甘氨酸引導(dǎo)羧甲基殼聚糖/無定形磷酸鈣再礦化脫礦牙釉質(zhì)表面的研究

郭宏磊，張凱，張旭

天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科，天津（300070）

早期齲壞主要表現(xiàn)為牙釉質(zhì)表層的脫礦白堊斑而無明顯齲洞形成，常見于正畸結(jié)束后的清潔不良托槽周圍、酸蝕牙釉質(zhì)表面以及易發(fā)生齲壞的窩溝處等［1］。其治療方法主要包括了傳統(tǒng)的充填治療和非破壞性的再礦化治療［2］。其中，再礦化治療方法可最大程度保留牙體硬組織，減少對牙體硬組織的破壞［3］。但是目前該種方法由于再礦化層較為不穩(wěn)定，無法在微觀上形成與天然牙釉質(zhì)相近的羥基磷灰石有序排列的釉柱結(jié)構(gòu)，因此導(dǎo)致了療效不穩(wěn)定，再礦化的效果在宏觀上與天然牙釉質(zhì)相差較大［4］。目前已有研究證實，殼聚糖類的衍生物，如磷酸化殼聚糖（phosphorylated chitosan，P-Chi）、羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC）均具有能夠穩(wěn)定鈣磷離子，從而形成無定形磷酸鈣（amorphous calcium phosphate，ACP）的功能［5］。此外，甘氨酸是一種簡單氨基酸，對于羥基磷灰石具有一定的晶體排列作用［6］。因此，本研究結(jié)合CMC對鈣、磷的穩(wěn)定作用，并使用甘氨酸引導(dǎo)無定形磷酸鈣，在脫礦牙釉質(zhì)樣本表面形成再礦化，探索牙釉質(zhì)再礦化的新型礦化材料的體外方法及效果。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

于天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科完整拔除的尚未完全萌出的阻生齒20顆，本實驗通過天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審查（審批號：TMUh-MEC20210216）?；颊呔獣圆⒑炇鹬橥猓笱荔w無缺損、無齲壞、無隱裂，釉質(zhì)表面完整、無缺損及脫礦；CMC（海得貝生物工程有限公司，中國）；磷酸氫二鉀K2HPO4、二水氯化鈣CaCl2·2H2O、甘氨酸、1%質(zhì)量分數(shù)NaClO沖洗液（致遠化學(xué)試劑有限公司，中國）；37%磷酸凝膠（3M齒科材料，美國）。

低速金剛鋸（蔚儀金相有限公司，中國）；齒科低速手機（NSK，日本）；磁力攪拌器（EMS-8C，博納科技有限公司）；透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）（jem-1230，JEOL，日本）；掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（FE-SEM-5600 lv，JEOL，日本）；納米壓痕儀（Agilent nanoindenter G200，安捷倫，美國）。

1.2 方法

1.2.1 再礦化液制備及TEM檢測形貌 375 mg CMC粉末緩慢加入100 mL雙蒸水，以800 rpm的速度攪拌，然后再加入69.6 mg K2HPO4。將117.6 mg CaCl2·2H2O溶解于25 mL雙蒸水中，將CaCl2溶液緩慢加入含有K2HPO4的CMC中。最終配得的CMC/ACP溶液中Ca離子和P離子的摩爾濃度是4 mmol/L和8 mmol/L。4℃冷藏備用。取1 mL質(zhì)量分數(shù)1%的NaClO溶液加入到20 mL CMC/ACP溶液，制得反應(yīng)態(tài)CMC/ACP［7］。

110 kV電壓下，TEM觀察甘氨酸引導(dǎo)經(jīng)NaClO處理的CMC/ACP溶液下的納米顆粒的形態(tài)特點：CMC/ACP溶液；加入質(zhì)量分數(shù)1%NaClO的CMC/ACP溶液；加入甘氨酸和質(zhì)量分數(shù)1%NaClO的CMC/ACP溶液。

1.2.2 牙釉質(zhì)脫礦樣本的制備和再礦化實驗 ①牙釉質(zhì)脫礦樣本的制備：20顆阻生齒，移除牙根，用金剛鋸自軸面分割為面積約為4 mm×4 mm×0.5 mm（長×寬×厚）的2片釉質(zhì)塊并隨機歸組至A、B兩組。超聲蕩洗10 min，然后用氣槍吹干，37%磷酸涂布于釉質(zhì)表面30 s后去除磷酸并吹干至釉質(zhì)呈白堊色，用以模擬釉質(zhì)齲脫礦表面。

