組蛋白去乙?；讣捌湟种苿┰诠侨饬龇肿訖C制中的作用研究進展

徐紅 孫紅 楊坤 向陽

骨肉瘤 ( osteosarcoma，OS ) 起源于間葉細胞，是一種最常見于 10～30 歲青少年的原發(fā)惡性骨腫瘤，多見于長骨干骺端，具有侵襲性強且易轉(zhuǎn)移等特點[1-4]。目前主要的治療包括手術(shù)結(jié)合新輔助化療，但是存在耐藥、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等問題[5-6]。已發(fā)生肺部等遠處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者幾乎不可治愈，5 年總體生存率不到 30%[7]，因此骨肉瘤的早期診斷對于患者的預(yù)后至關(guān)重要。然而目前骨肉瘤的早期診斷卻相對局限，臨床常用的有影像學(xué)檢查和血清生化等方法，遺憾的是其特異性和敏感度普遍不高[8]。迄今為止，驅(qū)動骨肉瘤細胞增殖和生長的關(guān)鍵機制仍未研究透徹。幸運的是，越來越多的研究表明，組蛋白去乙酰化酶( histone deacetylases，HDAC ) 影響多種細胞過程，并通過多種機制促進骨肉瘤的生長和發(fā)展[9]，挖掘其在骨肉瘤發(fā)生及進展中的作用機理，對于骨肉瘤的早期診斷、治療及預(yù)后分析等均帶來新的希望。組蛋白去乙?；敢种苿? histone deacetylase inhibitors，HDACi ) 通過作用于組蛋白乙?；?( histone acetyltransferases，HAT ) 和 HDAC，調(diào)控細胞核內(nèi)乙?；c去乙酰化過程，從而抑制腫瘤細胞周期、誘發(fā) DNA 損傷、誘導(dǎo)腫瘤細胞分化及腫瘤細胞死亡，發(fā)揮抗腫瘤作用，逐漸成為腫瘤治療的新方向[9-11]?，F(xiàn)對 HDAC 及 HDACi 在骨肉瘤中的表達及其分子機制作用的研究進展進行綜述。

一、HDAC 生物學(xué)功能概述

1. HDAC：HDAC 主要存在于真核生物中，是去除賴氨酸殘基上乙?；囊活惖鞍酌浮，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)證實的包括 18 種同工型的 HDAC，按照結(jié)構(gòu)差異將其分為四類。Ⅰ 類 HDAC 成員主要由 HDAC1、2、3 和 8 構(gòu)成，主要位于細胞核中，并在所有組織中普遍表達。Ⅱ 類 HDAC不但分布于細胞核中，而且細胞質(zhì)中也有表達。分為 Ⅱa類，包括 HDAC4、5、7、9 和由 HDAC6 和 10 構(gòu)成的 Ⅱb類。Ⅲ 類 HDAC 是沉默調(diào)節(jié)蛋白 ( Sirtuins ) 同源物，主要由 Sirtuins 1～7 組成[12]，Ⅳ 類 HDAC 目前已探及的僅為 HDAC11[13]。其中 Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ 類屬于稱為“金典家族”Zn+ 依賴性酶，Ⅲ 類屬于依賴煙酰胺的腺嘌呤二核苷酸 ( NAD+) 酶[14]。

2. HDAC 的作用及功能：HDAC 通過作用于組蛋白、抑癌因子 P53 等細胞因子，直接或間接地參與多種重要的細胞通路，從而影響腫瘤細胞增殖、分化、遷移和凋亡[15]。其在人類腫瘤中普遍存在 HDAC 的異常表達，其可作為腫瘤組織區(qū)別于正常組織的分子標志物[16]。主要臨床應(yīng)用有：( 1 ) 腫瘤早期診斷[15]；( 2 ) 腫瘤遷移預(yù)測[15]；( 3 ) 腫瘤預(yù)后分析[17-20]；( 4 ) 腫瘤的臨床治療[15]。

