滲濾液中聚苯乙烯微塑料表面老化行為及抗性基因的富集規(guī)律

蘇應(yīng)龍，龐蕊蕊，邵博群，張中鍵，謝 冰

（華東師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200241）

塑料制品以其輕便等特點(diǎn)在日常生活和工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用，然而由于其難降解的特性而導(dǎo)致的塑料污染成為重要的環(huán)境問題之一。與此同時(shí)，廢棄塑料在紫外線照射、風(fēng)力等外界作用下逐步破碎化而形成一類廣受關(guān)注的新興污染物——微塑料。微塑料是指粒徑小于5 mm的塑料顆粒。目前，微塑料已經(jīng)被證實(shí)在海洋、土壤等中普遍存在［1-2］。環(huán)境中的微塑料容易與其他污染物發(fā)生相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，微塑料表面可以富集重金屬和有機(jī)污染物，從而改變后者遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律和傳播風(fēng)險(xiǎn)［3-4］。He等［5］、Su等［6］的調(diào)查顯示，垃圾填埋系統(tǒng)中的滲濾液已成為微塑料的重要污染源。同時(shí)，滲濾液中存在抗生素抗性基因（ARGs）等具有較高風(fēng)險(xiǎn)的新興污染物。微塑料表面會(huì)富集ARGs［7］，但是在滲濾液中，微塑料的存在是否會(huì)影響ARGs的環(huán)境行為還有待進(jìn)一步探究。

在自然環(huán)境中，塑料和微塑料顆粒在陽(yáng)光、風(fēng)力等作用下逐步發(fā)生老化，從而改變其表面性質(zhì)，而性質(zhì)的變化導(dǎo)致微塑料的環(huán)境行為以及對(duì)其他污染物的影響效應(yīng)發(fā)生改變［8］。Liu等［9］研究紫外加速老化對(duì)聚苯乙烯（PS）、聚氯乙烯（PVC）與環(huán)丙沙星（CIP）吸附相互作用的影響，發(fā)現(xiàn)老化后的塑料具有更強(qiáng)的吸附能力。由此可見，研究微塑料老化過程對(duì)其他污染物的影響可準(zhǔn)確評(píng)估其實(shí)際環(huán)境效應(yīng)。在滲濾液體系中，存在除了微塑料之外的多類型新興污染物，如具有較高傳播擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)的抗性基因［10］。已有研究發(fā)現(xiàn)，海洋環(huán)境中微塑料的存在可以促進(jìn)ARGs的傳播［11-12］。然而，目前尚未有研究分析長(zhǎng)期存在于滲濾液體系中微塑料的老化過程對(duì)ARGs行為的影響。

以環(huán)境中存在濃度較高的PS微塑料為例，分析其在滲濾液體系中的表面性質(zhì)變化，揭示其自然老化規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，分析PS微塑料老化過程對(duì)ARGs的富集效應(yīng)，并從微生物群落富集、微生物與ARGs的關(guān)聯(lián)關(guān)系和調(diào)控基因表達(dá)等方面揭示影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的PS微塑料購(gòu)自中國(guó)上海阿拉丁生化科技股份有限公司，尺寸為0.5～3.0 mm。PS是顆粒類和泡沫類塑料的主要成分，主要來源為生活用品及水上泡沫浮標(biāo)等［13］。滲濾液取自位于上海浦東的老港垃圾填埋場(chǎng)。作為生活垃圾填埋場(chǎng)，該填埋場(chǎng)生活垃圾日接收量約為1.2萬噸。原始滲濾液樣品用500 mL的玻璃瓶從滲濾液調(diào)節(jié)池中提取，并用鋁箔覆蓋瓶蓋內(nèi)部避免塑料瓶蓋受到污染，然后裝進(jìn)密封的盒子內(nèi)保存并帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 批次實(shí)驗(yàn)

為避免滲濾液中固有微塑料和其他顆粒態(tài)雜質(zhì)的干擾，實(shí)驗(yàn)前對(duì)滲濾液進(jìn)行300目（目=孔·m-2）的篩網(wǎng)過濾處理。將PS微塑料添加到含100 mL滲濾液的錐形瓶中，保證PS微塑料的最終含量為300～400個(gè)·L-1，該數(shù)值約為實(shí)際滲濾液中PS微塑料含量的10倍［5-6］。將錐形瓶置于（30±1）℃、200 rpm的搖床中以模擬實(shí)際滲濾液流動(dòng)過程，進(jìn)而分析其中PS微塑料的長(zhǎng)期老化行為，分別在30、60、90 d后取樣進(jìn)行分析。從錐形瓶中提取含有PS微塑料的滲濾液樣品，其中的PS微塑料顆粒用不銹鋼篩分離后用于分析物理化學(xué)特征、表面附著微生物群落和ARGs相對(duì)豐度。過濾后的滲濾液用于測(cè)定微生物群落和ARGs相對(duì)豐度。所有實(shí)驗(yàn)操作均含有3個(gè)平行樣品。

