湖南油茶根際微生物的群落結(jié)構(gòu)特征

唐 煒，陳隆升，陳永忠，彭映赫，劉彩霞

（1.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.國家油茶工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

油茶是我國重要的木本食用油料樹種，油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對(duì)于我國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展、社會(huì)穩(wěn)定、生態(tài)文明建設(shè)均具有重要的戰(zhàn)略意義[1]。油茶廣泛分布于我國南方地區(qū)，栽培區(qū)域土壤較為貧瘠。截至2019年底，湖南省油茶種植面積144.65萬hm2，油茶籽產(chǎn)量109.9萬t，茶油產(chǎn)量26.3萬t，油茶產(chǎn)業(yè)年總產(chǎn)值471.6億元，在擴(kuò)大油茶林面積和提高產(chǎn)量、產(chǎn)值、科技水平等方面均取得了突出成效。但目前的茶油產(chǎn)量仍無法滿足我國的糧油自供需求，所以增加油茶茶果產(chǎn)量、提升茶油品質(zhì)、提高資源利用率等問題亟待解決[2]。

土壤是油茶生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)和支撐，而根際微生物是土壤中養(yǎng)分循環(huán)、能量轉(zhuǎn)化的最主要組成部分[3]。前人的研究結(jié)果表明，土壤環(huán)境是調(diào)控?cái)M南芥、楊樹等林木根際微生物組結(jié)構(gòu)的重要因子；Bonito等[4]對(duì)楊樹、櫟樹和松樹在3種土壤環(huán)境中的根際細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行分析，指出土壤性質(zhì)對(duì)根際真菌群落組成的影響較大，宿主類型對(duì)根際細(xì)菌群落組成的影響較大。土壤pH、水分含量、碳氮含量比值、營養(yǎng)元素含量及土壤肥力等被認(rèn)為是影響根際微生物組構(gòu)建的重要因素[5-6]，地理位置在決定根際微生物的組成中也發(fā)揮著重要作用。Coleman-Derr等[7]研究了在墨西哥和美國的7個(gè)地區(qū)龍舌蘭根際細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)地理位置差異顯著影響龍舌蘭根際細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)，且真菌受到的影響更大，這可能是真菌的地方擴(kuò)散限制性造成的。通過比較美國不同氣候區(qū)域5座城市的玉米根際微生物組，Peiffer等[8]發(fā)現(xiàn)美國東北部不同城市的玉米根際微生物群落組成較為相似，中西部不同城市的群落組成差異較大，這說明不能根據(jù)地理位置距離來充分解釋根際微生物組的形成機(jī)制。植物類型也影響了根際微生物群落的構(gòu)建[8-10]。Costa等[11]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在不同土壤環(huán)境中，草莓的根際菌Actinobacteria組成相似，說明相較于土壤性質(zhì)，植物種類在根際微生物組的形成中起著決定作用。Edwards等[12]指出，在控制條件下水稻根際微生物組的構(gòu)建受土壤類型和宿主植物基因型的共同調(diào)控。Uroz等[13]研究了歐洲櫸木和挪威云杉根際細(xì)菌、真菌和古菌菌群的構(gòu)建，結(jié)果表明，樹木品種對(duì)真菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)影響較大，對(duì)細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)影響較小。在根際微生物群落的構(gòu)建中究竟哪個(gè)因素起決定性作用尚未有一致的結(jié)論。

本研究中以油茶為研究對(duì)象，探究其根際微生物群落的特異性，研究不同立地條件、不同良種、不同撫育管理措施條件下油茶根際土壤微生物物種組成、群落結(jié)構(gòu)及多樣性的差異，解析油茶土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征，以期為油茶林的地力調(diào)控、精準(zhǔn)施肥提供參考，為油茶的提質(zhì)增效提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地分別位于長(zhǎng)沙市路口鎮(zhèn)林場(chǎng)、長(zhǎng)沙市天際嶺林場(chǎng)和邵陽縣七里山場(chǎng)。長(zhǎng)沙市路口鎮(zhèn)林場(chǎng)（113°11′E，28°22′N）屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，年平均氣溫16.8～17.2 ℃，年平均無霜期275 d，年平均降水量1 361.6 mm，土壤為紅壤，成土母巖為泥質(zhì)板巖和第四紀(jì)紅土。長(zhǎng)沙市天際嶺林場(chǎng)（113°02′E，28°06′N）屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，年平均氣溫16～18 ℃，年平均相對(duì)濕度約為80%，年平均降水量1 200～1 700 mm，為低丘崗地地貌，土壤為第四紀(jì)紅色粘土網(wǎng)紋層母質(zhì)發(fā)育的酸性紅壤。邵陽縣七里山場(chǎng)（111°35′E，27°08′N）屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，年平均氣溫16.9 ℃，無霜期平均為286.4 d，年平均降水量1 300.5 mm，土壤為紅壤。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在3個(gè)林場(chǎng)試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)選取2009年栽培的XL1號(hào)油茶林，研究不同栽培區(qū)域油茶根際微生物的群落結(jié)構(gòu)；在長(zhǎng)沙市路口鎮(zhèn)林場(chǎng)選取2009年栽培的XL1、XL16、XL64和XL210共4個(gè)良種油茶林，研究不同油茶無性系根際微生物的群落結(jié)構(gòu)特征；選擇邵陽縣七里山場(chǎng)撫育油茶林和未撫育管理的油茶林，比較其根際微生物群落結(jié)構(gòu)特征。

