全氟辛酸對小鼠卵母細胞的毒性影響

郭聰慧，李清華，丁林舒，黃建豪，黃曉剛，衛(wèi)恒習，張守全

(華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，廣東廣州510642)

全氟辛酸 (Perfuorooctanoic aid, PFOA)是一種耐光解、水解和生物降解的人工合成的全氟類化合物，因含有諸多碳氟鍵而具有極其穩(wěn)定的性質(zhì)，常被用作防油脂或防水劑以及衣服、家具和其他產(chǎn)品的保護性涂層，此外還可用作地板拋光劑、黏合劑、消防泡沫和電線絕緣等[1-3]。隨著PFOA的廣泛應用，在大氣、河流、土壤等環(huán)境介質(zhì)中均檢測出PFOA殘留：上海市41個室內(nèi)灰塵樣本中PFOA平均質(zhì)量分數(shù)為279.4 ng/g，長江流域重慶段地表水中PFOA的檢出率為100%，質(zhì)量濃度在1.16～49.87 ng/L之間，全國31個省(自治區(qū)、直轄市)土壤中PFOA 的平均質(zhì)量分數(shù)為0.35 ng/g[4-6]，人類和動物可通過飲食飲水等方式暴露于PFOA，且由于PFOA半衰期長，有生物累積效應，故能在體內(nèi)聚積，進而引發(fā)毒性，但不同物種、不同暴露年齡，引發(fā)毒性的濃度不同且差異較大[7]。研究發(fā)現(xiàn)，PFOA具有免疫毒性、發(fā)育毒性和內(nèi)分泌干擾毒性[8]。在雌性生殖系統(tǒng)中，PFOA暴露會抑制卵巢激素分泌，損害卵泡發(fā)育，導致卵巢功能喪失[9]。并且PFOA還可通過氧化應激和凋亡顯著抑制孕鼠黃體功能[10]。此外，新生大鼠注射PFOA可以減少生長卵泡和次級卵泡的數(shù)量[11]。雖然已有研究報道了PFOA暴露對生殖系統(tǒng)的影響，但關(guān)于PFOA對卵母細胞影響的研究依然很少。已知PFOA可以通過血卵屏障進入卵泡液[12]，本試驗通過給小鼠灌服PFOA模擬體內(nèi)暴露來探討其對小鼠卵母細胞成熟率及成熟質(zhì)量的影響。通過檢測活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平、紡錘體形態(tài)、細胞骨架來評估卵母細胞暴露于PFOA后的細胞變化。本研究將有助于揭示PFOA影響卵母細胞發(fā)育過程的毒理學機制，并引起人們對PFOA安全性的關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 6周齡體質(zhì)量相近的昆明雌性小鼠，購買于廣東省實驗動物中心。

1.1.2 試劑 PFOA(171468, Sigma)，ROS 檢測試劑盒 (S0033, Beyotime)，β-tubulin (T5293, Sigma)，內(nèi)磷酸化組蛋白H2A.X(Phospho-histone H2A.X，P-H2A.X，sc-51748, Santa Cruz)，F(xiàn)ITC 偶聯(lián)山羊抗鼠 IgG (A11029, LIFE)，Hoechst 33342 (H3570,LIFE)，孕馬血清促性腺激素(PMSG，寧波第二激素廠)，人絨毛膜促性腺激素(hCG，寧波第二激素廠)，透明質(zhì)酸酶(H3506，Sigma)

1.1.3 試劑配制 PFOA：超純水溶解，配制不同濃度的PFOA以使得最終基于小鼠體質(zhì)量的質(zhì)量分數(shù)為 0、5、10 和 20 mg/kg。

1.1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱，體視顯微鏡，熒光倒置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組 將160只6周齡的昆明小鼠隨機分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每個劑量組5個重復，每個重復8只小鼠。分籠后，先適應環(huán)境7 d，再進行藥物灌服試驗。飼養(yǎng)環(huán)境為 12 h 光照、12 h 黑暗交替，飲食飲水自由。

1.2.2 藥物灌服處理 適應環(huán)境 1 周后，以每天0、5、10、20 mg/kg 的劑量分別給對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠灌服PFOA，每次灌服0.2 mL，連續(xù)灌服 14 d。劑量及時間的選定參照PFOA相關(guān)的體內(nèi)試驗[13]。

1.2.3 卵母細胞的收集 小鼠連續(xù)灌服 PFOA 2 周后進行超排處理，每只小鼠注射10 IU PMSG，間隔48 h 后注射 10 IU hCG，再間隔 13.5 h 后頸部脫臼處死，用體積分數(shù)為75%的乙醇溶液浸泡30 s消毒，隨后解剖取出輸卵管，找到膨大部，在含有PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中用尖頭鑷撕開膨大部，用口吸管移出卵母細胞，放入預熱好的1 g/L的透明質(zhì)酸酶溶液中，處理2 min，待顆粒細胞脫掉以后將卵母細胞轉(zhuǎn)移至PBS緩沖液中洗3遍。收集同一劑量處理組的小鼠卵母細胞至少100個。