1.3 PS微塑料表面特征

在對(duì)提取的PS微塑料進(jìn)行表面理化性質(zhì)分析之前，先用體積分?jǐn)?shù)為30%的H2O2消化，再用雙蒸水（ddH2O）沖洗3次，去除表面附著的微生物和有機(jī)物。得到的PS微塑料進(jìn)一步自然干燥，以進(jìn)行后續(xù)理化性質(zhì)表征。

PS微塑料的熱穩(wěn)定性采用熱重分析儀STA449F3（NETZSCH，Germany）分析。PS微塑料質(zhì)量為10 mg，通過N2吸附/脫附，以10℃·min-1的升溫速率加熱到800℃。采用比表面積和孔隙度分析 儀（ASAP 2460，Micromeritics，USA）和Brunauer-Emmett-Teller（BET）吸附模型確定PS微塑料的比表面積。使用EscaLab 250Xi X射線光電子能譜儀（XPS）（ThermoFisher Scientific，USA）對(duì)PS微塑料表面元素組成進(jìn)行分析，XPS測(cè)量光譜能量為70 eV、能量躍遷為1.0 eV，C1s和O1s高分辨率光譜能量為30 eV、能量躍遷為0.05 eV。使用XPSpeak軟件（4.1版）處理高分辨率光譜信號(hào)。在衰減全反射模式下利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）掃描PS微塑料，波長(zhǎng)范圍為4 000～600 cm-1，分辨率為4 cm-1。利用紅外分析軟件（OMNIC）對(duì)紅外光譜圖進(jìn)行處理，根據(jù)FTIR結(jié)果計(jì)算羰基指數(shù)（CI）來確定PS微塑料表面的老化程度，CI為羰基部分（1 780～1 600 cm-1）與亞甲基部分參考峰（1 490～1 420 cm-1）的峰面積比值［14］。

1.4 DNA提取和ARGs定量

用PowerSoil DNA試劑盒（MoBio，USA）提取PS微塑料顆粒和滲濾液樣品的總DNA。用SMA4000分光光度計(jì)（Merinton，China）檢測(cè)DNA含量，提取的DNA保存于-20℃條件下用于后續(xù)的ARGs定量和微生物群落分析。

采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）在CFX96（Bio-Rad，USA）上檢測(cè)ARGs豐度［15-16］。本研究的目標(biāo)基因包括氨基糖苷類耐藥基因（aadA1和str B）、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（blaOXA和blaTEM）、磺胺類耐藥基因（sul1和sul2）、四環(huán)素類耐藥基因（tetQ）和整合子（intI1和intI2）。這些ARGs在滲濾液及其他環(huán)境中檢出頻率較高［15-16］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）在96孔板中進(jìn)行，分析試劑包括2.50μL 10x緩沖液（25 mmol·L-1Mg2+）、0.50μL dNTPs（10 mmol·L-1）、0.50μL Taq聚合酶（2.50 U）、0.50μL引物1（10μmol·L-1）、0.50μL引物2（10 μmol·L-1）、1μL DNA模板和19.50μL ddH2O。引物序列、擴(kuò)增子大小和目的基因退火溫度見參考文獻(xiàn)［17］。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；PCR循環(huán)（94℃，30 s，在一定溫度下退火30 s，72℃擴(kuò)增30 s，循環(huán)40次）；74℃擴(kuò)增30 s。所有目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率在（100%±10%）內(nèi)，R2≥0.99?？截悢?shù)由標(biāo)準(zhǔn)曲線確定，ARGs的數(shù)量由16S rRNA基因歸一化后的相對(duì)豐度評(píng)估。

