外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗形態(tài)及抗氧化系統(tǒng)的影響*

段文靜,孟妍君,江 丹,劉連濤,張 科,張永江,孫紅春,白志英**,李存東**

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 保定 071000; 2.華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省作物生長(zhǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 保定 071000)

土壤鹽漬化是由自然或人類活動(dòng)引起的一種主要環(huán)境風(fēng)險(xiǎn),全球大約有8.31億hm土壤受到鹽漬化威脅。鹽分脅迫對(duì)植物產(chǎn)生的顯著效應(yīng)就是抑制植物組織和器官進(jìn)行生長(zhǎng)與分化,從而造成植物生長(zhǎng)發(fā)育遲緩。根是植物的主要營(yíng)養(yǎng)器官之一,根系與植物地上部分相互作用、共同協(xié)調(diào),促使植物能夠在變化環(huán)境中正常發(fā)育。根系亦是植物最先感知鹽環(huán)境的器官,鹽脅迫能夠抑制作物根和地上部生長(zhǎng),影響幼苗株高以及干物質(zhì)積累。鹽脅迫亦可導(dǎo)致植物根系發(fā)生一系列變化,致使單株平均根數(shù)減少、幼苗主根變短、長(zhǎng)度下降以及根總面積減小。

鹽脅迫導(dǎo)致滲透脅迫和離子毒害,可使植物產(chǎn)生大量活性氧(ROS),致使丙二醛(MDA)等有害過(guò)氧化物積累,造成膜脂過(guò)氧化,導(dǎo)致ROS產(chǎn)生與清除之間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞,從而造成氧化脅迫。植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)等。鹽脅迫下植物體內(nèi)抗氧化酶活性上升,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖含量增加,以清除過(guò)多ROS,從而保護(hù)膜系統(tǒng)免受破壞,提高植物的耐鹽性; 植物細(xì)胞在鹽脅迫下所能忍受的ROS水平存在一個(gè)閾值,在閾值之內(nèi),植物能夠通過(guò)提高抗氧化酶活性來(lái)清除活性氧自由基,但當(dāng)超過(guò)這個(gè)閾值時(shí),抗氧化酶活性便會(huì)受到抑制。

褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺,MT),又名松果素、美拉托寧,是一種低分子量(232.27)的吲哚胺類物質(zhì),1958年于牛的松果體中被首次發(fā)現(xiàn)。在褪黑素發(fā)現(xiàn)后40年里,人們一直認(rèn)為褪黑素是一種動(dòng)物激素,直到1995年后,在大量植物中亦發(fā)現(xiàn)了褪黑素。研究發(fā)現(xiàn),褪黑素具有多種生理功能,可促進(jìn)植物發(fā)育,并增強(qiáng)植物的抗逆性。不同植物可從根、子葉、葉和種子中吸收外源褪黑素。陳莉等研究發(fā)現(xiàn),低濃度褪黑素(10 μmol·L、20 μmol·L)浸種處理能夠促進(jìn)種子胚根伸長(zhǎng),增加種子萌發(fā)后的生物量; 提高了棉花(spp.)種子的SOD、POD、CAT、APX活性,增加可溶性糖含量,降低MDA含量,提高棉花種子的抗鹽能力。褪黑素亦能夠提高甜瓜(L.)、油菜(L.)和擬南芥[(L.) Heynh.]等植物的抗氧化物酶活性,增強(qiáng)植物抗逆性。褪黑素能夠調(diào)控植物根系的發(fā)育,從而影響作物生長(zhǎng)。Ye等發(fā)現(xiàn),100 μmol·L褪黑素浸種預(yù)處理能夠促進(jìn)小麥(L.)根系的發(fā)育。Zhang等研究發(fā)現(xiàn),100 μmol·L褪黑素能促進(jìn)黃瓜(L.)根系生長(zhǎng),增強(qiáng)根系活力,提高根莖比率。Park等結(jié)果表明,0.5 μmol·L和1 μmol·L褪黑素能增加水稻(L.)種子根長(zhǎng)和根系生物量,促進(jìn)幼苗根系的生長(zhǎng)發(fā)育。習(xí)林杰認(rèn)為,施加1 μmol·L褪黑素促進(jìn)了鹽脅迫下生菜(var.Hort.)的側(cè)根數(shù)目、根直徑以及根系表面積。

棉花是一種耐鹽性較強(qiáng)的作物,對(duì)鹽脅迫具有一定的適應(yīng)性和調(diào)節(jié)能力,但其苗期耐鹽性較差。目前關(guān)于褪黑素對(duì)棉花調(diào)控效應(yīng)的研究主要集中于種子萌發(fā)方面,而關(guān)于外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗的影響及調(diào)控效應(yīng)研究較少。因此,本研究以‘國(guó)欣棉9號(hào)’為材料,探討褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗形態(tài)及其抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響及調(diào)控效應(yīng),為褪黑素的開發(fā)利用及棉花栽培調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試棉花品種為‘國(guó)欣棉9號(hào)’,由河北省河間市國(guó)欣農(nóng)村技術(shù)服務(wù)總會(huì)提供。褪黑素配置: 將褪黑素(Sigma公司)用95%乙醇稀釋至200 mmol·L,作為儲(chǔ)液保存在—20 ℃冰箱; 供試營(yíng)養(yǎng)液為霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 褪黑素濃度的篩選