②再礦化實驗：將1.2.1中配置的反應(yīng)態(tài)CMC/ACP涂抹于A組酸蝕后牙釉質(zhì)表面，涂布10 min，涂布完成后置于模擬唾液中，并放置在搖床上。如此反復(fù)共計7 d。

取10 mL 1.2.1中配置的反應(yīng)態(tài)CMC/ACP，加入30 mg甘氨酸固體粉末，攪拌后涂抹在B組牙釉質(zhì)表面，后過程同A組相同。

③掃描電子顯微鏡檢測再礦化前后牙表面形貌：從天然未經(jīng)處理牙釉質(zhì)、脫礦后牙釉質(zhì)以及再礦化后各組樣品中選取樣品進行掃描電鏡檢測。樣本檢測前均使用乙醇梯度脫水和樣品噴金處理［8］。

1.2.3 納米壓痕實驗檢測牙釉質(zhì)表面機械強度 所有樣品酸蝕處理前、酸蝕后以及7 d的再礦化完成后，均使用PBS緩沖液沖洗3次，使用納米壓痕測試儀（nanoindenter）以100 mN力恒定載荷15 s進行釉質(zhì)片表面壓刻深度、硬度和彈性模量測試，以判斷再礦化后牙釉質(zhì)機械強度的變化［9］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS15.0進行數(shù)據(jù)分析，酸蝕后、再礦化組以及天然牙釉質(zhì)表面彈性模量和硬度值的比較使用one-way ANOVA，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TEM檢測再礦化液形貌特征

如圖1所示，圖1a為CMC/ACP的透射電鏡影像，表現(xiàn)為相對比較均質(zhì)的納米顆粒，納米顆粒粒徑約為50～200 nm，邊緣較為粗糙。圖1b為反應(yīng)態(tài)CMC/ACP的透射電鏡影像，可見顆粒明顯光滑，顆粒粒徑較前明顯增加，約為100～300 nm。圖1c為反應(yīng)態(tài)CMC/ACP加入甘氨酸后的透射電鏡影像，顯示出顆粒開始呈現(xiàn)出線狀有序排列，顆粒粒徑400～600 nm。而圖1d則為反應(yīng)態(tài)CMC/ACP加入甘氨酸15 min時的表征，可見溶液內(nèi)形成了微晶體，晶體長度約為5～15μm。

Figure 1 TEM images of the morphological characteristics of the remineralized solution at different stages圖1 不同階段再礦化液形貌特征TEM圖片

2.2 牙釉質(zhì)表面再礦化SEM結(jié)果

如圖2a所示，天然牙牙釉質(zhì)表面經(jīng)37%磷酸酸蝕后呈現(xiàn)出典型酸蝕后的多孔魚鱗狀外觀。A組再礦化結(jié)果典型代表如圖2b所示，表現(xiàn)為顆粒狀的再礦化外觀，且再礦化結(jié)果為雜亂的非均質(zhì)再礦化層。B組再礦化形貌如圖2c、2d所示，在脫礦牙釉質(zhì)表面形成了較為均質(zhì)的晶體形貌，再礦化層晶體顆粒在釉質(zhì)表面形成致密有序排列的釉質(zhì)樣層。微觀上晶體形態(tài)與天然牙釉質(zhì)晶體形貌類似。

2.3 再礦化前后牙表面機械強度

相同壓刻力量作用下各組牙表面壓刻深度如圖3所示。當壓刻力量為100 mN時，天然牙釉質(zhì)壓刻深度為756 nm，天然牙釉質(zhì)經(jīng)37%磷酸酸蝕后牙表面壓刻深度為3 280 nm，A組再礦化牙體表面的壓刻深度為2 780 nm，B組再礦化牙體表面壓刻深度為1 570 nm。B組的再礦化壓刻深度最為接近天然牙釉質(zhì)。

Figure 2 SEM images of enamel surface morphology before and after remineralization圖2 再礦化前后牙釉質(zhì)表面形貌特征SEM圖片

