農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

殷 敏

（寧夏葡萄酒與防沙治沙職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750001）

水稻是重要的糧食作物，其產(chǎn)量對保障我國糧食安全具有重要意義。利用植物基因工程技術(shù)將抗逆、豐產(chǎn)基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[1-4]轉(zhuǎn)化水稻可以提高水稻的抗逆性、產(chǎn)量。目前，對于水稻材料，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)很成熟，但是寧夏回族自治區(qū)選育出來的水稻品種在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方面明顯滯后，報道較少。為此，首先建立寧夏回族自治區(qū)水稻高頻再生體系，培養(yǎng)出高品質(zhì)的水稻愈傷組織，然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，建立水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系，為通過基因工程技術(shù)提高寧夏回族自治區(qū)水稻抗逆性、產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

水稻材料為寧粳23號、寧粳25號、寧粳27號、寧粳29號、寧粳33號、寧粳35號、寧粳38號、寧粳40號、寧粳花89號。

農(nóng)桿菌菌株為EHA105（已經(jīng)將含有卡那霉素、羧芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)該農(nóng)桿菌菌株），由寧夏葡萄酒與防沙治沙職業(yè)技術(shù)學(xué)院保存。

培養(yǎng)基為YEP培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基[5-6]。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷組織的培養(yǎng)挑選籽粒飽滿的水稻種子，剝?nèi)シf殼，去掉發(fā)黑的種子，選取干凈完整的種子浸泡在75%乙醇溶液中4~6 min進(jìn)行殺菌消毒，然后用0.1%氯化汞消毒15 min（可在搖床上進(jìn)行），最后用無菌水沖洗3~4次。將沖洗干凈的種子放在無菌濾紙上，待水分被吸干，分別置于含有不同質(zhì)量濃度脫落酸（ABA，0、1 mg/L）的MS培養(yǎng)基（MS+ABA培養(yǎng)基）中，然后分別在光照、黑暗條件下培養(yǎng)12~15 d，確定最佳培養(yǎng)條件。在最佳培養(yǎng)條件下，按照上述步驟操作然后將種子置于含有不同質(zhì)量濃度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D，0、1、2、3、4、5 mg/L）的MS+ABA培養(yǎng)基中培養(yǎng)12~15 d，誘導(dǎo)形成愈傷組織，挑取優(yōu)質(zhì)愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2.2 農(nóng)桿菌菌液的培養(yǎng)先將農(nóng)桿菌菌株用pH值7.2～7.4的YEP培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后蘸取少量該菌液在YEP固體培養(yǎng)基 （含80 mg/L 卡那霉素）上接種劃線，用封口膜密封培養(yǎng)皿放置在27 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)40～46 h，至長出半徑約0.6 mm的單菌落。從培養(yǎng)成熟的單菌落平板上挑取單個菌落接種于10 mL含80 mg/L 卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中，置于220 r/min的27 ℃搖床上振蕩培養(yǎng)約16 h，至OD600約為0.5。然后將此菌液轉(zhuǎn)接于100 mL含有80 mg/L 卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中，在27 ℃、220 r/min恒溫?fù)u床上繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6～7 h,至OD600約為0.5。最后將此菌液倒入高壓滅菌的離心管中以3 000 r/min 離心20 min, 將上清液倒掉后加入含有90μmol/L乙酰丁香酮、pH值5.5的MS液體培養(yǎng)基。

1.2.3 農(nóng)桿菌侵染愈傷組織并與愈傷組織共培養(yǎng)在超凈工作臺上，取出繼代12 d的胚性愈傷組織，放入已滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入已培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液，并不斷搖動，使愈傷組織與農(nóng)桿菌充分接觸，浸泡15 min。然后將愈傷組織取出，用無菌濾紙吸干愈傷組織表面水分。最后將愈傷組織接入覆蓋有1層無菌濾紙的固體共培養(yǎng)基（MS+2 mg/L 2，4–D+0.6 g/L水解酪蛋白+0.6 g/L L-脯氨酸+25 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂，pH值5.5）中，分別于27 ℃暗培養(yǎng)1、2、3、4、5 d。

