氮素改變辣椒初級代謝和薄壁組織厚度 調(diào)控比葉面積研究

引言

比葉面積（SLA）是一個與葉結(jié)構(gòu)相關(guān)的參數(shù)，通過測量單位干質(zhì)量的投影葉面積進行量化，并與基于質(zhì)量和面積的光合作用-氮關(guān)系的變化模式相 關(guān)[1]。SLA代表單位面積葉質(zhì)量（LMA）的倒數(shù)[2]， 且被認為是與在受控或自然環(huán)境下生長的一系列草本和木本物種的光合能力相關(guān)的重要生態(tài)指 標[3-6]。SLA[7-8]通過影響光捕獲和CO2與RuBisCO 酶羧基化位點的結(jié)合進而影響光合能力[9-11]。該參數(shù)的變化源自葉片密度和厚度的變化。此外，葉片厚度[12-13]和LMA[2]因環(huán)境（營養(yǎng)、水分、光照狀況等）和植物功能群的不同而不同，盡管LMA也可能獨立于葉片厚度而發(fā)生變化[12]。有趣的是，LMA與柵欄和海綿狀薄壁組織的厚度、上表皮表面和單位面積體積正相關(guān)，這進一步凸現(xiàn)了解剖結(jié)構(gòu)對于全面理解LMA的重要性。同樣，組織密度也會受到水分含量和細胞質(zhì)成分的影響[14-17]。

許多環(huán)境因素，如光強和光質(zhì)、UV-B光、CO2濃度、臭氧、土壤板結(jié)度、水分脅迫、溫度、鹽和養(yǎng)分有效性等，都會影響葉面積和葉質(zhì)量之間的比率，從而影響SLA[2,18]。大量研究表明不同物種在多種環(huán)境下的葉密度和厚度可分別解釋LMA差異的80%和20%[2]。在這種情況下，葉片特征的改變可歸因于自然選擇引起的種間差異，或環(huán)境條件下表型可塑性引起的種內(nèi)變異[19]。相應(yīng)的，那些能夠根據(jù)資源供應(yīng)而改變?nèi)~片形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)和生理代謝的物種具有生態(tài)優(yōu)勢[20]。因此，SLA被視為物種之間以及不同環(huán)境之間的可塑性參數(shù)[21]，從而SLA被廣泛用于解釋和理解不同物種生長模式的生態(tài)差異[2-4, 17, 22-23]。

一般來說，SLA與相對生長率（RGR）呈正相關(guān)，弱光下更明顯。然而關(guān)于養(yǎng)分有效性對SLA的影響尚不清楚[3,21]。例如，干旱地區(qū)生長速率最高的桉樹表現(xiàn)出較厚的葉組織，因為該地區(qū)沒有光限制，從而表現(xiàn)出葉片較密和較厚的物種具有較高的水分利用效率[24]。在另一項關(guān)于非木本植物的研究中，在最佳營養(yǎng)供應(yīng)和受控環(huán)境條件下種植時，種間RGR變異很大程度上受到SLA的影響[3]。在同一項研究中，自然條件下物種RGR和可用性氮之間的相關(guān)性分析表明，營養(yǎng)豐富環(huán)境中的自然選擇有利于SLA較高的物種，而營養(yǎng)貧乏環(huán)境中的自然選擇則相反[3]。因此認為，SLA與半干旱地區(qū)植物中的氮質(zhì)量呈正相關(guān)，但在干旱地區(qū)SLA和氮質(zhì)量無關(guān)，這表明SLA的科屬依賴性反應(yīng)可能對生態(tài)系統(tǒng)水平產(chǎn)生影響[23]。然而，這些在自然環(huán)境中進行的研究可能忽略了一個事實，即富氮環(huán)境可能與較高的植被覆蓋率相關(guān)，從而降低了光的可用性，因此光是一個干擾因素。