試驗(yàn)于2020—2021年在河北省保定市河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)溫室進(jìn)行。

選取大小一致、飽滿且胚完整的棉花種子,75%乙醇浸泡消毒20 min,蒸餾水沖洗4次。消毒后,將棉花種子分別在0 μmol·L、0.1 μmol·L、1 μmol·L、10 μmol·L、50 μmol·L、100 μmol·L和150 μmol·L的褪黑素溶液中浸泡24 h,之后將種子平鋪于放有濕毛巾的托盤上,待棉種萌發(fā)并露白1 cm時(shí),播于穴盤中。棉花幼苗長(zhǎng)到1葉一心時(shí)移到霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中。在棉苗長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)開始鹽處理(預(yù)試驗(yàn)篩選,NaCl濃度為150 mmol·L)。在鹽處理第15 d時(shí),對(duì)棉花幼苗株高、干物質(zhì)重量和根系形態(tài)進(jìn)行測(cè)定。設(shè)置8個(gè)處理: 0 NaCl＋0 μmol·L褪黑素(CK)、150 mmol·LNaCl+0 μmol·L褪黑素(S)、150 mmol·LNaCl+0.1 μmol·L褪黑素(MT0.1)、150 mmol·LNaCl+1 μmol·L褪黑素(MT1)、150 mmol·LNaCl+10 μmol·L褪黑素(MT10)、150 mmol·LNaCl+50 μmol·L褪黑素(MT50)、150 mmol·LNaCl+100 μmol·L褪黑素(MT100)和150 mmol·LNaCl+150 μmol·L褪黑素(MT150),每處理重復(fù)3次,每12株棉苗的平均值表示1次重復(fù),營(yíng)養(yǎng)液每3 d更換一次,每天上午下午各充氧1 h。室內(nèi)晝夜溫度分別控制在28 ℃/25 ℃,光周期為14 h/10 h,濕度恒定為75%,光照強(qiáng)度為600 μmol·m·s。

1.2.2 試驗(yàn)處理

選取大小一致棉花種子,種子消毒后晾干。以預(yù)試驗(yàn)篩選出的10 μmol·L作為褪黑素濃度,將棉花種子分別在0 μmol·L和10 μmol·L的褪黑素溶液中浸泡24 h,之后將種子平鋪于放有濕毛巾的托盤上,待棉種萌發(fā)并露白1 cm時(shí),播于穴盤中。棉花幼苗長(zhǎng)到1葉一心時(shí)移到霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中。在棉苗長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)開始鹽處理(NaCl濃度為150 mmol·L)。設(shè)置4個(gè)處理: 0 NaCl+0 μmol·L褪黑素(CK)、0 NaCl+10 μmol·L褪黑素(MT)、150 mmol·LNaCl+0 μmol·L褪黑素 (S)、150 mmol·LNaCl+10 μmol·L褪黑素(MS),每個(gè)處理重復(fù)3次,每12株棉苗的平均值表示1次重復(fù),室內(nèi)培養(yǎng)條件同上。

在處理第15 d時(shí),測(cè)定棉苗葉和根系的形態(tài)、生物量及其生理指標(biāo),每個(gè)處理取6株棉花幼苗。

1.3 測(cè)定方法

株高: 利用直尺測(cè)量子葉節(jié)到頂端生長(zhǎng)點(diǎn)長(zhǎng)度。

干物重: 各處理分別取6株幼苗,分成地上和地下兩部分,在通風(fēng)處晾干。105 ℃殺青20 min,電熱鼓風(fēng)干燥箱85 ℃烘至恒重。

根系形態(tài): 將幼苗根系置于掃描儀上,使其漂浮于平板掃描儀(A3尺寸)丙烯酸托盤中,避免根系重疊和交叉; 利用EPSON Scan掃描軟件掃描幼苗根系,獲取根系掃描圖片后,利用根系分析系統(tǒng)Win-RHIZO分析總根長(zhǎng)、總投影面積、總表面積、總體積、根系平均直徑等形態(tài)學(xué)參數(shù); 利用根系分析系統(tǒng)WinRHIZOTron分析側(cè)根數(shù)目、主根長(zhǎng)、主根平均直徑、主根表面積等形態(tài)學(xué)參數(shù)。

