圖4 樣品中屬水平微生物群落的熱圖分析Fig.4 Heatmap analysis for microbial commanities in source water samples on the dominant genus level

圖5 進(jìn)出水中微生物種數(shù)維恩圖Fig.5 Venn picture of microbial species number in source water samples

2.3 Beta多樣性分析

為了進(jìn)一步研究水源水中不同樣本中最主要的元素和結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了主成分分析PCA(Principal Component Analysis)和主坐標(biāo)分析PCoA(Principal Co-ordinates Analysis)，觀察6個(gè)樣品的微生物群落整體變化情況，結(jié)果如圖6所示.通常，兩個(gè)樣本點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離越近，它們的組成就越相似，圖中PC1、PC2通過(guò)降維處理后，所有OTU通過(guò)線(xiàn)性組合而成的對(duì)方差解釋度最大的新變量.結(jié)果表明： 出水組3個(gè)點(diǎn)微生物組成相似，而進(jìn)水組3個(gè)點(diǎn)的微生物群落略有不同.整體上看，進(jìn)水組的微生物組成與其他出水有顯著差異，說(shuō)明PC1是導(dǎo)致進(jìn)出水差異的主要因素，同時(shí)驗(yàn)證了這個(gè)因素有較高的可能性影響了樣品的組成，說(shuō)明微生物多樣性在水庫(kù)內(nèi)發(fā)生了種群變化.

圖6 樣品主成分和主坐標(biāo)分析Fig.6 Principal component and principal co-ordinates analysis of source water samples

3 結(jié) 論

水源水中進(jìn)出水口的微生物群落及種類(lèi)有明顯差別，進(jìn)水口中微生物多樣性均大于出水，多樣性的均勻度也高于出水樣品的均勻度.在門(mén)水平上的優(yōu)勢(shì)微生物組成種類(lèi)上，進(jìn)水的Proteobacteria豐度最高，Proteobacteria易與水中蛋白質(zhì)發(fā)生氨化反應(yīng)，可以表明水庫(kù)水進(jìn)出水中含有較為豐富的蛋白類(lèi)有機(jī)物，而受人類(lèi)活動(dòng)影響較小的出水口中Actinobacteria占主導(dǎo)地位，表明出水中含有的芳香族化合物可能高于進(jìn)水口.微生物多樣性的表征尚不能完全反應(yīng)水源水質(zhì)特征，但可以從微生物的角度分析水源水質(zhì)的成分變化等，對(duì)于豐富水源水質(zhì)研究和保護(hù)水源生態(tài)健康具有一定的意義.