每個(gè)試驗(yàn)區(qū)域選取20 m×40 m的樣地，分別設(shè)置3個(gè)10 m×10 m的小樣方。2018年5月，在每個(gè)樣方（10 m×10 m）中，采集根系抖落土的混合土樣，將其儲(chǔ)存在-20 ℃的便攜式冰箱中。土壤樣品運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后過篩（2 mm），篩除植物組織、根和巖石等，提取DNA樣品并保存于-80 ℃冰箱中，剩下的土壤在陰涼處風(fēng)干，用于進(jìn)一步的化學(xué)分析。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

土壤pH采用電極法測(cè)定[14]；土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化分光光度法測(cè)定[15]；土壤全氮含量采用凱氏定氮法測(cè)定[16]；土壤全磷含量采用微波消解并使用全自動(dòng)化學(xué)分析儀Smartchem 200進(jìn)行測(cè)定[17-18]；土壤全鉀含量使用微波消解-分光光度法測(cè)定[19]；土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量采用分光光度法測(cè)定[20-21]；土壤速效磷含量使用Mehlich 3浸提全自動(dòng)化學(xué)分析儀測(cè)定[22]；土壤速效鉀含量使用Mehlich 3浸提火焰分光光度計(jì)法測(cè)定[23]。土壤總DNA使用Powersoil DNA分離試劑盒（MoBio，Carlsbad，CA，USA）進(jìn)行分離純化，根際微生物多樣性采用Miseq平臺(tái)高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Flash和Trimmomatic軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量過濾和優(yōu)質(zhì)序列拼接，得到有效數(shù)據(jù)，采用RDP Classifier算法對(duì)操作分類單元（OTU）中代表序列進(jìn)行比對(duì)分析，并在各水平注釋其群落的物種信息[24]。使用QIIME軟件計(jì)算樣品的α多樣性指數(shù)（Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）；使用QIIME軟件計(jì)算β多樣性距離矩陣。使用R語言vegan軟件包對(duì)環(huán)境因子和土壤菌群群落相對(duì)豐度關(guān)系進(jìn)行冗余分析（RAD），并采用LDA Effect Size（LEfSe）分析方法找到組間在豐度上有顯著差異的物種[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 各栽培區(qū)域油茶根際微生物群落結(jié)構(gòu)特征

2.1.1 各栽培區(qū)域油茶根際土壤的養(yǎng)分特征

3個(gè)栽培區(qū)域均位于湖南省內(nèi)，雖然氣候條件相似，但其土壤養(yǎng)分條件存在顯著差異（表1）。路口鎮(zhèn)油茶林地土壤pH為5.067，有機(jī)質(zhì)、全氮、硝態(tài)氮及速效磷的含量顯著高于其他樣地。

表1 各栽培區(qū)域油茶根際土壤的養(yǎng)分特征?Table 1 Nutrients characteristics of C.oleifera rhizosphere in each cultivation area

2.1.2 各栽培區(qū)域油茶根際微生物群落的多樣性指數(shù)

各栽培區(qū)域油茶根際微生物群落的多樣性指數(shù)如圖1所示。由圖1可以看出，長(zhǎng)沙市路口鎮(zhèn)林場(chǎng)油茶林地土壤細(xì)菌的豐富度和均勻度均最高，但真菌的豐富度和均勻度最低；邵陽縣七里山場(chǎng)油茶林地土壤真菌的豐富度和均勻度顯著高于其他樣地。