1.5 微生物群落分析

利用Illumina Miseq 2000平臺(tái)對(duì)細(xì)菌16S rRNA的基因高變區(qū)（V3-V4）進(jìn)行擴(kuò)增、純化、定量并測(cè)序，以研究滲濾液和PS微塑料上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。生成的序列通過Ribosomal Database Project（RDP）將引物、低質(zhì)量、歧義堿基序列過濾掉，從而得到高質(zhì)量序列［18］。利用QIIME（v1.8.0）中的聚類算法UCLUST以97%的相似度對(duì)得到的高質(zhì)量序列進(jìn)行操作分類單元（OTU）聚類分析，然后選擇每個(gè)OTU的代表性序列，利用Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)以0.80的置信閾值分配到分類系統(tǒng)中。通過計(jì)算α-多樣性來評(píng)價(jià)細(xì)菌的豐富度，β-多樣性來分析樣品間基于Bray-Curtis距離的細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)差異?；谶@些序列，利用Picrust預(yù)測(cè)部分功能基因的表達(dá)水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件（IBM公司，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用方差分析（ANOVA）明確樣品ARGs豐度差異，將P＜0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。采用R（V 3.3.2）中的軟件包vegan、Hmisc和igraph構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)來分析滲濾液和PS微塑料表面ARGs與微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)，網(wǎng)絡(luò)由軟件Gephi（V 0.9.2）繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 滲濾液中PS微塑料的理化性質(zhì)變化

在自然環(huán)境下，PS微塑料易發(fā)生老化現(xiàn)象，從而導(dǎo)致表面理化性質(zhì)的改變。采用熱重分析揭示PS微塑料的熱穩(wěn)定性變化。如圖1a所示，相比老化前PS微塑料顆粒，滲濾液中自然老化90 d后的PS微塑料顆粒的熱重性質(zhì)發(fā)生了顯著改變。特征溫度T5，即失重率為5%時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度，是用來表示聚合物低溫?zé)嵝阅艿闹匾笜?biāo)［19-20］。滲濾液中老化后PS微塑料的T5值從老化前PS微塑料的370℃降至293℃，而T5值越低，表示樣品中存在越多的不穩(wěn)定中間體，可在中低溫條件下被分解。隨著溫度升高至800℃，老化后PS微塑料仍存在8.5%的殘留物質(zhì)，顯著高于老化前PS微塑料（1.2%）。原因可能是，滲濾液中的微生物降解作用導(dǎo)致易降解組分含量降低，從而難降解組分相對(duì)百分比較高。此外，老化過程也可能形成高溫下難以分解的高度交聯(lián)結(jié)構(gòu)［21］。

圖1 PS微塑料顆粒在滲濾液中老化90 d前后的性質(zhì)表征Fig.1 Characteristics of PS MPs before and after being aged in leachate for 90 d

老化前后PS微塑料的比表面積、元素組成等理化參數(shù)如表1所示。老化后PS微塑料的比表面積增加了1.5倍。為了研究PS微塑料表面元素組成的變化，利用X射線光電子能譜（XPS）對(duì)其元素含量進(jìn)行表征（見圖1b）。圖1b中，氧和碳的結(jié)合能分別為532 eV和284.9 eV。顯而易見，與老化前PS微塑料相比，老化后PS微塑料的氧元素含量更高，wO/wC為0.20，高于老化前的0.04，該結(jié)果表明老化后PS微塑料表面含氧基團(tuán)顯著增多。進(jìn)一步采用C1s高分辨率譜分析表面基團(tuán)的形式，其中284.6 eV和286～287 eV分別對(duì)應(yīng)主峰C-C鍵和C-O鍵，結(jié)果表明C-O鍵是老化后PS微塑料表面存在的主要含氧基團(tuán)。

表1 滲濾液老化前后PS微塑料的表面性質(zhì)Tab.1 Surface properties of PS MPs before and after being aged in leachate

圖2是PS微塑料在滲濾液老化過程中的紅外光譜圖。從圖2可以看出，老化后PS微塑料顆粒在部分波數(shù)的信號(hào)增強(qiáng)，即形成新的基團(tuán)，如RC-OH（1 168 cm-1處的C-O伸縮振動(dòng)，1 360 cm-1處的O-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)）、RCOOH（1 732 cm-1處的C=O伸縮振動(dòng)，960 cm-1處的O-H面外彎曲振動(dòng)）和Ar-OH（1 380 cm-1處的C-O伸縮振動(dòng)）。此外，羰基指數(shù)是評(píng)價(jià)微塑料表面氧化程度的重要指標(biāo)［19，22］。在滲濾液老化90 d后PS微塑料的羰基指數(shù)為0.35，高于老化前PS微塑料的0.11，因此自然老化增加了PS微塑料表面的氧化程度。然而，滲濾液中自然老化的微塑料的羰基指數(shù)低于高級(jí)氧化處理的微塑料［22］，這表明相比物理化學(xué)處理手段，自然老化過程造成的氧化程度較低。同時(shí)，在滲濾液的自然老化過程中，PS微塑料表面變化主要是形成C-O的基團(tuán)發(fā)生氧化，其氧化程度低于C=O。