二、HDACi 生物學(xué)功能概述

1. HADCi 概述：HDACi 是一類表觀遺傳學(xué)藥物，通過作用于 HDAC 調(diào)節(jié)基因表達，而無須改變基因序列[10,21]?；谄湓隗w外和體內(nèi)抑制腫瘤生長的能力，HDACi 在近 10 年中已成為潛在的腫瘤治療選擇[22]。自20 世紀 90 年代至今，人們通過研究已發(fā)現(xiàn)了多種結(jié)構(gòu)不同的 HDACi，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的特異性，主要分為以下幾類：( 1 ) 異羥肟酸類，代表藥物有伏立諾他 ( SAHA )、制滴菌素 A ( TSA ) 等；( 2 ) 短鏈脂肪酸類，如丁酸鈉、異戊酸等；( 3 ) 親電子酮類，目前發(fā)現(xiàn)的僅為三氟甲基酮；( 4 ) 環(huán)四肽類；( 5 ) 苯甲酰胺類；( 6 ) 其它類化合物。

2. HDACi 功能：靶向抑制 HDAC 已被證實具有抗腫瘤的效應(yīng)[23]，HDACi 通過抑制 HDAC 的活性而增強組蛋白乙?；源龠M轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 鏈結(jié)合，從而啟動抑癌基因等特異性基因的表達，基于以上特點，HDACi 主要作用有：( 1 ) 誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡 ( 影響細胞凋亡、自噬以及壞死的程序性死亡 )[24-25]；( 2 ) 增加腫瘤細胞對其它抗瘤藥的敏感性[26]；( 3 ) 影響活性氧水平[27-28]；( 4 ) 抗血管新生效應(yīng)[22,29]；( 5 ) 影響細胞因子信號[30]。

三、HDAC 與骨肉瘤

1. HDAC 促進骨肉瘤細胞增殖的分子機制：組蛋白乙?；腿ヒ阴；且粋€可以逆轉(zhuǎn)的過程，該過程接受 HAT和 HDAC 調(diào)節(jié)。通過乙?；饔?，去除組蛋白上的正電荷，降低組蛋白 N 末端與 DNA 磷酸基團的相互作用，從而將染色質(zhì)轉(zhuǎn)化為更松弛的狀態(tài)。在這種狀態(tài)下，DNA 更易于訪問，這將導(dǎo)致更多的轉(zhuǎn)錄因子能夠到達 DNA[31]。研究表明組蛋白的乙?；瘯黾踊虻谋磉_，從而導(dǎo)致基因在涉及增殖，遷移，血管生成和分化的多種途徑中表達[11,32]。而組蛋白去乙?；?DNA 更緊密地包裹在組蛋白核心周圍，使得轉(zhuǎn)錄因子不易于與 DNA 相結(jié)合，從而使基因的表達水平降低。研究發(fā)現(xiàn)：在包括骨肉瘤的許多癌癥中已觀察到 HDAC 的表達失調(diào)可促進癌細胞增殖。隨著研究的不斷深入，HDAC 在骨肉瘤進展中的重要作用也將逐步被揭示。

2013 年，國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn) β-catenin 可作為癌基因和 HDAC6 的底物，在骨肉瘤中，rho 相關(guān)的卷曲螺旋激酶通過防止 TPPP1 介導(dǎo)的 HDAC6 活性抑制作用調(diào)節(jié)β-catenin 的穩(wěn)定性，從而通過 CK1 和 GSK3β 的磷酸化來減少其乙?；徒到猓M一步促進骨肉瘤的進展[33]。隨后國外一項研究表明，HDAC6 / STAT3 通路下調(diào)了程序性死亡受體配體 1 ( PD-L1 ) 的表達，從而使 T 細胞中的抑制性調(diào)節(jié)途徑 PD-1 降低，進一步促進腫瘤的進展[34]。最近國內(nèi)學(xué)者在體外試驗中又發(fā)現(xiàn) HDAC5 通過上調(diào) Twist 1 的表達促進骨肉瘤細胞系中的細胞增殖[35]。