生理指標(biāo): SOD活性測(cè)定采用WST-1法,POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法,CAT活性測(cè)定采用鉬酸銨法,APX活性測(cè)定利用紫外比色法,MDA含量測(cè)定利用微板法,可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法。SOD、POD、CAT和APX活性及MDA和可溶性糖含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用方差分析(ANOVA),采用SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),作圖采用GraphPad Prism 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素濃度的篩選

2.1.1 不同濃度褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗株高和干物質(zhì)積累的影響

不同濃度褪黑素和鹽脅迫處理對(duì)棉花幼苗株高和干物質(zhì)積累量產(chǎn)生了不同程度的影響。由表1可知,與正常條件(對(duì)照,CK)相比,鹽脅迫處理的棉花幼苗株高均出現(xiàn)了顯著降低(＜0.05); 而經(jīng)褪黑素浸種的棉花幼苗,在鹽脅迫處理下,株高隨褪黑素濃度升高呈現(xiàn)先升后降的變化,其中在MT10處理下棉花幼苗株高最高,與CK處理差異顯著(＜0.05)。

表1 不同濃度褪黑素（MT）對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗株高和干物質(zhì)重量的影響Table 1 Effects of melatonin (MT) under different concentrations on plant height and dry matter weight of cotton seedlings under salt stress

分析幼苗干物重可知,鹽脅迫處理的棉花幼苗干物質(zhì)重量相比于CK顯著降低(＜0.05),褪黑素浸種處理的棉花幼苗,在鹽脅迫下干物質(zhì)重量隨褪黑素濃度升高先升高后降低,在MT10處理下棉花幼苗干物質(zhì)重量最高,這表明10 μmol·L褪黑素浸種處理能夠促進(jìn)鹽脅迫下棉苗干物質(zhì)量積累。

2.1.2 不同濃度褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花根系形態(tài)的影響

不同褪黑素處理對(duì)鹽脅迫下棉花根系形態(tài)產(chǎn)生了不同調(diào)控效應(yīng)。分析根系形態(tài)參數(shù)(表2)可知,鹽脅迫下(S),總根長(zhǎng)、根系總投影面積、根系總表面積、根系總體積、根系平均直徑均顯著低于CK。施加不同濃度褪黑素后,棉苗根系形態(tài)參數(shù)均隨褪黑素濃度升高呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。在MT0.1、MT1、MT10、MT50、MT100處理下,棉苗根系總根長(zhǎng)均顯著高于S處理,分別增加了31.13%、42.58%、57.13%、51.13%和39.35%,但MT150處理與S間無(wú)顯著差異。MT0.1、MT1、MT10、MT50、MT100、MT150處理下,棉苗根系投影面積較S處理顯著增加32.09%、56.91%、93.52%、81.94%、59.98%和33.79%。MT0.1和MT150處理下,根系總表面積分別比S處理增加23.37%和25.76%,但與S處理無(wú)顯著差異; MT1、MT10、MT50和MT100處理則顯著高于S處理,且MT10與CK之間則無(wú)顯著性差異。MT0.1、MT1、MT10、MT50、MT100處理下,棉苗根系總體積均顯著高于S處理,分別增加48.91%、63.04%、89.13%、77.17%和56.52%,且MT10處理的根系總體積增加量最大。比較根系平均直徑可知,除CK與S和MT0.1處理存在顯著性差異外,其他各處理之間差異并不顯著,且MT10處理的平均直徑最高,比S處理增加22.92%但差異不顯著。這表明不同濃度褪黑素對(duì)鹽脅迫下的棉苗根系形態(tài)產(chǎn)生影響不同,其中10 μmol·L褪黑素濃度處理下根系形態(tài)表現(xiàn)最佳。因此10 μmol·L褪黑素作為本試驗(yàn)的最適褪黑素濃度。

表2 不同濃度褪黑素（MT）對(duì)棉花幼苗根系形態(tài)的影響Table 2 Effects of melatonin (MT) under different concentrations on root morphology of cotton seedlings

2.2 褪黑素浸種對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗株高和干物質(zhì)積累的影響

從表3可知,褪黑素浸種(MT)后,棉花幼苗株高比正常條件(對(duì)照,CK)增加2.37%,但二者之間未呈現(xiàn)顯著性差異; 鹽脅迫(S)下,幼苗株高顯著低于MT和CK處理; 褪黑素處理(MS)后,幼苗株高顯著高于S處理,比S處理增加26.41%,但顯著低于MT和CK處理。表明正常條件下褪黑素浸種促進(jìn)棉花幼苗株高的效果并不顯著; 而鹽脅迫條件下,褪黑素浸種顯著緩解了鹽脅迫對(duì)棉花幼苗生長(zhǎng)的抑制。