圖1 各栽培區(qū)域油茶根際微生物群落的多樣性指數(shù)Fig.1 The Diversity indexes of rhizosphere microbial communities of C.oleifera in each cultivation area

2.1.3 各栽培區(qū)域油茶根際微生物群落的結(jié)構(gòu)

不同地理環(huán)境下油茶根際微生物群落的結(jié)構(gòu)存在顯著差異，除了共有的優(yōu)勢(shì)菌門外，邵陽縣七里山場(chǎng)油茶根際土壤中AD3菌門占比較高。各樣地中共有細(xì)菌OTU數(shù)量為289個(gè)，其中85.12%屬于變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和放線菌門；共有的真菌OTU數(shù)量為89，其中74.10%屬于子囊菌門。共有細(xì)菌菌群中占比排在前20位的菌群有變形菌門的α變形菌綱紅螺菌目Rhodospirillales、黃單胞菌目Xanthomonadales、黃色桿菌科Xanthobacteraceae、醋桿菌科Acetobacteraceae、慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium、不動(dòng)桿菌屬Acidibacter、 根霉菌屬Rhizomicrobium、 鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、伯克霍爾德氏菌屬Burkholderia、Reyranella屬、纖維堆囊菌屬Sorangium，綠彎菌門的JG37-AG-4菌綱、纖線桿菌目Ktedonobacterales，酸桿菌門的Subgroup_1和Subgroup_2菌綱、酸桿菌Subgroup_1菌科Acidobacteriaceae，放線菌門的蓋勒氏菌目Gaiellales，擬桿菌門的鹽堿厭氧菌目Halanaerobiales、熱酸菌屬Acidothermus，芽單胞菌門的芽單胞菌科Gemmatimonadaceae。共有且在真菌菌群中占比排在前10位的菌群為子囊菌門的古根菌Archaeorhizomycessp.、藤黃鐮刀菌Fusarium guttiforme、織球殼菌Plectosphaerella cucumerina、Penicillium terrigenum、Coniosporiumsp.、黑酵母菌Herpotrichiellaceaesp.、無絨毛青霉菌Penicillium laeve、杜鵑花類菌根真菌Oidiodendron maius、淡紫擬青霉Purpureocillium lilacinum，擔(dān)子菌門的糙孢菌Trechispora_sp.。

2.1.4 各栽培區(qū)域土壤因子對(duì)油茶根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

各栽培區(qū)域土壤因子對(duì)油茶林土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的冗余分析結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，3個(gè)地理區(qū)域內(nèi)油茶根際土壤中微生物群落的分布存在顯著差異，其中土壤中銨態(tài)氮和全鉀含量對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最為顯著，全氮和速效磷含量對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響最為顯著。

圖2 各栽培區(qū)域土壤因子對(duì)油茶根際微生物群落結(jié)構(gòu)影響的冗余分析（RAD）結(jié)果Fig.2 Redundancy analysis (RAD) result of the effect of soil factors on C.oleifera rhizosphere bacterial community structure in each cultivation area

2.2 同一栽培區(qū)域各油茶良種根際微生物群落結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 同一栽培區(qū)域各油茶良種根際微生物群落的多樣性指數(shù)

長(zhǎng)沙市路口鎮(zhèn)林場(chǎng)各油茶良種根際微生物群落的多樣性指數(shù)如圖3所示。由圖3可以看出，同一栽培區(qū)域不同油茶良種根際微生物的群落均勻度存在顯著差異，細(xì)菌群落的豐富度差異顯著，但真菌群落豐富度差異不顯著。XL1根際土壤中細(xì)菌OTU總量、細(xì)菌群落物種豐富度及均勻度均最高，XL64根際土壤中真菌OTU總量、真菌群落物種豐富度及均勻度指數(shù)最高。

圖3 長(zhǎng)沙市路口鎮(zhèn)林場(chǎng)各油茶良種根際微生物群落的多樣性指數(shù)Fig.3 Diversity indexes of rhizosphere microbial community of different C.oleifera varieties in Lukou town forest farm of Changsha City

2.2.2 同一栽培區(qū)域各油茶良種根際微生物群落的結(jié)構(gòu)