此后，Deng 等[36]通過臨床病例發(fā)現(xiàn)：MG63 細胞中的核 HDAC 活性和 Ⅰ 類 HDAC 表達明顯高于 hFOB 1.19細胞，達到 3.6 倍，與配對的相鄰正常組織相比，在人骨肉瘤組織中觀察到了相似的趨勢；但是，HAT 活性未見明顯差異，從而使 HAT / HDAC 活性比率降低 69%，這些將影響骨肉瘤發(fā)病機理中乙?；臓顟B(tài)，從而影響骨肉瘤細胞的活力。

以上研究均揭示 HDAC 可通過不同分子機制促進骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展，筆者期望通過尋找某種方式阻斷不同的細胞通路來抑制骨肉瘤細胞的增殖與發(fā)展，以期在腫瘤的早期進行干預(yù)。

2. HDAC 促進骨肉瘤細胞遷移的分子機制：隨著近年來新輔助化療的有序開展，骨肉瘤患者 5 年生存率提高到70% 左右[37]，然而遺憾的是，對于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者，5 年生存率僅為 30%[38]，因此迫切的需要掌握骨肉瘤轉(zhuǎn)移機制。

沉默調(diào)節(jié)蛋白 1 ( sirtuin 1，SIRT1 ) 是一類 NAD+依賴的 Ⅲ 型 HDAC，一項研究分析了 22 例骨肉瘤患者的生存率和轉(zhuǎn)移率與 SIRT1 的關(guān)系。結(jié)果得出表達高水平SIRT1 的患者的病死率沒有增加，表明 SIRT1 的表達水平或許與生存率無關(guān)，而 SIRT1 表達水平升高可能與骨肉瘤患者的高轉(zhuǎn)移風(fēng)險有關(guān)。進一步的體外實驗證實，SIRT1 的過表達增加了 KHOS / NP，HOS 和 U2-OS 細胞系的遷移能力[39-40]。同時也有學(xué)者在橫紋肌肉瘤、平滑肌瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤中觀察到了強烈的 Sirtuin 1 表達[41]。國外一項研究表明，Sirtuin 1 的過度表達與較高的臨床分期，較高的組織學(xué)等級，增加的有絲分裂計數(shù)和較高的遠處轉(zhuǎn)移潛力密切相關(guān)，從多變量分析來看，SIRT1的過表達是與骨肉瘤顯著相關(guān)的獨立預(yù)后指標，Sirtuin 1的過表達是骨肉瘤患者轉(zhuǎn)移潛能和無病生存的獨立預(yù)后指標[42]。

通過檢測人體骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中 HDAC4 和增殖細胞核抗原 ( PCNA ) 的 mRNA 及蛋白質(zhì)的水平，結(jié)果顯示人骨肉瘤患者臨床標本中 HDAC4 和 PCNA 的表達量均明顯高于骨軟骨瘤患者臨床標本；同時在體外實驗中，上調(diào)人骨肉瘤細胞株 MG-63 和 U2-OS 中 HDAC4，過表達 HDAC4 后，PCNA 的蛋白水平明顯升高，而 PCNA的 mRNA 水平無明顯變化；另一方面，在過表達 HDAC4后，骨肉瘤細胞的增殖和侵襲明顯增強，而細胞凋亡明顯減少[43]；以上研究得出，HDAC4 可以使 PCNA 蛋白的表達增加，從而促進骨肉瘤細胞的增殖和侵襲，并抑制其凋亡，為骨肉瘤的治療找到潛在靶點。