從表3可知,在正常條件下,MT處理地上、地下部及總干重分別比CK增加20.48%、20.00%、21.43%,MT與CK之間的地上部及總干重呈現(xiàn)顯著性差異,但地下部干重卻無(wú)顯著性差異; 鹽脅迫處理(S)下,地上、地下及總干物重均顯著低于MT和CK處理(＜0.05); 褪黑素浸種處理(MS)后,地上部、地下部及總干重均顯著高于S處理,分別比S處理提高25.64%、85.71%和37.78%,但均低于CK和MT處理。這表明褪黑素浸種處理同樣能夠促進(jìn)鹽環(huán)境下棉苗地上、地下部及總干物質(zhì)量積累。

表3 褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗株高和干物質(zhì)重量的影響Table 3 Effects of melatonin on plant height and dry matter weight of cotton seedlings under salt stress

2.3 褪黑素浸種對(duì)鹽脅迫下棉花苗期根系形態(tài)的影響

從表4可知,MT處理比CK處理的棉苗根系總長(zhǎng)、總投影面積、總表面積、總體積以及側(cè)根數(shù)分別提高7.52%、5.45%、9.02%、16.44%和19.40%,且MT處理下的總側(cè)根數(shù)顯著高于CK。而對(duì)于主根而言,MT處理比CK處理的棉苗主根長(zhǎng)、表面積、體積和平均直徑分別提高2.36%、81.55%、23.08%和38.03%,且MT處理下主根平均直徑和主根表面積顯著高于CK處理。

比較鹽脅迫條件下(表4)的幼苗根系形態(tài)發(fā)現(xiàn),S處理的棉苗總根長(zhǎng)、總投影面積、總表面積、平均根系直徑及側(cè)根數(shù)目顯著低于CK和MT處理。施加褪黑素后,MS處理比S處理的棉苗總根長(zhǎng)、總投影面積、總表面積、總體積、平均根系直徑以及側(cè)根數(shù)目分別增加56.94%、80.10%、49.56%、51.55%、15.56%和57.03%,這兩個(gè)處理之間僅有總根長(zhǎng)、總投影面積、總表面積和側(cè)根數(shù)目存在顯著性差異。而對(duì)于主根而言,S處理的棉苗主根長(zhǎng)、根表面積和根體積亦低于CK和MT處理,而根平均直徑顯著低于MT處理,但與CK相比無(wú)顯著性差異。施加褪黑素后,MS比S處理棉苗主根長(zhǎng)、根表面積、根體積和根平均直徑分別提高4.41%、57.99%、40.94%和18.89%,但僅有主根平均直徑和主根表面積存在顯著性差異(＜0.05)。這表明褪黑素浸種處理能夠增加棉花苗期根系總根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)目和主根平均直徑,可通過(guò)促進(jìn)棉苗側(cè)根發(fā)育和主根直徑增粗來(lái)緩減鹽脅迫對(duì)棉花幼苗的傷害,但褪黑素浸種對(duì)棉花主根長(zhǎng)的促進(jìn)效果并不顯著。

表4 褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗根系形態(tài)的影響Table 4 Effects of melatonin on root morphology of cotton seedlings under salt stress

2.4 褪黑素浸種對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗抗氧化酶活性的影響

2.4.1 對(duì)SOD活性的影響

SOD是清除植物體內(nèi)有害物質(zhì)的關(guān)鍵活性酶。如圖1A所示,在CK、MT、S和MS處理下,葉片SOD活性 分 別是13 961.29 U·g、13 251.61 U·g、6787.10 U·g和9574.19 U·g。MT處理的棉苗葉片SOD活性與CK間無(wú)顯著性差異; 在鹽脅迫的S和MS處理均顯著低于CK和MT處理,但MS處理的SOD活性比S處理顯著提高41.06%,表明褪黑素浸種能顯著提高鹽脅迫下棉花葉片SOD活性。

CK、MT、S和MS處理下棉苗根系SOD活性分 別 為466.11 U·g、514.29 U·g、356.75 U·g和398.41 U·g(圖1B)。在正常條件下,MT處理的棉苗根系SOD活性最高,比CK處理顯著提高10.34%; 鹽脅迫的S和MS處理均顯著低于CK和MT處理,但MS處理比S處理顯著提高9.15%,說(shuō)明褪黑素浸種能夠促進(jìn)鹽脅迫與正常條件下棉花根系SOD活性。

2.4.2 對(duì)POD活性的影響

棉苗POD活性的變化趨勢(shì)與SOD活性相似(圖1C)。MT處理的葉片POD活性最高,為215.26 U·g,比CK處理顯著提高11.04%; 鹽脅迫的S和MS處理的POD活性(153.35 U·g和189.22 U·g)均低于CK和MT處理,但MS處理比S處理的棉苗葉片POD 活性顯著提高23.39%,表明褪黑素浸種能夠顯著提高鹽脅迫與正常條件下棉花葉片的POD活性。

MT處理的根系POD活性最高,為209.48 U·g,與CK(193.85 U·g)處理間無(wú)顯著差異; 鹽脅迫條件下,S和MS處理的根系POD活性分別為153.35 U·g和185.17U·g,均低于CK和MT處理,但MS比S處理顯著提高20.75%(圖1D),說(shuō)明褪黑素浸種能夠促進(jìn)鹽脅迫棉花根系POD活性的提高。