1.2.4 抗性愈傷組織的篩選及轉(zhuǎn)基因植株的獲得將共培養(yǎng)后的愈傷組織分別置于含0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 mg/L羧芐青霉素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性篩選。然后置于分化培養(yǎng)基[5]中進(jìn)行分化培養(yǎng)。待綠芽發(fā)育成3 cm長的小苗后，將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基[5]中繼續(xù)培養(yǎng)，15~16 d后觀察綠苗的生根情況，待根系長到約2 cm，移栽到花盆于溫室中培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABA對水稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將不同水稻品種接種在含有ABA和不含有ABA的MS培養(yǎng)基上，篩選誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織最佳的水稻品種。結(jié)果表明，寧粳27號在加ABA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)出愈傷組織所用時間最短，愈傷組織長勢良好；其次是寧粳33號，用時較短，長勢也較好（表1）。因此，選擇寧粳27號和寧粳33號進(jìn)行后續(xù)試驗。

表1 ABA對水稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 光照與黑暗對水稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2可知，在培養(yǎng)13 d時，黑暗條件下愈傷組織的誘導(dǎo)率接近50%，遠(yuǎn)高于光照，并且黑暗條件下培養(yǎng)的愈傷組織色黃、質(zhì)密，狀態(tài)較好；而光照條件下培養(yǎng)的愈傷組織出現(xiàn)玻璃化、水性化。因此，黑暗條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)最佳。另外，寧粳27號愈傷組織誘導(dǎo)率高于寧粳33號，故后續(xù)試驗使用寧粳27號。

表2 光照與黑暗對水稻愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 %

2.3 不同質(zhì)量濃度2，4-D對水稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在添加不同質(zhì)量濃度2，4-D 的MS+1 mg/L ABA培養(yǎng)基上接種寧粳27號，發(fā)現(xiàn)當(dāng)2，4-D質(zhì)量濃度為3 mg/L時，愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，為33.72%（表3）。因此，2， 4-D 質(zhì)量濃度以3 mg/L最佳。

表3 不同質(zhì)量濃度2，4-D對水稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 共培養(yǎng)時間對水稻抗性愈傷組織成活率的影響

由表4可知，愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)1 d, 愈傷組織的污染率最低，獲得的抗性愈傷組織數(shù)占17 %；共培養(yǎng)3 d,獲得的抗性愈傷組織數(shù)最多，達(dá)21%；當(dāng)共培養(yǎng)時間超過3 d，愈傷組織的污染率迅猛增加，獲得的抗性愈傷組織數(shù)迅速減少；當(dāng)時間延長至5 d時，獲得的抗性愈傷組織數(shù)僅為1%。因此，愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時間以3 d最佳。

表4 共培養(yǎng)時間對水稻抗性愈傷組織成活率的影響

2.5 不同質(zhì)量濃度羧芐青霉素對抗性愈傷組織成活率的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)羧芐青霉素質(zhì)量濃度低于150 mg/ L時，農(nóng)桿菌的生長不會被抑制，水稻愈傷組織被農(nóng)桿菌污染；隨著羧芐青霉素質(zhì)量濃度降低，愈傷組織的污染率升高，最終導(dǎo)致愈傷組織全部被農(nóng)桿菌污染致死。當(dāng)羧芐青霉素質(zhì)量濃度高于150 mg/L時，隨著羧芐青霉素質(zhì)量濃度的升高，愈傷組織的生長受到抑制。當(dāng)羧芐青霉素質(zhì)量濃度為150 mg/L時，共培養(yǎng)后愈傷組織的成活率最高，為39%。因此，羧芐青霉素質(zhì)量濃度以150 mg/L最佳。

3 結(jié)論與討論

本研究對9個水稻品種的愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同水稻品種的愈傷組織誘導(dǎo)率不同，愈傷組織誘導(dǎo)率最高的水稻品種是寧粳27號。這可能與不同基因型水稻所含有的內(nèi)源激素種類和含量不同有關(guān)[3-4]。本研究探討了不同ABA質(zhì)量濃度（0、1 mg/L）、培養(yǎng)條件（光照、黑暗）、2，4-D質(zhì)量濃度（0、1、2、3、4、5 mg/L）、共培養(yǎng)時間（1、2、3、4、5 d）、羧芐青霉素質(zhì)量濃度（0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 mg/L）對寧夏回族自治區(qū)水稻愈傷組織誘導(dǎo)率、成活率的影響，以建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寧夏回族自治區(qū)水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明，最佳的ABA質(zhì)量濃度為1 mg/L，最佳的培養(yǎng)條件是黑暗培養(yǎng)，最佳的2，4-D質(zhì)量濃度為3 mg/L，最佳的共培養(yǎng)時間為3 d，最佳的羧芐青霉素質(zhì)量濃度為150 mg/L。在此條件下，愈傷組織誘導(dǎo)率高、抗性愈傷組織多、轉(zhuǎn)化植株成活率高。