1.2.4 統(tǒng)計卵母細胞成熟率 卵母細胞排出第一極體視為成熟，取出卵母細胞后統(tǒng)計第一極體的排出率。

1.2.5 卵母細胞活性氧含量的檢測 每個劑量組隨機取 25～30 個卵母細胞放入含有 1 μmol/L DCFHDA的成熟培養(yǎng)液液滴中洗滌2～3遍，再放入37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱孵育20 min。而后用DPBS-PVA緩沖液洗3次，每次1 min。在熒光顯微鏡下用同一曝光參數(shù)觀察并拍照，應用ImageJ軟件分析平均熒光強度[14]。

1.2.6 卵母細胞免疫熒光染色分析 四孔板每個孔加入 200 μL 固定液，然后置于 37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱預熱30 min，每個劑量組隨機取25～30個卵母細胞置入四孔板中，于培養(yǎng)箱中固定30 min。然后將卵母細胞放入加有洗脫緩沖液的四孔板中于培養(yǎng)箱內(nèi)封閉2 h。再用β-tubulin(按照1∶1 000 的體積比稀釋)或 P-H2A.X(按照 1∶200 的體積比稀釋) 4 ℃條件下孵育過夜。次日用洗脫緩沖液洗滌3次，每次10 min。然后與FITC偶聯(lián)山羊抗鼠IgG(按照1∶100的體積比稀釋)在37 ℃條件下孵育1 h。之后，避光環(huán)境下用洗脫緩沖液洗滌 3 次，每次 10 min。用 Hoechst 33342 室溫下進行DNA染色5 min。最后，將卵母細胞固定在載玻片上，并在熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.3 統(tǒng)計分析

每組試驗重復5次，用SPSS 23.0進行單因素方差分析，采用LSD法進行多重比較分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準誤表示，作圖軟件為GraphPad 8。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌服PFOA抑制小鼠卵母細胞體外成熟

與對照組相比，每日灌服不同劑量(5、10和20 mg/kg)PFOA小鼠的卵母細胞成熟率有明顯下降(表1)。10和20 mg/kg劑量組小鼠的卵母細胞成熟率分別下降了14.28%和28.17%；5 mg/kg劑量組和對照組差異不顯著(P＞0.05)，10 mg/kg組和對照組差異顯著(P＜0.05)，20 mg/kg組和對照組差異極顯著 (P＜0.01)。5、10和 20 mg/kg 組別之間兩兩相比差異顯著(P＜0.05)。

表1 PFOA對小鼠卵母細胞成熟率的影響Table 1 Effect of PFOA on maturation of mouse oocytes

2.2 灌服PFOA誘發(fā)卵母細胞氧化應激

與對照組相比，每日灌服不同劑量PFOA小鼠的卵母細胞內(nèi)ROS含量有明顯升高(圖1)。10和20 mg/kg組中卵母細胞內(nèi)ROS含量分別升高了135%和177%；5 mg/kg組和對照組差異不顯著(P＞0.05)，10 和 20 mg/kg組與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，10 與 20 mg/kg組之間差異不顯著(P＞0.05)(圖2)。

圖1 不同劑量 PFOA暴露的卵母細胞內(nèi)活性氧(ROS)熒光圖像Fig. 1 Fluorescence images of reactive oxygen species(ROS) in oocytes exposed to different doses of PFOA

圖2 不同劑量 PFOA暴露的卵母細胞內(nèi)活性氧(ROS)熒光強度Fig. 2 The fluorescence intensities of reactive oxygen species (ROS) in oocytes exposed to different doses of PFOA

2.3 灌服PFOA誘發(fā)卵母細胞DNA損傷

每日灌服不同劑量PFOA的小鼠卵母細胞P-H2A.X免疫熒光結(jié)果顯示，細胞內(nèi)DNA損傷情況有明顯升高 (圖3)。其中，5、10 和 20 mg/kg 組P-H2A.X 比例分別比對照組升高了47%、133%和171%。5 mg/kg 組與對照組差異顯著 (P＜0.05)，10、20 mg/kg組與對照組相比差異極顯著(P＜0.01)，10 和 20 mg/kg組之間差異不顯著 (P＞0.05)(圖4)。

圖3 不同劑量PFOA暴露的卵母細胞內(nèi)P-H2A.X熒光圖像Fig. 3 Fluorescence images of P-H2A.X in oocytes exposed to different doses of PFOA

圖4 不同劑量PFOA暴露的卵母細胞DNA損傷比例Fig. 4 DNA damage rates of oocytes exposed to different doses of PFOA

2.4 灌服PFOA誘發(fā)卵母細胞骨架受損

每日灌服不同劑量PFOA的小鼠卵母細胞β-tubulin、Hoechst 33342 免疫熒光結(jié)果顯示，細胞內(nèi)紡錘體形態(tài)和染色體排列有明顯異常(圖5)，且與PFOA劑量呈正相關(guān)。與對照組相比，10和20 mg/kg組中卵母細胞β-tubulin形態(tài)異常，染色體非整齊排列的比例分別升高了65.06%和75.60%。5 mg/kg 組與對照組差異不顯著 (P＞0.05)，10、20 mg/kg組與對照組相比均差異顯著(P＜0.05)，10和 20 mg/kg組之間差異不顯著 (P＞0.05)(圖6)。

