血清miR-199a-5p、miR-378a-3p水平與嬰幼兒增殖期面部血管瘤普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)的關(guān)系

郭彥，張凱，范戌輝，李立峰

1.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院口腔急診科，陜西 西安（710001）；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院整形外科，陜西西安（710032）；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔頜面外科，河北 石家莊（050000）；4.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院創(chuàng)傷整形外科，陜西 西安（710001）

血管瘤是來(lái)源于血管內(nèi)皮細(xì)胞的良性腫瘤，好發(fā)于嬰幼兒，增殖期血管瘤瘤體生長(zhǎng)迅速易發(fā)生潰瘍，發(fā)生于面部的血管瘤嚴(yán)重影響美觀(guān)，增大瘤體可壓迫周?chē)鞴賹?dǎo)致視力、聽(tīng)力障礙或鼻軟骨擴(kuò)張，影響器官功能［1］。普萘洛爾是治療增殖期血管瘤的一線(xiàn)用藥，起效快，療效顯著，安全性高［2］。普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)是影響血管瘤療效、困擾臨床醫(yī)師的一大問(wèn)題，臨床研究顯示普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)率達(dá)25%，其中頭頸部血管瘤復(fù)發(fā)幾率較其它部位明顯增加［3］。普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者存在顯著的微小RNA（micro RNA，miRNAs）表達(dá)差異［4］。miR-199a-5p可通過(guò)靶向低氧誘導(dǎo)因子1a抑制血管瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］，miR-378a-3p是惡性腫瘤潛在標(biāo)志物，體外研究顯示上調(diào)miR-378a-3p表達(dá)可抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及侵襲［6］。miR-199a-5p、miR-378a-3p與嬰幼兒增殖期面部血管瘤普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)是否有關(guān)尚不清楚，鑒于此，本研究擬檢測(cè)增殖期面部血管瘤患兒血清miR-199a-5p、miR-378a-3p表達(dá)，分析其與血管瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

本研究已經(jīng)獲得西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：2017pz06315），選取2017年1月至2020年1月西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院門(mén)診收治的增殖期面部血管瘤患兒93例。男性24例，女性69例，年齡21 d～9個(gè)月，平均（5.23±1.16）個(gè)月；瘤體大小4～9 cm2，平均（6.82±2.09）cm2；血管瘤分型：?jiǎn)伟l(fā)型11例，多發(fā)型22例，節(jié)段型49例，中間型11例；血管瘤分類(lèi)：淺表性21例，深在性52例，混合性20例。所有患兒家屬均知情同意簽署同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2016版《血管瘤和脈管畸形診斷和治療指南》中診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；②年齡＜9個(gè)月；③接受普萘洛爾治療，耐受性良好。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①患兒生長(zhǎng)緩慢、先天性心臟病、支氣管痙攣、顱內(nèi)動(dòng)脈異常等；②血管內(nèi)皮瘤、肌纖維瘤、橫紋肌肉瘤；③喂養(yǎng)不良、呼吸困難、睡眠紊亂；④服藥依從性差，隨訪(fǎng)失聯(lián)。

1.2 主要儀器和試劑

TRIzol試 劑（批 號(hào)170305、181006、190116、000209，Invitrogen生命技術(shù)公司，美國(guó)）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（型號(hào)Multiskan SkyHigh，賽默飛公司，美國(guó)）；miRNeasy試劑盒（批號(hào)17DC12、18PK06、19AA03、00GB02，Qiagen公司，德國(guó)）；Prime Script RT試劑盒（批號(hào)SG1235、5K1342、PO41M2、L35184，Takara生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；qRT-PCR系統(tǒng)（型號(hào)CFX96，BIO-RAD公司，美國(guó)）。