2.4.3 對(duì)CAT活性的影響

由圖1E可知,CK、MT、S和MS處理下,棉花幼苗葉片CAT活性分別是89.37 U·mg、77.71 U·mg、22.91 U·mg和72.61 U·mg。MT和CK處理之間無(wú)顯著差異; 鹽脅迫的S和MS處理均低于CK和MT處理,但MS比S處理葉片CAT活性顯著提高216.94%,表明褪黑素浸種能顯著提高鹽脅迫下棉花葉片的CAT活性。

圖1 褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗葉片（A,C,E,G）和根系（B,D,F,H）超氧化物歧化酶（SOD,A和B）、過(guò)氧化物酶（POD,C和D）、過(guò)氧化氫酶（CAT,E和F）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX,G和H）活性的影響Fig.1 Effect of melatonin on activities of superoxide dismutase (SOD,A and B),peroxidase (POD,C and D),catalase (CAT,E and F) and ascorbate peroxidase (APX,G and H) of cotton seedling leaves (A,C,E,G) and roots (B,D,F,H) under salt stress

由圖1F可知,CK、MT、S和MS處理下,棉花根系CAT活性分別是16.14 U·mg、26.13 U·mg、8.64 U·mg和13.79 U·mg。MT處理的棉苗根系CAT活性最高,比CK處理顯著提高61.90%; 鹽脅迫的S和MS處理均低于CK和MT處理,但MS比S處理根系CAT活性顯著提高59.61%,說(shuō)明褪黑素浸種能增強(qiáng)鹽脅迫與正常條件下棉苗根系的CAT活性。

2.4.4 對(duì)APX活性的影響

APX是植物活性氧代謝中一種重要抗氧化酶,可清除大量過(guò)氧化氫。CK、MT、S和MS處理下(圖1G),棉花葉片APX活性分別是0.27 U·g、0.23 U·g、0.07 U·g和0.14 U·g。MT和CK處理間無(wú)顯著差異; 鹽脅迫的S和MS處理均低于CK和MT處理,但MS比S處理顯著提高100.00%,表明褪黑素浸種增強(qiáng)了鹽脅迫條件下棉花葉片的APX活性。

CK、MT、S和MS處理下,棉花根系的APX活性分別是0.20 U·g、0.27 U·g、0.06 U·g和0.17 U·g(圖1H)。MT處理的棉苗根系A(chǔ)PX活性最高,比CK處理顯著提高35.00%; 鹽脅迫的 S和MS處理均低于CK和MT處理,但MS處理比S處理顯著提高183.33%,表明褪黑素浸種促進(jìn)了鹽脅迫與正常條件下棉苗根系的APX活性增高。

2.5 褪黑素浸種對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗MDA含量和可溶性糖含量的影響

2.5.1 對(duì)MDA含量的影響

MDA含量是反映細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)。如圖2A所示,在CK、MT、S和MS處理下,棉花幼苗葉片MDA含量分別為14.75 nmol·g、8.64 nmol·g、26.95 nmol·g和14.75 nmol·g。MT處理和CK處理間無(wú)顯著差異; 鹽脅迫條件下,MS處理比S處理葉片MDA含量顯著降低45.27%,表明褪黑素浸種能夠顯著降低鹽脅迫下棉花葉片MDA含量,減輕了膜脂過(guò)氧化對(duì)棉花幼苗葉片的損害。

如圖2B所示,CK、MT、S和MS處理下,棉花根系MDA含量分別是18.81 nmol·g、7.12 nmol·g、34.58 nmol·g和16.27 nmol·g。MT處理的棉苗根系MDA含量最低,比CK處理顯著降低62.15%; 鹽脅迫條件下,S和MS處理分別高于CK和MT處理,但MS比S處理根系MDA含量顯著降低52.95%,說(shuō)明褪黑素浸種能夠顯著降低正常條件和鹽脅迫下的棉花根系MDA含量,減緩了膜脂過(guò)氧化對(duì)棉花幼苗根系的傷害。

圖2 褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗葉片（A）和根系（B）中丙二醛（MDA）含量的影響Fig.2 Effects of melatonin on malondialdehyde (MDA) contents in leaves (A) and roots (B) of cotton seedlings under salt stress

2.5.2 對(duì)可溶性糖含量的影響

可溶性糖是逆境條件下具有滲透調(diào)節(jié)作用的重要物質(zhì)。CK、MT、S和MS處理下,棉花幼苗葉片可溶性糖含量分別為27.22 mg·g、37.35 mg·g、10.43 mg·g和14.33 mg·g(圖3A)。MT處理的葉片可溶性糖含量最高,比CK處理顯著提高37.21%; S和MS處理均低于CK和MT處理,MS比S處理葉片可溶性糖含量提高37.35%,表明褪黑素浸種能夠提高正常條件棉花葉片的可溶性糖含量,增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力; 但鹽脅迫下,這種作用不顯著。