圖2 不同老化時(shí)間下PS微塑料的紅外光譜Fig.2 FTIR spectra of PS MPs before and after being aged in leachate for different aged days

2.2 老化過程中PS微塑料表面上ARGs和微生物群落的演變過程

除了PS微塑料，抗生素抗性基因（ARGs）也是滲濾液中存在的高風(fēng)險(xiǎn)新興污染物之一［6，16］。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的微塑料可富集重金屬、抗生素等污染物，從而增加其擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)［23-25］。Lu等［26］在2019年報(bào)道了海洋環(huán)境中PS微塑料表面可富集ARGs。上述結(jié)果證實(shí)，滲濾液中PS微塑料表面性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變，而性質(zhì)變化會(huì)影響其對(duì)污染物的吸附行為。鑒于此，通過定量分析滲濾液中PS微塑料表面上ARGs的豐度，明確老化過程中PS微塑料對(duì)ARGs影響規(guī)律的變化。如圖3所示，隨著老化時(shí)間的增加，PS微塑料表面上ARGs如sul1、blaOXA、blaTEM、tetQ和intI2的相對(duì)豐度顯著高于滲濾液體系中，富集倍數(shù)為1.9～31 200.0倍，而aadA1、strB、sul2、intI1等ARGs則無明顯富集現(xiàn)象。Lu等［26］的研究也發(fā)現(xiàn)，微塑料上總ARGs相對(duì)豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于水中對(duì)應(yīng)值。因此，滲濾液體系中可在PS微塑料表面富集ARGs，并且老化過程可增強(qiáng)富集效果。

圖3 目標(biāo)ARGs在滲濾液中和PS微塑料表面上相對(duì)豐度變化箱線圖Fig.3 Boxplot of relative abundance variations of target ARGs in leachate and on PS MPs’surface

細(xì)菌群落是決定ARGs環(huán)境行為的重要因素之一［6，16］。大量研究表明，微塑料表面可附著和定殖微生物群落，尤其是病原菌［27-28］。因此，進(jìn)一步分析老化過程中滲濾液和PS微塑料表面微生物群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律。在屬水平上，共檢測(cè)到20個(gè)屬，其中棒狀桿菌屬（Corynebacterium）在所有樣本中為主要組成屬，相對(duì)豐度為17.318%～71.812%。孢子蟲屬（Sporosarcina）在第30天和第60天滲濾液中和PS微塑料表面上均為主要菌屬，平均相對(duì)豐度分別為24.6%和15.1%，而空白組在第60天未檢出，在第90天所有樣本中均未檢出。特呂珀菌屬（Truepera）在第30天未檢出，在第60天開始檢出，其中空白組先提高后降低，滲濾液中和PS微塑料表面上在第90天時(shí)相對(duì)豐度分別增加到了9.30%和15.03%。賴氏菌屬（Leifsonia）在第60天檢出，在第90天滲濾液中相對(duì)豐度顯著增加，達(dá)到29.10%。此外，在PS微塑料老化過程中，溶桿菌屬（Lysobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、少鹽芽胞桿菌屬（Paucisalibacillus）和假棍狀桿菌屬（Pseudoclavibacter）在滲濾液中和PS微塑料表面上相對(duì)豐度均有所下降。對(duì)滲濾液中和PS微塑料表面上主要菌群相對(duì)豐度進(jìn)行比較，PS微塑料表面上棒狀桿菌屬的相對(duì)豐度是滲濾液的1.52～2.05倍。由此可見，PS微塑料對(duì)棒狀桿菌屬具有較強(qiáng)的選擇富集能力，而棒狀桿菌屬是一種重要的病原菌。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類似，即微塑料可作為致病菌的主要載體，具有致病性的微生物在其表面上進(jìn)行富集從而增加環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)［29］。隨著滲濾液中PS微塑料表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其表面更易吸附和定殖微生物，而不同類型微生物的定殖和富集能力具有差異，從而導(dǎo)致微生物相對(duì)豐度變化規(guī)律不同。因此，隨著老化過程的進(jìn)行，賴氏菌屬的相對(duì)豐度逐漸增加，而其他部分微生物的相對(duì)豐度（如假棍狀桿菌屬、溶桿菌屬、芽孢桿菌和少鹽芽胞桿菌屬）呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。