1.3 血清miR-199a-5p、miR-378a-3p檢測(cè)方法

所有患兒治療前（普萘洛爾治療前）、后（普萘洛爾停藥后1周內(nèi)）采集靜脈血3 mL注入干燥試管，室溫下靜置30～60 min后取上層血清離心（3 000 rpm，半徑10 cm，時(shí)間10 min）后-20℃保存?zhèn)溆?。取?fù)融血清標(biāo)本20μL加入TRIzol試劑提取組織中總RNA，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀選取OD260：OD2801.8～2.0樣本，miRNeasy試劑盒提取miRNA，Prime Script RT試劑盒將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取2 μL cDNA樣品加入反應(yīng)體系，qRT-PCR系統(tǒng)進(jìn)行基因表達(dá)分析。引物由金斯瑞生物科技公司合成，引物序列：miR-199a-5p，上游：5′-CAATCGCTTTCAAATAG-3′，下游：5′-CAGGAGATGCTGTCATC-3′。miR-378a-3p，上游：5′-TCAACTGGTGTCGTGGAGT-3′，下游：5′-GGGACTGGACTTGGAGTC-3′。U6（內(nèi) 參）上 游：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下 游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應(yīng)體系包括Prime-Script RT Enzyme Mix 1.0μL，RTPrimer Mix 1.0μL，5×PrimeScript Buffer 2 4.0μL，RNase Free dH2O 4.0 μL，cDNA模板2μL，上下游引物各1μL，加水至20μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性10 s和60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)延伸時(shí)間遞增1 s，最后72℃延伸7 min，4℃保存。2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-199a-5p、miR-378a-3p相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 血管瘤治療

普 萘 洛 爾（批 號(hào)174219、180243、190242、000147，云鵬制藥有限公司，中國(guó)）初始劑量，1 mg/kg/d，分2次口服，維持治療3～7 d后增加劑量至1.5 mg/kg/d，繼續(xù)治療3～7 d后增加劑量至2.0 mg/kg/d［8］，治療期間出現(xiàn)低血糖、低血壓、睡眠障礙者可減少至初始劑量，患兒滿(mǎn)1歲或無(wú)明顯瘤灶或瘤體達(dá)到最大消退量并維持3個(gè)月可停藥［9］。淺表性血管瘤采用1%普萘洛爾軟膏（西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院自制）外涂于瘤體表面，3次/d，持續(xù)用藥至瘤體顏色完全消退。混合性血管瘤患者普萘洛爾口服聯(lián)合1%普萘洛爾軟膏外用，方法同上。

1.5 隨訪(fǎng)

停藥后隨訪(fǎng)6個(gè)月，其中23例（復(fù)發(fā)組）停藥后再次出現(xiàn)血管瘤病灶或血管瘤病灶體積較治療結(jié)束時(shí)明顯增大，顏色加深；70例（無(wú)復(fù)發(fā)組）停藥后病灶逐漸萎縮，原有病灶未增大或未出現(xiàn)新病灶。

1.6 血管瘤復(fù)發(fā)危險(xiǎn)因素收集

收集患兒性別、年齡、早產(chǎn)、瘤體大小、血管瘤分型、血管瘤分類(lèi)、停藥時(shí)年齡、停藥時(shí)服藥療程、治療后瘤體分級(jí)。根據(jù)Achauer等［10］提出的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)治療后瘤體分級(jí)，Ⅰ級(jí)：瘤體縮小＜25%或瘤體表面顏色略變淺；Ⅱ級(jí)：瘤體縮小26%～50%或瘤體表面顏色稍微變淺；Ⅲ級(jí)：瘤體縮小51%～75%且瘤體表面顏色明顯變淺；Ⅳ級(jí)：瘤體縮?。?5%或瘤體表面顏色消退。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.00進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，miR-199a-5p、miR-378a-3p等計(jì)量資料經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)（組內(nèi)）或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（組間）。性別、血管瘤分型、血管瘤分類(lèi)、治療后瘤體分級(jí)等計(jì)數(shù)資料以例（%）表示采用χ2檢驗(yàn)。Logistic回歸分析影響嬰幼兒增殖期面部血管瘤普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 嬰幼兒增殖期面部血管瘤復(fù)發(fā)組和無(wú)復(fù)發(fā)組基線(xiàn)資料