Figure 3 Nanoindentation depth in each group圖3 各組壓刻深度

根據(jù)納米壓痕實驗所獲得的牙釉質(zhì)表面硬度和彈性模量值如表1所示，經(jīng)計算可得B組再礦化后的表面硬度和彈性模量與天然牙釉質(zhì)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 納米壓痕實驗檢測所得各組牙釉質(zhì)表面硬度及彈性模量Table 1 The hardness and elastic modulus of the enamel surfaces in the groups as determined by nanoindentation ±s

表1 納米壓痕實驗檢測所得各組牙釉質(zhì)表面硬度及彈性模量Table 1 The hardness and elastic modulus of the enamel surfaces in the groups as determined by nanoindentation ±s

1):compared with group B,P＜0.05；there was no significant difference between group B and natural enamel in terms of the hardness and elastic modulus of the enamel surface after remineralization；group A:1%NaClO+CMC/ACP；group B:1%NaClO+CMC/ACP+glycine.CMC:glycine-guided carboxymethyl chitosan；ACP:amorphous calcium phosphate

Item Hardness Elastic modulus Acid-etched enamel/GPa 0.30±0.121)35.70±0.101)Group A/GPa 0.42±0.081)41.50±1.701)Group B/GPa 0.88±0.21 61.70±1.70 Natural enamel/GPa 1.05±0.12 52.10±10.701)F P 31.729 22.359＜0.001＜0.001

3 討論

成熟牙釉質(zhì)的主要成分是含鈣磷離子的羥基磷灰石晶體，羥基磷灰石屬于六方晶系，大量羥基磷灰石晶體互相聚集排列形成納米纖維。牙釉質(zhì)的發(fā)育過程早期，首先形成羥基磷灰石納米纖維的中央部分微晶，隨后在釉原蛋白的調(diào)控下，晶體進一步排列聚集形成纖維束，纖維束在三維空間交叉排列形成釉柱和柱間質(zhì)［10］，隨后晶體逐漸成熟，有機物被成釉細胞吸收，無機物含量增高，組織硬度逐漸增大。

He等［11］研究發(fā)現(xiàn)，羧甲基殼聚糖可抑制鈣離子和磷酸氫根間形成沉淀的功能，本實驗使用CMC來形成鈣磷的ACP狀態(tài)，經(jīng)TEM觀察確認了其無定形狀態(tài)，證實了He等［11］的觀點。CMC為天然聚電解質(zhì)，其中的大量羧甲基基團可以包裹鈣、磷等金屬離子，從而使磷酸氫根與金屬離子隔絕［12］。本課題組前期實驗已經(jīng)證實，CMC對于ACP的穩(wěn)定作用可以持續(xù)長達1周而難于發(fā)生即刻礦化，這一特點不利于未來臨床椅旁轉(zhuǎn)化和臨床操作。Xiao等［13］認為質(zhì)量分數(shù)1%NaClO通過氧化反應(yīng)可以降解殼聚糖中的β-（1，4）糖苷鍵，分解CMC長鏈，使得ACP擺脫CMC的穩(wěn)定作用。本實驗通過在使用CMC/ACP前加入一定量的NaClO溶液來獲得反應(yīng)態(tài)ACP，該法模擬了天然牙釉質(zhì)形成過程中釉原蛋白引導(dǎo)ACP排列，而釉原蛋白降解后ACP向羥基磷灰石發(fā)生轉(zhuǎn)化這一生物特點［14-15］；并根據(jù)TEM觀察印證了Xiao等［13］的觀點。