3. HDAC 與骨肉瘤預(yù)后分析：一項檢驗 HDAC 在 89例高級骨肉瘤組織中的表達情況的研究表明，HDAC1、HDAC2 和 HDAC3 的三種所有 HDAC 同工型，均主要在骨肉瘤細胞核中表達，原發(fā)性骨肉瘤細胞表達較高水平的HDAC1 和 HDAC2，但與良性成骨細胞相比，HDAC3 水平較低。進一步研究表明，HDAC1 的表達水平在 Enneking晚期和初始轉(zhuǎn)移表型顯著降低。成人 ( > 15 歲 ) 中 HDAC3的表達明顯低于兒童 ( ≤ 15 歲 ) 中的表達。單因素生存分析表明，低水平的 HDAC1 核表達是高級別骨肉瘤的顯著陰性預(yù)測因子。低 HDAC1 表達的患者 5 年生存率高于HDAC1 表達較高的患者?？傮w來說，HDAC1 的低表達與不良結(jié)局如轉(zhuǎn)移和晚期有關(guān)[44]。隨著 HDAC 在骨肉瘤細胞遷移中的作用機制的研究進一步深入，對于骨肉瘤的預(yù)后分析起到一定的作用。相信隨著這方面研究進一步深入，對于骨肉瘤早期轉(zhuǎn)移的控制會逐漸增強，進一步提高骨肉瘤患者的治愈率。

四、HDACi 與骨肉瘤

骨肉瘤細胞的程序性死亡在骨肉瘤發(fā)生、進展及臨床治療中均可發(fā)揮重要作用。研究表明，HDACi 可以顯著影響骨肉瘤細胞的凋亡、壞死和自噬等關(guān)鍵的程序性死亡途徑。

1. HDACi 誘導(dǎo)骨肉瘤細胞凋亡的機制：凋亡是介導(dǎo)骨肉瘤細胞死亡的主要途徑，且與化療藥物耐藥率的高低存在一定聯(lián)系[45]。研究表明，HDACi 在骨肉瘤細胞的凋亡途徑中可起到誘導(dǎo)作用。在骨肉瘤中，Bcl-2 / Bax 被認為是最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)凋亡通路之一[46]，Bax 與 Bcl-21 兩者都屬于 Bcl-2 家族蛋白，分別屬于最主要的凋亡蛋白及抗凋亡蛋白[47]。國內(nèi)學(xué)者證實 SAHA 聯(lián)合順鉑可通過協(xié)同靶向Bcl-2 / Bax 促進骨肉瘤的增殖抑制，誘導(dǎo)其凋亡[48]。一項體外實驗發(fā)現(xiàn)，TSA 通過 p53 信號通路激活以劑量依賴的方式顯著抑制 MG63 細胞的生長并促進凋亡[36]。而進一步研究表明[49]，HDACi 能夠通過 p53 的信號傳導(dǎo)途徑或內(nèi)在線粒體途徑誘導(dǎo)的骨肉瘤細胞的凋亡，這種有效的凋亡活性與 HDACi 通過 AKT ( 蛋白激酶 B，也稱為 PKB ) 下調(diào)生存信號的更大能力有關(guān)[50]。

2. HDACi 誘導(dǎo)骨肉瘤細胞自噬：近年來研究發(fā)現(xiàn)，HDACi 在細胞自噬調(diào)控過程中也能發(fā)揮作用，但其具體作用機制還需進一步深入，是目前研究的熱點之一。

一項研究表明，曲古抑素 A ( TSA ) 處理可抑制雷帕霉素 ( mTOR ) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的哺乳動物靶點，并增強叉頭盒 O1 ( FOXO1 ) 的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致自噬水平提高，而通過 siRNA 敲除抑制 FOXO1 功能則可顯著降低 TSA 誘導(dǎo)自噬。而通過自噬抑制劑或 ATG 基因敲低抑制自噬，可顯著增強 TSA 引起的細胞死亡，揭示了自噬在 HDACi 引起的骨肉瘤細胞死亡中的功能是一種細胞存活機制，HDACi能夠阻斷 AKT-mTOR 信號傳導(dǎo)并抑制癌細胞存活率和遷移，因此通過結(jié)合 HDACi 和自噬抑制劑成為骨肉瘤治療中的一個新的方向[51]。

3. HDACi 誘導(dǎo)骨肉瘤細胞壞死：壞死也是細胞程序性死亡的一種方式。然而只有在 Caspase 抑制劑抑制凋亡途徑時，活化的死亡受體才會將細胞壞死途徑激活，從而介導(dǎo)細胞死亡。一項研究表明，HDACi 可能通過誘導(dǎo)骨肉瘤細胞上的 NKG2D 配體 MICA / B 上調(diào)以及增加自然殺傷細胞上 NKG2D 受體的表達來增強癌細胞對自然殺傷細胞的識別[52]，通過這一途徑，促進骨肉瘤細胞壞死。