復(fù)發(fā)組停藥時(shí)年齡＜1歲、停藥時(shí)服藥療程＜6個(gè)月、治療后瘤體分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)患兒比例高于無(wú)復(fù)發(fā)組（P＜0.001）（表1）。

2.2 嬰幼兒增殖期面部血管瘤復(fù)發(fā)組和無(wú)復(fù)發(fā)組治療前后血清miR-199a-5p、miR-378a-3p的表達(dá)比較

復(fù)發(fā)組和無(wú)復(fù)發(fā)組治療前血清miR-199a-5p、miR-378a-3p表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。無(wú)復(fù)發(fā)組治療后血清miR-199a-5p、miR-378a-3p表達(dá)較治療前增高（P＜0.05），復(fù)發(fā)組治療后血清miR-199a-5p、miR-378a-3p表達(dá)與治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），復(fù)發(fā)組治療后血清miR-199a-5p、miR-378a-3p表達(dá)低于無(wú)復(fù)發(fā)組（P＜0.05）（表2）。

2.3 嬰幼兒增殖期面部血管瘤治療后不同瘤體分級(jí)患兒血清miR-199a-5p、miR-378a-3p表達(dá)比較

治療后瘤體分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)患兒血清miR-199a-5p、miR-378a-3p表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)（P＜0.05）（表3）。

2.4 嬰幼兒增殖期面部血管瘤普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)影響因素分析

以嬰幼兒增殖期面部血管瘤普萘洛爾停藥后是否復(fù)發(fā)為因變量（賦值：0＝否，1＝是），停藥時(shí)年齡（賦值：0＝≥1歲，1＝＜1歲）、停藥時(shí)服藥療程（賦值：0＝≥6個(gè)月，1＝＜6個(gè)月）、治療后瘤體分級(jí)（賦值：0＝Ⅲ～Ⅳ級(jí)，1＝Ⅰ～Ⅱ級(jí)）、miR-199a-5p（原值代入）、miR-378a-3p（原值代入）為自變量，逐步法排除無(wú)關(guān)變量，最終miR-199a-5p低表達(dá)、miR-378a-3p低表達(dá)、治療后瘤體分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)是嬰幼兒增殖期面部血管瘤普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）（表4）。

表1 嬰幼兒增殖期面部血管瘤復(fù)發(fā)組和無(wú)復(fù)發(fā)組基線(xiàn)資料Table 1 Baseline data of infants with proliferative facial hemangioma in the recurrence group and the nonrecurrence group±s,n（%）

表1 嬰幼兒增殖期面部血管瘤復(fù)發(fā)組和無(wú)復(fù)發(fā)組基線(xiàn)資料Table 1 Baseline data of infants with proliferative facial hemangioma in the recurrence group and the nonrecurrence group±s,n（%）

Item Age/year Gender Hemangioma size/cm2 Hemangioma typing P Male Female t/χ2 value 0.181 0.264 0.301 0.857 0.607 0.764 Single Multiple Segmental Middle Superficial Deep Mixed Recurrence group（n＝23）5.19±1.20 5（21.74）18（78.26）6.93±1.96 3（13.04）6（26.09）11（47.83）3（13.04）5（21.74）16（69.57）2（8.71）8（34.78）18（78.26）5（21.74）19（82.61）4（17.39）20（86.96）3（13.04）Nonrecurrence group（n＝70）5.24±1.13 19（27.14）51（72.86）6.78±2.11 8（11.42）16（22.86）38（54.29）8（11.43）16（22.86）36（51.43）18（25.71）19（27.14）20（28.57）50（71.43）22（31.43）48（68.57）17（24.29）53（75.71）0.290 0.962 Hemangioma classification 3.360 0.186 Preterm birth Age of withdrawal 0.490 17.689 0.484＜0.001 Period of treatment 18.396＜0.001 Hemangioma grading after treatment＜1 year≥1 year＜6 months≥6 monthsⅠ-ⅡgradeⅢ-Ⅳgrade 28.382＜0.001