在同一栽培區(qū)域所有油茶良種根際微生物群落中，共有的細(xì)菌OTU比例為39.2%，共有的真菌OTU比例為46.1%。長(zhǎng)沙市路口鎮(zhèn)林場(chǎng)各油茶良種根際細(xì)菌群落門水平的結(jié)構(gòu)如圖4所示。由圖4可以看出，構(gòu)成不同油茶良種根際細(xì)菌群落占比排在前10位的菌門相同，優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門Proteobacteria、酸桿菌門Acidobacteria和綠彎菌門Chloroflexi，群落結(jié)構(gòu)中除優(yōu)勢(shì)菌門占比略有差異外，其他主要菌門的占比差異不顯著。構(gòu)成不同良種油茶林根際真菌群落的優(yōu)勢(shì)真菌均為子囊菌門Ascomycotap，且子囊菌門Ascomycotap和擔(dān)子菌門Basidiomycotap的總和均占真菌群落總量的95%以上。

圖4 長(zhǎng)沙市路口鎮(zhèn)林場(chǎng)各油茶良種根際細(xì)菌群落門水平的結(jié)構(gòu)Fig.4 Community structure of rhizosphere bacterial phylum of different C.oleifera varieties in Lukou town forest farm of Changsha City

2.3 同一栽培區(qū)域不同撫育管理?xiàng)l件下油茶根際微生物群落結(jié)構(gòu)特征

同一栽培區(qū)域的撫育人工油茶林與未撫育油茶林樣地的根際細(xì)菌、真菌的OTU總量均無顯著差異，但多樣性指數(shù)存在顯著差異。未撫育油茶林根際細(xì)菌和真菌群落的菌種豐富度指數(shù)較高，但撫育人工油茶林根際的真菌群落均勻度指數(shù)較高。邵陽縣七里山場(chǎng)不同撫育管理?xiàng)l件下油茶根際微生物群落門水平的結(jié)構(gòu)如圖5所示。由圖5可以看出，撫育人工林根際土壤中綠彎菌門為細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群，占比約為55.72%，子囊菌門為真菌優(yōu)勢(shì)菌門，占比為57.77%。未撫育油茶林根際土壤中，酸桿菌門為細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群，占比為35.81%，子囊菌門為真菌優(yōu)勢(shì)菌門，占比為48.86%。除優(yōu)勢(shì)菌群外，撫育人工油茶林與未撫育油茶林樣地的根際細(xì)菌群落中疣微菌門Verrucomicrobia差異最為顯著，在未撫育油茶林根際中占比顯著高于撫育人工油茶林。

圖5 邵陽縣七里山場(chǎng)不同撫育管理?xiàng)l件下油茶根際微生物群落門水平的結(jié)構(gòu)Fig.5 Rhizosphere community structure in phylum level under different tending management measures in Qilishan farm of Shaoyang County

2.4 油茶根際共有微生物群落的結(jié)構(gòu)特征

雖然立地條件、油茶良種以及撫育管理措施均對(duì)油茶根際微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，但在各種影響因素下油茶根際仍存在共有微生物群落。采用spearman檢驗(yàn)方法，選取所有樣本絕對(duì)豐度排在前20位的共有細(xì)菌OTU與門水平注釋結(jié)果相互關(guān)聯(lián)，結(jié)果如圖6所示。圖6中圓點(diǎn)的大小代表OTU豐度，線的粗細(xì)代表相關(guān)性。

由圖6可以看出，油茶根際共有的主要細(xì)菌菌群包含6個(gè)酸桿菌門Acidobacteria酸桿菌科的第1亞 群Acidobacteriaceae Subgroup 1（OTU8、OTU10、OTU14、OTU35、OTU53、OTU98），3個(gè)酸桿菌門的第2亞綱Acidobacteria Subgroup 2（OTU1、OTU5、OTU9），1個(gè)酸桿菌門索利氏菌科solibacteraceae的Candidatussolibacter屬（OTU41），5個(gè)綠彎菌門Chloroflexi的JG37-AG-4綱（OTU7、OTU12、OTU13、OTU3、OTU2788），1個(gè)綠彎菌門纖線桿菌目Ktedonobacterales的HSB_OF53-F07科（OTU16），1個(gè)變形菌門Proteobacteria的黃色桿菌科Xanthobacteraceae（OTU37），1個(gè) 變形菌門Xanthomonadales_Incertae_Sedis科的不動(dòng)桿菌屬Acidibacter（OTU18），1個(gè)變形菌門慢生型大豆根瘤菌Bradyrhizobium（OTU6），1個(gè)放線菌門的酸熱菌科Acidothermaceae的酸熱菌屬Acidothermus（OTU45）。油茶根際真菌群落中子囊菌屬Archaeorhizomyces的豐度值顯著高于其他菌群，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，革菌科下革菌Thelephora-Tomentella（OTU11）與其他10個(gè)菌群均存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，為主要的伴生、促生菌群。