CK、MT、S和MS處理下,棉花幼苗根系可溶性糖含量分別為4.46 mg·g、10.11 mg·g、1.58 mg·g和3.30 mg·g(圖3B)。正常條件下,MT處理的棉苗根系可溶性糖含量最高,比CK處理顯著提高126.58%; 鹽脅迫下,S和MS處理均顯著低于CK和MT處理,MS比S處理根系可溶性糖含量顯著提高108.15%,說(shuō)明褪黑素浸種能夠顯著提高正常條件和鹽脅迫環(huán)境下棉苗根系的可溶性糖含量,提高植物抗逆能力。

圖3 褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗葉片（A）和根系（B）中可溶性糖含量的影響Fig.3 Effect of melatonin on soluble sugar content in leaves(A) and roots (B) of cotton seedlings under salt stress

2.6 棉花幼苗形態(tài)及生理指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

為明確棉花幼苗形態(tài)及生理指標(biāo)之間的相關(guān)性,對(duì)19個(gè)代表性指標(biāo)進(jìn)行了Spearman分析(圖4),發(fā)現(xiàn)總干重(TDW)與株高(PHT)、主根長(zhǎng)(MRL)、總根長(zhǎng)(TRL)、根系平均直徑(TRD)、總側(cè)根數(shù)目(NLR)、葉片SOD活性(LSOD)、根系SOD活性(RSOD)、葉片POD活性(LPOD)、根系POD活性(RPOD)、葉片CAT活性(LCAT)、根系CAT活性(RCAT)、葉片APX活性(LAPX)、根系A(chǔ)PX活性(RAPX)和葉片可溶性糖含量(LSS)、根系可溶性糖含量(RSS)均呈顯著正相關(guān),而與葉片MDA含量(LMDA)、根系MDA含量(RMDA)呈顯著負(fù)相關(guān)。LSOD、RSOD、LPOD、RPOD、LCAT、RCAT、RAPX與LMDA和RMDA呈顯著負(fù)相關(guān)。LSOD、LPOD、LCAT、LAPX、RSOD、RPOD、RCAT和RAPX呈顯著正相關(guān)。表明棉苗株高升高、根系總根長(zhǎng)增加、主根長(zhǎng)增高、主根平均直徑增加、側(cè)根數(shù)目增加、抗氧化酶活性升高、可溶性糖含量增加、MDA含量減少,導(dǎo)致了棉苗生物量增加,反映了地上與地下部位具有形態(tài)與功能的一致性。

圖4 棉花幼苗19形態(tài)及生理指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between 19 morphological and physiological indexes of cotton seedlings

對(duì)19個(gè)代表性性狀進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn),RMDA、LMDA與TDW、PHT、TRD、MRL、TRL、NLR、LSOD、LPOD、LCAT、LAPX、RSOD、RPOD、RCAT、RAPX及LSS、RSS均分布于PCA橫軸上,但方向相反(圖5); MRD位于PCA縱軸上。將19個(gè)性狀歸成了兩個(gè)主成分,共解釋了19個(gè)性狀總變異的87.35%。其中總干重、株高、根系MDA含量、葉片MDA含量、根系平均直徑、主根長(zhǎng)、總根長(zhǎng)、總側(cè)根數(shù)目、葉片SOD活性、根系SOD活性、葉片POD活性、根系POD活性、葉片CAT活性、根系CAT活性、根系A(chǔ)PX活性、葉片可溶性糖含量對(duì)第一主成分貢獻(xiàn)較大,主根平均直徑對(duì)第二主成分貢獻(xiàn)較大。

圖5 棉花幼苗19形態(tài)及生理指標(biāo)的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of 19 morphological and physiological indexes of cotton seedlings

3 討論

3.1 外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗株高和生物量的調(diào)控效應(yīng)

根系是作物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中生理活性物質(zhì)同化和轉(zhuǎn)化的重要場(chǎng)所,因此,根系的生長(zhǎng)狀況和新陳代謝直接影響作物地上部分的發(fā)育、干物質(zhì)累積以及最終產(chǎn)量的形成; 反之,作物地上部生長(zhǎng)狀況和干物質(zhì)積累量亦能反映出作物根系的生長(zhǎng)狀況。鹽脅迫下植物發(fā)育遲緩,導(dǎo)致株高及干物重降低。棉花屬于較為耐鹽的經(jīng)濟(jì)作物,當(dāng)鹽濃度大于120 mmol·L時(shí),隨著鹽濃度的增加,棉花幼苗生物量呈顯著下降趨勢(shì)。外源褪黑素能夠緩解逆境脅迫造成的傷害,促進(jìn)棉花幼苗和向日葵(L.)幼苗的株高及干物質(zhì)重量。本研究發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫第15 d時(shí),棉花幼苗株高以及地上部、地下部干物質(zhì)相比于正常環(huán)境棉苗均呈現(xiàn)明顯下降,10 μmol·L褪黑素浸種處理顯著提高了鹽脅迫下棉花株高及地上、地下部干物質(zhì)重量,表明低濃度褪黑素浸種能夠減緩鹽脅迫對(duì)棉苗生長(zhǎng)發(fā)育的抑制,促進(jìn)棉苗生長(zhǎng)以及內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累,這與白燕丹和楊新元的研究結(jié)果一致。此外,本研究對(duì)棉花總干重和株高兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),總干重和株高呈顯著正相關(guān)(=0.95),說(shuō)明隨著棉苗株高升高,光合產(chǎn)物逐漸積累,其總干重會(huì)逐漸增加。