表2 嬰幼兒增殖期面部血管瘤復(fù)發(fā)組和無(wú)復(fù)發(fā)組治療前后血清miR-199a-5p、miR-378a-3p的表達(dá)差異Table 2 Difference in the serum levels of miR-199a-5p and miR-378a-3p in infants with proliferative facial hemangioma of the recurrence group and the nonrecurrence group before and after treatment ±s

表2 嬰幼兒增殖期面部血管瘤復(fù)發(fā)組和無(wú)復(fù)發(fā)組治療前后血清miR-199a-5p、miR-378a-3p的表達(dá)差異Table 2 Difference in the serum levels of miR-199a-5p and miR-378a-3p in infants with proliferative facial hemangioma of the recurrence group and the nonrecurrence group before and after treatment ±s

Group Recurrence group n 23 Nonrecurrence group 70 Comparison within the recurrence group at different time points Comparison within the nonrecurrence group at different time points Comparison between groups before treatment Comparison between groups after treatment Time Prior treatment Post treatment Prior treatment Post treatment t/P t/P t/P t/P miR-199a-5p（2-ΔΔCt）1.24±0.31 1.29±0.33 1.25±0.30 2.83±0.62 0.640/0.524 11.746/＜0.001 0.138/0.891 11.366/＜0.001 miR-378a-3p（2-ΔΔCt）1.17±0.29 1.20±0.31 1.19±0.28 3.08±0.94 0.409/0.684 9.474/＜0.001 0.295/0.769 9.395/＜0.001

表3 嬰幼兒增殖期面部血管瘤治療后不同瘤體分級(jí)患兒血清miR-199a-5p、miR-378a-3p的表達(dá)差異Table 3 Differences in serum levels of miR-199a-5p and miR-378a-3p in infants with different proliferative facial hemangioma grades after treatment ±s

表3 嬰幼兒增殖期面部血管瘤治療后不同瘤體分級(jí)患兒血清miR-199a-5p、miR-378a-3p的表達(dá)差異Table 3 Differences in serum levels of miR-199a-5p and miR-378a-3p in infants with different proliferative facial hemangioma grades after treatment ±s

Hemangioma gradingⅠ-ⅡgradeⅢ-Ⅳgrade n 37 56 t P miR-199a-5p（2-ΔΔCt）1.67±0.30 2.96±0.47 14.806＜0.001 miR-378a-3p（2-ΔΔCt）1.71±0.25 3.21±0.60 14.383＜0.001

3 討論

普萘洛爾是非選擇性β-阻斷劑，可抑制一氧化氮釋放引起血管收縮，減少瘤體血供抑制瘤體生長(zhǎng)，還可通過(guò)上調(diào)miR-125b的表達(dá)抑制血管瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］。但是普萘洛爾停藥后存在復(fù)發(fā)現(xiàn)象，尤其是面部血管瘤，較其它血管瘤復(fù)發(fā)更早、更頻繁［12］。miRNAs具有調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)、血管生成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用，與血管瘤進(jìn)展以及對(duì)普萘洛爾治療反應(yīng)性均存在密切關(guān)系［13-14］。