4. HDACi 在骨肉瘤中的其它作用機制：HDACi 增強了骨肉瘤和 RMS 細胞系的輻射作用，暴露于 HDACi 后，DNA 修復(fù)的抑制以及凋亡誘導(dǎo)的增加可能是 HDACi 引起放射增敏的機制[53]。Ⅰ 類 HDAC 抑制劑 MS-275 可增強骨肉瘤細胞對活性氧 ( ROS ) 的脆弱性，通過增強 YB-1 乙?；饔?，抑制了關(guān)鍵細胞保護因子的 YB-1 轉(zhuǎn)化控制及其促轉(zhuǎn)移活性，從而限制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移[54]。AR-42 與阿霉素的組合可有效抑制細胞活力并產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用[49]。SAHA 和順鉑的組合通過調(diào)節(jié)細胞周期抑制骨肉瘤細胞增殖，使得細胞遷移速率顯著降低[48]。Blattmann 等[55]通過皮下注射 KHOS-24OS 細胞建立骨肉瘤異種移植物，并用媒介物 ( DMSO )，SAHA，HIT ( 重離子放射療法 ) 或 HIT和 SAHA 進行處理，確定腫瘤生長并評估腫瘤壞死，增殖率，凋亡率以及血管密度，證實 HIT 和 SAHA 的組合通過增加凋亡率，增加 p53 和 p21 Waf1 / Cip1 的表達，抑制增殖和血管生成，誘導(dǎo)了腫瘤生長的顯著延遲。國內(nèi)學(xué)者阿吉木·克勒木等通過體內(nèi)和體外實驗研究得出，HDAC6通過激活 STAT3 通路下調(diào)了骨肉瘤細胞表達的重要共刺激分子程序死亡受體配體-1 ( PD-L1 ) 的表達，激活了 T 細胞的抑制性調(diào)節(jié)通路 PD-1，從而抑制體內(nèi)腫瘤的進展，這為骨肉瘤的免疫治療提供了新的思路[34]。

五、總結(jié)與展望

總的來說，HDAC 在骨肉瘤中發(fā)生及進展中意義重大，愈來愈多的研究表明其在骨肉瘤中的表達水平較正常組織中高，通過研究不同類型的 HDAC 在骨肉瘤中的表達情況，可以盡早在骨肉瘤早期預(yù)測抑或是檢測出骨肉瘤，以便于早診斷、早治療，這對于骨肉瘤患者來說意義重大。HDACi 在骨肉瘤中有跨越細胞途徑的廣泛生物學(xué)效應(yīng)，包括骨肉瘤中的凋亡、壞死、自噬、細胞分化和 ROS生成，這些機制表明，HDACi 可能是骨肉瘤患者有前途的治療劑之一，并為 HDACi 在骨肉瘤中的臨床應(yīng)用中奠定了基礎(chǔ)。此外，研究表明，HDACi 不但使骨肉瘤對放療和化療敏感，而且還在骨肉瘤中聯(lián)合化療藥物或其它靶向藥物時可以提高治療效果，這極大地改善了放化療不敏感類型骨肉瘤患者的治療窘境。雖然 HDACi 在骨肉瘤的治療中表現(xiàn)顯著，但是問題也同樣存在，例如 HDACi 精準性不夠高，無法調(diào)節(jié)細胞信號中的細微差別，這也帶來了無法精準識別的問題，從而在腫瘤不同亞型中效果不盡相同，甚至起到反作用的可能。相信通過國內(nèi)外學(xué)者的不斷研究，HDACs 在骨肉瘤中表達機制會進一步揭露，為骨肉瘤的早期診斷與預(yù)后療效預(yù)測提供更多的便利。同時，HDACi 的不斷推廣，通過聯(lián)合化療藥物或其它靶向藥物，將會為骨肉瘤患者帶來更多的福音。