3.2 外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗根系形態(tài)的調(diào)控效應(yīng)

棉根屬直根系,由主根和側(cè)根組成。植物可通過(guò)改變根系形態(tài)(根長(zhǎng)、根面積、直徑、組織結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)型等)以適應(yīng)不同逆境環(huán)境。研究表明,較高濃度的NaCl處理可以通過(guò)增加植物根系總長(zhǎng)度、總吸收面積和根總體積促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)來(lái)適應(yīng)鹽脅迫; 而過(guò)高鹽濃度則通過(guò)降低根系總長(zhǎng)度、總吸收面積和根總體積抑制根系生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn),鹽(S)處理下棉花根系總根長(zhǎng)、總表面積、總體積、根系平均直徑相比于正常條件下顯著降低,這也表明150 mmol·LNaCl處理會(huì)通過(guò)降低‘國(guó)欣9號(hào)’棉花品種幼苗根系總根長(zhǎng)和總吸收面積抑制根系生長(zhǎng)。有研究認(rèn)為,褪黑素能夠調(diào)控逆境脅迫下根系的生長(zhǎng)發(fā)育。Zhang等研究發(fā)現(xiàn),外源施加褪黑素能夠提高黃瓜根系數(shù)量和根系直徑,以抵御逆境脅迫,但是褪黑素對(duì)于根長(zhǎng)作用效果并不顯著。馬旭輝等認(rèn)為,施加1 μmol·L褪黑素顯著提高了干旱條件下玉米(L.)幼苗的根長(zhǎng)、根表面積、根體積以及側(cè)根數(shù)目。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)褪黑素浸種處理后,低濃度(1 μmol·L、10 μmol·L、50 μmol·L)褪黑素處理下,棉花根系總根長(zhǎng)、總表面積、側(cè)根數(shù)目及主根平均直徑顯著增加,但高濃度褪黑素處理下對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)影響并不顯著; 且各指標(biāo)在10 μmol·L褪黑素處理下各項(xiàng)指標(biāo)均為最高。此外,我們還發(fā)現(xiàn),無(wú)論是在正常條件下還是鹽處理?xiàng)l件下,施加褪黑素均對(duì)棉苗側(cè)根數(shù)和主根直徑影響效果顯著,但對(duì)主根長(zhǎng)的促進(jìn)效果并不明顯,這說(shuō)明褪黑素可通過(guò)調(diào)節(jié)棉花側(cè)根發(fā)育以及主根直徑增粗來(lái)促進(jìn)根系生長(zhǎng),緩減鹽脅迫環(huán)境對(duì)棉苗根系生長(zhǎng)的抑制作用,提高棉苗根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力,這和Wang等的研究結(jié)果較為一致。

研究發(fā)現(xiàn),植物地上性狀與地下部分緊密相關(guān),彼此依賴,互為制約。本研究通過(guò)對(duì)棉花幼苗代表性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),棉花幼苗總干重、株高與總根長(zhǎng)、主根長(zhǎng)、根系平均直徑、總側(cè)根數(shù)目呈顯著正相關(guān),表明外源褪黑素可通過(guò)促進(jìn)棉苗側(cè)根發(fā)育和主根直徑增粗,促進(jìn)了根系發(fā)育,從而增加幼苗株高及干物質(zhì)積累。

3.3 外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下棉花幼苗抗氧化酶活性和可溶性糖含量的調(diào)控效應(yīng)