獲得反應(yīng)態(tài)ACP后，如沒有加任何引導(dǎo)條件，則容易獲得沒有正常結(jié)構(gòu)的混亂羥基磷灰石沉淀結(jié)構(gòu)，如圖2b結(jié)構(gòu)。本研究納米壓痕實驗結(jié)果提示，僅使用經(jīng)NaClO降解的CMC/ACP再礦化脫礦牙釉質(zhì)表面，其再礦化機械性能與天然牙釉質(zhì)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。釉質(zhì)的高機械強度有賴于釉柱之間的排列有序，如果再礦化層的羥基磷灰石晶體能夠有序排列，那么其機械性能將能夠得到保障，從而再礦化的最終效果將與天然牙釉質(zhì)的機械性能相接近。因此，課題組使用CMC作為仿生釉原蛋白，NaClO作為仿生蛋白酶降解CMC，甘氨酸作為仿生多肽作為對ACP形成有序羥基磷灰石的誘導(dǎo)因素，從而促進ACP向羥基磷灰石轉(zhuǎn)化。這一序列來自于釉原蛋白的C端功能多肽CT-16序列。在甘氨酸多肽中，含有N端和C端的多肽在促進羥基磷灰石晶體形成的過程中，體現(xiàn)了促進顆粒自組裝、排列形成鏈狀結(jié)構(gòu)以及隨后形成彼此平行磷灰石結(jié)構(gòu)的作用，而去除了C端16個氨基酸的多肽則不具備此功能［16］。由此，本研究在NaClO釋放反應(yīng)態(tài)ACP后，加入了一定量的簡單氨基酸—甘氨酸，使之作為對ACP形成有序羥基磷灰石的誘導(dǎo)因素。甘氨酸作為一種簡單氨基酸，在加入再礦化液后，使得ACP的狀態(tài)更加不穩(wěn)定，促使其向羥基磷灰石發(fā)生轉(zhuǎn)化［17］。結(jié)合已有研究，天然羥基磷灰石的γ方向為其主軸（C-axis）的生長方向，筆者課題組認為甘氨酸的作用主要在于甘氨酸能夠改變晶體之間界面能的各向異性［18］。根據(jù)對甘氨酸以及羥基磷灰石分子結(jié)構(gòu)的計算機模擬可知，在甘氨酸缺失的情況下，γ方向的生長方向為長軸界面（001），而（001）的界面能量要低于（100）/（010）界面，而當加入甘氨酸后，這一關(guān)系則被逆轉(zhuǎn)［19］。由此在甘氨酸存在的條件下，（001）界面更加不穩(wěn)定，這就導(dǎo)致了最終羥基磷灰石晶體沿著（001）方向有序生長，這樣可以保證溶液中的羥基磷灰石晶體向著低能量的方向進行有序生長，從而形成了較好的晶體結(jié)構(gòu)。甘氨酸可特異性引導(dǎo)納米顆粒從無序變?yōu)橛行蚺帕?，從而形成細長的釉柱狀晶體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)與天然釉質(zhì)類似［20］。微觀上與天然牙釉質(zhì)類似的晶體結(jié)構(gòu)也對應(yīng)著宏觀上與天然牙釉質(zhì)更加接近的機械強度。B組的再礦化外觀、表面硬度和彈性模量都與天然牙釉質(zhì)相近，因此可推斷，加入甘氨酸、NaClO的CMC/ACP納米顆粒引導(dǎo)的再礦化，晶體相對穩(wěn)定且不易脫礦，抗機械摩擦的磨損率和抗撕脫性都與天然牙釉質(zhì)有著相似的特性，后續(xù)實驗還將對再礦化的牙釉質(zhì)抗脫礦穩(wěn)定性進行進一步的驗證。

本研究通過在NaClO引導(dǎo)的CMC/ACP納米顆粒中加入甘氨酸，形成快速牙釉質(zhì)再礦化齲模型的方法，探討再礦化液的成分對生物礦化的影響。甘氨酸既可以結(jié)合羥基磷灰石特異性連接序列［21］，也可以結(jié)合釉原蛋白中促進礦化的關(guān)鍵序列［22］，從而將活化的CMC/ACP礦化材料應(yīng)用于脫礦牙釉質(zhì)表面。TEM和SEM觀察結(jié)果提示，CMC可使高濃度過飽和的ACP呈現(xiàn)無定形晶相結(jié)構(gòu)，形成CMC/ACP納米復(fù)合物，而NaClO又可快速降解CMC/ACP納米復(fù)合物，使得納米復(fù)合物的粒徑增加，顆粒感更加明顯；在加入甘氨酸引導(dǎo)后，反應(yīng)態(tài)CMC/ACP（NAClO+CMC/ACP納米復(fù)合物）可以在已脫礦的釉質(zhì)表面形成定向有序的再礦化，再礦化的反應(yīng)速度增加而且礦化的外貌具有特異性，形成了均勻有序的羥基磷灰石結(jié)構(gòu)。再礦化的牙釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)的硬度和彈性模量與天然牙釉質(zhì)［23］相近。

綜上，甘氨酸、NaClO以及CMC聯(lián)合促進ACP向羥基磷灰石晶體快速轉(zhuǎn)化，并得到較好的再礦化效果，為探索相關(guān)的生物材料應(yīng)用于臨床早期釉質(zhì)齲的再礦化治療提供了基礎(chǔ)。