圖6 油茶根際微生物群落的共線網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Bacterial community structure co-occurrence network

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，不同栽培區(qū)域的油茶根際土壤養(yǎng)分特征和微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異。土壤中銨態(tài)氮含量和全鉀含量對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最為顯著，這可能是不同栽培區(qū)域的油茶根際微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異的主要原因。金章利等[26]在山地草地的土壤研究中發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落多樣性與土壤養(yǎng)分含量呈正相關(guān)。大量研究結(jié)果表明，土壤中養(yǎng)分的高度可利用性是造成土壤微生物生物量增加的主要因素[27-28]。但本研究中所選擇的栽培區(qū)域較少，為了探明不同栽培區(qū)域油茶根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，后續(xù)將對(duì)湖南省內(nèi)具有代表性的栽培區(qū)域開展持續(xù)性調(diào)查研究。

XL1號(hào)等4個(gè)油茶主栽品種栽培10年后油茶林根際細(xì)菌群落豐富度的差異較為顯著，但真菌群落豐富度差異不顯著。Nicole等[29]采用基因芯片技術(shù)分析了3個(gè)馬鈴薯品種的根際微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)4%～9%的OTU相對(duì)豐度變化與植物宿主品種相關(guān)，其中，鏈霉菌科Streptomycetaceae表現(xiàn)出強(qiáng)烈的宿主相關(guān)性。Peiffer等[8]的研究結(jié)果表明，27種攜帶不同母本基因的玉米根際具有不同的微生物群落結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)基因土豆Solanum tuberosum和水稻Oryza sativa具有與母本植物不同的根圈微生物群落結(jié)構(gòu)[30-32]。本研究結(jié)果表明，在未進(jìn)行撫育管理的油茶林中，油茶根際細(xì)菌和真菌的菌種豐富度指數(shù)均較高，且除優(yōu)勢(shì)菌群外，疣微菌門Verrucomicrobia群落差異最為顯著。未撫育管理的油茶林中雖然土壤養(yǎng)分含量較低，但因?yàn)橛筒枭L(zhǎng)周期長(zhǎng)且林分無人為擾動(dòng)，微生物的群落結(jié)構(gòu)相對(duì)豐富，寡營養(yǎng)型細(xì)菌生長(zhǎng)良好。疣微菌門是一種寡營養(yǎng)型細(xì)菌，具有固氮作用和反硝化作用，在油茶的氮循環(huán)中起重要作用[32]。

植物對(duì)土壤微生物群落和功能有極為重要的生物化學(xué)影響。植物在整個(gè)生命周期（生長(zhǎng)期和凋亡期）不斷向其立地土壤輸入植物源有機(jī)物（根際沉積和凋落物），為土壤微生物提供了豐富的碳源和營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)土壤微生物群落組成和功能產(chǎn)生巨大影響，這也是根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能具有植物群落特異性假設(shè)的基礎(chǔ)[33-36]。本研究結(jié)果表明油茶存在特異性的根際微生物群落，其主要組成為酸桿菌門的酸桿菌科、索利氏菌科Candidatussolibacter屬等，綠彎菌門的JG37-AG-4綱、纖線桿菌目等，變形菌門的黃色桿菌科、不動(dòng)桿菌屬、慢生型大豆根瘤菌等，放線菌門的酸熱菌屬等，子囊菌門的子囊菌屬，擔(dān)子菌門的革菌科下革菌等。根據(jù)基于微生物絕對(duì)豐度提出的植物根際微生物群落“擴(kuò)增-選擇”組裝的新模型[37]，認(rèn)為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門是根際富集的主要菌群，酸桿菌門是根際排斥的主要菌群，放線菌門、γ-變形菌門及Δ-變形菌門從根際土進(jìn)入根內(nèi)的比例最大。在后續(xù)研究中將進(jìn)一步驗(yàn)證酸桿菌門由于相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度引起的根系富集或排斥的結(jié)論。革菌科下革菌為重要的植物外生菌根真菌，油茶的菌根真菌以外生菌根為主，所以后續(xù)的菌肥研究中將注重革菌科下革菌的分離、培養(yǎng)及應(yīng)用等。