圖5 不同劑量PFOA暴露的卵母細胞骨架熒光圖像Fig. 5 Fluorescence images of cytoskeleton of oocytes exposed to different doses of PFOA

圖6 不同劑量PFOA暴露的卵母細胞骨架異常比例Fig. 6 The proportions of abnormal cytoskeleton in oocytes exposed to different doses of PFOA

3 討論與結(jié)論

近年來，人們對環(huán)境污染物的關(guān)注度越來越高。PFOA作為一種穩(wěn)定的有機化合物給工業(yè)和制造業(yè)帶來便利的同時也帶來了諸多“副作用”。PFOA在環(huán)境中持久存在，使得人類或動物很容易受到污染。飲食、飲水是人類暴露PFOA的主要途徑。本試驗通過給小鼠灌服PFOA模擬人類的暴露途徑，觀察PFOA對雌性哺乳動物的生殖毒性。結(jié)果證實了PFOA可通過氧化應激、DNA損傷和細胞骨架受損降低卵母細胞成熟率以及成熟質(zhì)量。

ROS是細胞代謝的天然副產(chǎn)物，對細胞信號轉(zhuǎn)導、穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)有著重要作用。當ROS的產(chǎn)生和中和不平衡時就會引起氧化應激。過量的ROS會導致脂質(zhì)過氧化、蛋白降解、DNA損傷等[15]。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境污染物和毒素往往會增加細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，最終誘導細胞內(nèi)氧化應激并發(fā)揮毒性[16]。已有研究表明PFOA可引起小鼠卵巢內(nèi)ROS升高，且呈劑量依賴性[15]。為了研究PFOA對卵母細胞發(fā)育能力的影響，我們檢測了細胞內(nèi)ROS水平，發(fā)現(xiàn)PFOA可顯著增加細胞內(nèi)ROS含量，誘導氧化應激，進而抑制卵母細胞發(fā)育，且劑量越高，氧化應激越強。

據(jù)報道，ROS相關(guān)氧化應激可誘導DNA損傷[17]。P-H2A.X被用作鑒定DNA損傷，在細胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂的數(shù)分鐘內(nèi)，H2AX的139位絲氨酸殘基被ATM、ATR、PRKC基因磷酸化形成P-H2A.X。因此，P-H2A.X的出現(xiàn)與DNA雙鏈斷裂緊密關(guān)聯(lián)，故其可作為DNA雙鏈斷裂的標志物[18]。已有研究報道毒性化學制劑可誘導細胞DNA損傷，如雙酚AF(Bisphenol AF)通過增加氧化應激和DNA損傷對小鼠卵母細胞體外成熟產(chǎn)生負面影響，對羥基苯甲酸丁酯(Butylparaben)通過DNA損傷抑制豬卵母細胞的體外成熟[19-20]。于是我們猜測，PFOA暴露會誘導卵母細胞DNA雙鏈斷裂。試驗結(jié)果也證實了我們的猜想，PFOA處理組的P-H2A.X陽性卵母細胞比例顯著高于對照組，提示PFOA暴露可通過誘導DNA雙鏈斷裂來抑制卵母細胞的成熟。

在減數(shù)分裂進程中，染色體的正確分離主要取決于染色體-微管的穩(wěn)定連接。紡錘體微管的形態(tài)異常引起染色體的錯誤分離，導致卵母細胞和進一步胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生異倍體和基因組的不穩(wěn)定現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)越來越多的環(huán)境毒素與紡錘體形態(tài)異常、染色體分裂錯誤有關(guān)。研究報道雙酚A替代物雙酚芴可引起卵母細胞骨架受損[21]；鄰苯二甲酸單酯能夠干擾減數(shù)分裂過程中染色體分離和配子形成[22]。本研究中，PFOA處理后的卵母細胞有很大比例出現(xiàn)紡錘體異常和染色體錯位。微管、肌動蛋白絲和染色質(zhì)相互作用完成染色體分離，建立細胞不對稱[23-24]。β-tublin在PFOA處理的卵母細胞中的異常定位是紡錘體缺陷的原因之一。紡錘體缺陷導致異常的染色體排列。因此，本文結(jié)果表明，PFOA暴露可通過誘導紡錘體缺陷和染色體排列異常進而抑制卵母細胞的成熟。這些發(fā)現(xiàn)有助于提高人們對PFOA生殖毒性的認識，為今后的研究提供參考依據(jù)。未來可以對PFOA損傷哺乳動物卵母細胞的分子機制做進一步研究。

綜上所述，本研究評估了PFOA體內(nèi)暴露對小鼠卵母細胞的影響，結(jié)果表明PFOA暴露會通過誘導ROS生成、DNA損傷、紡錘體形態(tài)發(fā)育缺陷、染色體排列異常等途徑影響卵母細胞成熟率及成熟質(zhì)量。