2.3 老化過程中PS微塑料表面上ARGs變化機(jī)制

采用網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步從群落結(jié)構(gòu)變化的角度揭示PS微塑料表面上ARGs的富集規(guī)律。圖4a和4b分別為整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期所測(cè)得的滲濾液中和PS微塑料表面上目標(biāo)ARGs與微生物屬之間的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。其中，滲濾液體系中ARGs與34個(gè)屬相關(guān)，而PS微塑料表面上ARGs相關(guān)微生物屬為25個(gè)，即滲濾液中的ARGs潛在宿主具有更高的多樣性。此外，通過分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)湫再|(zhì)可以發(fā)現(xiàn)，PS微塑料表面上的ARGs-微生物網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)直徑（ND）和聚類系數(shù)（CC）分別為3.28和0.47，高于滲濾液中相應(yīng)的屬性值（2.82和0.40），較高的網(wǎng)絡(luò)直徑和聚類系數(shù)表明PS微塑料表面上的微生物與ARGs存在更為緊密的關(guān)聯(lián)關(guān)系，即宿主微生物在ARGs的傳播中發(fā)揮更為明顯的作用。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果與微生物群落結(jié)構(gòu)演變過程相符合。通過圖4可以發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)ARGs與棒狀桿菌屬?zèng)]有相關(guān)性，即棒狀桿菌屬不是ARGs的潛在宿主微生物，因而其他ARGs宿主微生物在PS微塑料表面上的大量富集導(dǎo)致棒狀桿菌屬相對(duì)豐度降低。另外，特呂珀菌屬和賴氏菌屬與目標(biāo)ARGs相關(guān)性較高，這與兩者在老化過程中相對(duì)豐度從低到高的變化緊密相關(guān)。以上結(jié)果表明，PS微塑料表面上的ARGs與微生物具有更為密切的關(guān)聯(lián)作用，即形成區(qū)別于滲濾液體系的特定生態(tài)位。

圖4 滲濾液中和PS微塑料表面上ARGs與潛在宿主屬的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Network analysis of co-occurrence of ARGs and potential host genera in leachate and on PS MPs’surface

除了細(xì)菌群落，ARGs的變化受到微生物基因水平的調(diào)控?；诖?，采用Picrust分析預(yù)測(cè)了部分與調(diào)控抗性基因相關(guān)基因的相對(duì)豐度。圖5表示部分功能基因的表達(dá)水平，基因表達(dá)單位為RPKM，即百萬序列中來自于目標(biāo)基因每千堿基長(zhǎng)度的序列數(shù)。其中，tcaB（K07552）為調(diào)控大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗性的基因，pcoD（K07245）和nrsD（K07785）分別編碼針對(duì)重金屬銅和鎳抗性的蛋白。大量研究表明，微生物對(duì)抗生素與重金屬抗性具有較強(qiáng)的共選擇效應(yīng)［30-31］。本研究中，PS微塑料表面上微生物中抗生素和重金屬抗性相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)水平顯著高于滲濾液體系中。由此可見，PS微塑料表面定殖的微生物具有顯著區(qū)別于滲濾液的生態(tài)位，其中涉及抗生素抗性調(diào)控的基因表達(dá)水平較高而導(dǎo)致PS微塑料表面ARGs相對(duì)豐度高于滲濾液。此外，PS微塑料老化過程中伴隨著部分降解，PS微塑料表面上微生物群落演變過程可能與能夠降解塑料的微生物相關(guān)，從而使得相關(guān)的ARGs發(fā)生改變。

圖5 滲濾液中和PS微塑料表面上與ARGs相關(guān)的部分功能基因表達(dá)水平Fig.5 Predicted expression level of typical functional genes involved in ARGs propagation in leachate and on PS MPs’surface

3 結(jié)論

（1）滲濾液中長(zhǎng)期存在的PS微塑料顆粒發(fā)生老化現(xiàn)象，90 d老化后可導(dǎo)致其表面理化性質(zhì)改變，包括熱穩(wěn)定性改變、比表面積變大、C-O基團(tuán)含量增加等。

（2）滲濾液中PS微塑料表面上選擇性富集ARGs，并且隨著老化時(shí)間延長(zhǎng)富集倍數(shù)顯著增加。此外，PS微塑料表面附著的微生物群落中含有更高相對(duì)豐度的病原菌。

（3）相比滲濾液體系中，PS微塑料表面上ARGs與微生物形成更為穩(wěn)定和密切的關(guān)聯(lián)關(guān)系，參與抗生素抗性的調(diào)控基因表達(dá)水平較高。這些結(jié)果都導(dǎo)致PS微塑料表面上ARGs相對(duì)豐度較高，從而增強(qiáng)ARGs的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)。