表4 嬰幼兒增殖期面部血管瘤普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)影響因素Logistic回歸方程Table 4 Logistic regression equation of affecting factors for recurrence in infants with proliferating facial hemangioma after propranolol withdrawal

miR-199a-5p是miR-199家族成員，在惡性腫瘤中可損害癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，發(fā)揮抑癌基因作用，是多種惡性腫瘤的潛在生物標(biāo)志物［15］。miR-199a-5p在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，可促使一氧化氮產(chǎn)生并提高一氧化氮生物利用度，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、新生血管形成以及維持血管穩(wěn)態(tài)［16］。miR-199a-5p還參與血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶/一氧化氮通路調(diào)節(jié)血管收縮和舒張，并通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)調(diào)節(jié)新生血管形成［17］。Wang等［5］研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p在血管瘤中表達(dá)降低，miR-199a-5p與增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-199a-5p可抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖。miR-199a-5p與嬰幼兒面部血管瘤普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)是否存在關(guān)系尚不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)面部血管瘤普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)患兒血清miR-199a-5p表達(dá)低于無(wú)復(fù)發(fā)患兒，治療后瘤體分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)患兒血清miR-199a-5p表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)，說(shuō)明miR-199a-5p表達(dá)與血管瘤普萘洛爾治療后瘤體縮小程度以及復(fù)發(fā)均有關(guān)。進(jìn)一步回歸分析結(jié)果顯示治療后miR-199a-5p低表達(dá)是普萘洛爾停藥后血管瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，說(shuō)明miR-199a-5p表達(dá)缺失可能導(dǎo)致了增殖期面部血管瘤嬰幼兒普萘洛爾治療后復(fù)發(fā)。分析原因可能為miR-199a-5p通過(guò)下游靶基因Oxidored硝基含有結(jié)構(gòu)域的蛋白1（oxidored nitro domain containing protein 1，NOR1）抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)［18］，miR-199a-5p表達(dá)缺失則引起NOR1，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子上調(diào)，導(dǎo)致血管瘤細(xì)胞增殖和治療后復(fù)發(fā)。

miR-378a-3p屬于miR-378家族成員，源自過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1-β基因的第一個(gè)內(nèi)含子，參與代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成等多種生物學(xué)過(guò)程，與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，化療耐藥均有關(guān)［19］。通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)miR-378a-3p在血管瘤中表達(dá)下調(diào)，且與血管瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［20］。本研究無(wú)復(fù)發(fā)組治療后血清miR-378a-3p表達(dá)較治療前增高，復(fù)發(fā)組治療前后血清miR-378a-3p表達(dá)則無(wú)明顯變化，說(shuō)明miR-378a-3p表達(dá)與血管瘤患兒對(duì)普萘洛爾治療反應(yīng)有關(guān)。分析可能機(jī)制如下：首先，miR-378a-3p可通過(guò)靶向抑制融合蛋白抑制劑間接調(diào)節(jié)聲波刺猬蛋白信號(hào)通路的下游靶基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A，抑制腫瘤血管形成［21］；其次，miR-378a-3p還可靶向抗增殖蛋白-ErbB2轉(zhuǎn)錄因子2，抑制細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，促使細(xì)胞周期G1/S停滯，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增殖［22］。由此可見(jiàn)，miR-378a-3p表達(dá)缺失可促使血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及血管網(wǎng)絡(luò)形成，可能導(dǎo)致血管瘤進(jìn)展，引起普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)。本研究結(jié)果顯示治療后瘤體分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)血清miR-378a-3p表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)，說(shuō)明miR-378a-3p低表達(dá)與血管瘤普萘洛爾治療低反應(yīng)有關(guān)，回歸分析結(jié)果證實(shí)miR-378a-3p低表達(dá)是增殖期面部血管瘤嬰幼兒普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，驗(yàn)證miR-378a-3p與普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

綜上，增殖期面部血管瘤普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)患兒血清miR-199a-5p、miR-378a-3p表達(dá)均降低，miR-199a-5p、miR-378a-3p低表達(dá)與普萘洛爾停藥后血管瘤復(fù)發(fā)有關(guān)。miR-199a-5p、miR-378a-3p可作為增殖期面部血管瘤嬰幼兒普萘洛爾停藥后復(fù)發(fā)評(píng)估的潛在指標(biāo)。