在植物的正常生理活動(dòng)中,ROS的產(chǎn)生和清除始終處于動(dòng)態(tài)平衡,因而植物可抵抗自身ROS產(chǎn)生的傷害,但在鹽漬環(huán)境下,它們能加速植物體內(nèi)活性氧的積累,破壞了植物ROS清除的動(dòng)態(tài)平衡,致使體內(nèi)ROS大量累積,最終導(dǎo)致植物死亡。O—是活性氧的一種,是對(duì)生物產(chǎn)生氧化傷害的重要來(lái)源,而SOD能夠促進(jìn)O—發(fā)生歧化反應(yīng),生成HO和O,然后植物體內(nèi)的POD、CAT和APX能夠快速將HO分解為HO,即SOD、POD和CAT相互配合組成一個(gè)完整的活性氧清除系統(tǒng)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝終產(chǎn)物,可反映組織中自由基水平和自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化程度。可溶性糖是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),其含量的高低能夠影響植物的保水能力和抗逆能力。研究表明,當(dāng)土壤中NaCl含量在0.4%以下時(shí),棉葉SOD、POD和CAT活性隨含鹽量增加而逐漸提高,當(dāng)NaCl含量在0.4%以上時(shí),SOD、POD和CAT活性迅速下降; NaCl含量在0.3%以上時(shí),MDA含量隨土壤NaCl含量增加而增加。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)150 mmol·LNaCl處理15 d后,鹽處理的棉苗根與葉SOD、POD、CAT、APX活性及可溶性糖含量顯著低于對(duì)照,MDA含量則顯著高于對(duì)照,這可能是由于鹽脅迫時(shí)間較長(zhǎng),致使棉苗內(nèi)部NaCl含量大量積累,而導(dǎo)致抗氧化物酶活性低于正常環(huán)境下的棉苗,說(shuō)明鹽脅迫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致棉苗清除活性氧和自由基的能力減弱,降低棉苗保水能力。

研究發(fā)現(xiàn),褪黑素是一種有效的抗氧化劑,可通過(guò)清除ROS增強(qiáng)植物在脅迫環(huán)境中的抗逆性。崔桂賓研究發(fā)現(xiàn),外源施加褪黑素顯著提高PEG脅迫下小麥幼苗中抗氧化酶的累積,增強(qiáng)可溶性糖的合成。 Zhang等研究表明,NaCl脅迫下,褪黑素處理種子中SOD、POD和CAT活性較未處理顯著提高1.3～5.0倍。Ma等研究發(fā)現(xiàn),外源施加500 μmol·L褪黑素,木薯(Crantz)根中SOD、CAT和APX的活性顯著增高。本研究結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)褪黑素浸種處理后,鹽脅迫下棉苗SOD、POD、CAT活性以及可溶性糖含量比未經(jīng)褪黑素處理顯著升高,MDA含量則顯著降低。表明褪黑素浸種均提高了鹽脅迫下棉苗葉與根系的抗氧化酶活性,增加了可溶性糖含量積累,提升了鹽脅迫下棉苗清除ROS和自由基能力,減緩了鹽脅迫對(duì)棉苗產(chǎn)生的過(guò)氧化和滲透?jìng)Α?/p>

通過(guò)對(duì)棉花幼苗代表性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),棉花幼苗總干重、株高與根和葉的SOD、POD、CAT、APX活性及可溶性糖含量均呈顯著正相關(guān),而與根和葉中MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān),表明外源褪黑素可通過(guò)促進(jìn)棉苗抗氧化酶活性增加,抑制MDA含量增加,減輕鹽脅迫對(duì)幼苗的氧化損傷; 還可通過(guò)增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖含量,緩解鹽脅迫對(duì)棉花幼苗的滲透脅迫,促進(jìn)幼苗株高增加及干物質(zhì)積累,提高棉苗的耐鹽性,這與褪黑素減緩鹽脅迫對(duì)油菜幼苗生長(zhǎng)抑制的結(jié)果一致。

此外,我們還發(fā)現(xiàn),在不施加鹽條件下,褪黑素浸種處理后根中SOD、CAT、APX與葉中POD活性及可溶性糖含量均顯著高于對(duì)照,MDA含量則顯著低于對(duì)照,這說(shuō)明在正常條件下,施加褪黑素也會(huì)促進(jìn)棉苗根抗氧化酶活性的提高,抑制棉苗MDA含量的積累,褪黑素具有生長(zhǎng)素的作用,亦能調(diào)控植物的正常發(fā)育。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)所設(shè)的4個(gè)處理中,鹽脅迫處理下棉苗株高最低,根系最不發(fā)達(dá),干物重最少,抗氧化酶(SOD、POD、CAT、APX)活性及可溶性糖含量最低,而MDA含量最高; 10 μmol·L褪黑素浸種后,可提高鹽脅迫下棉苗株高及生物量,增加根系總根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)目、主根直徑,提高根與葉中的SOD、POD、CAT、APX活性,增加可溶性糖含量,降低MDA含量。此外,外源褪黑素還可促進(jìn)正常條件下棉花幼苗發(fā)育。對(duì)19個(gè)代表性指標(biāo)的Spearman相關(guān)分析結(jié)果表明,外源褪黑素可能是通過(guò)促進(jìn)棉苗側(cè)根發(fā)育和主根直徑增粗以及抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖含量增加,來(lái)減緩鹽脅迫對(duì)棉花幼苗產(chǎn)生的傷害,促進(jìn)株高及干物質(zhì)積累增加,提高棉苗的抗鹽性。