養(yǎng)分中，土壤和葉片中的氮含量被認為是調(diào)節(jié)葉片形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)的重要因素[18,23]。研究認為，隨著葉片氮含量的增加，不同物種有較高的SLA（或較低的LMA）[2,12,25-30]。除氮素外，輻照度以及氮素和光照的復(fù)合因素也會影響SLA[31-33]。令人驚訝的是，氮供應(yīng)對果實類植物，甚至是作物類植物的SLA影響仍未知。很少有在種內(nèi)水平和作物品種之間探討SLA的研究[8,26,30]。在這方面，我們之前已經(jīng)證實：（1）施氮對C.chinense辣椒的生長和產(chǎn)量有較大影響，（2）C.chinense辣椒商品種Biquinho和Habanero在坐果率和果實大小、源庫比和葉片形態(tài)方面存在顯著差異[34]。因此，基于氮供應(yīng)對C.chinense辣椒生長和果實產(chǎn)量的影響以及種內(nèi)差異，研究分析了氮供應(yīng)對SLA和相關(guān)性狀的影響。本研究驗證了在供氮和遮陰條件下兩種C.chinense辣椒通過不同的代謝和結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)SLA的假設(shè)。首先，將兩種基因型辣椒置于0～312.5 mg/dm3一系列氮素濃度下，研究了氮對SLA和初級代謝物的影響。其次，研究在解剖學(xué)水平上放大了氮效應(yīng)，并研究了氮與其他常見的對SLA、葉片厚度和密度有影響的因素的交互作用。

1 材料與方法

1.1 植株生長條件

品種Biquinho和Habanero（TopSeed?, Agristar do Brasil Ltd.）均為Capsicum chinense辣椒，其種子在商品基質(zhì)中發(fā)芽（Tropstrato?HT）；45 d后，將幼苗移植到裝有5 dm3黃-紅土壤的花盆中，以確保試驗結(jié)束時對根系發(fā)育沒有限制。盆土經(jīng)過篩選、混勻，并用CaCO3和MgCO3（摩爾比3.5∶1）調(diào)節(jié)至中性。之后，除氮外，土壤條件參照Novais 等[35]進行施肥，磷、鉀、硫、硼、銅、鐵、錳、鉬和鋅施肥總量分別為300、150、40、0.81、1.33、1.55、3.66、0.15和4.00 mg/dm3。由于土壤中的氮含量較低，NH4NO3以5 mg/dm3的濃度施入盆中，以確保移栽后植株的初始發(fā)育。為了避免土壤中的氮淋失，用塑料袋蓋住盆底。以NH4NO3為氮源的第一次施氮是在第一分枝出現(xiàn)時進行的，這與生殖分化相對應(yīng)。如前所述，該物候期是根據(jù)葉片和果實的生長速率及其對氮的需求來選擇的[36-37]。試驗過程中，每天供水，使土壤保持恒定的田間持水量。

為了評估氮劑量和遮陰對SLA的影響，連續(xù)兩年進行獨立試驗。第1個試驗中，從第一分枝出現(xiàn) 開 始，0、20、50、125和312.5 mg/dm3的 氮素，以溶液形式每20 d施于土壤中，總共5次等量補充[34]。第1個試驗是在溫室中進行的，室內(nèi)溫度為25℃ ± 5℃，平均輻照度為500 μmol/（m2·s）。植株花后（DAF）培養(yǎng)91 d。所有試驗分析均在2016年7月—10月進行，在此期間平均光周期為11.5 h/12.5 h（白晝/夜間）（來源：美國華盛頓特區(qū)美國海軍天文臺天文應(yīng)用部），平均輻照度為 1 300 kJ/m2（資料來源：巴西國家氣象研究所）。第2個試驗是為了分析氮供應(yīng)和光照強度對SLA的影響。植株生長于溫度為27℃ ± 5℃，平均輻照度為800 μmol/（m2·s）的溫室當(dāng)中。當(dāng)?shù)谝环种π纬蓵r，將一半的植株置于50%的遮陰下，而其他植株則保持在正常光強下。同時，每20 d施用20或125 mg/dm3的氮肥，以補充前述的4個等量[38]。試驗分析均在2017年2月—4月進行，期間平均光周期為12 h 11 min / 11 h 49 min（晝/夜）（來源：美國海軍天文臺天文應(yīng)用部），平均照度為1 390 kJ/m2（資料來源：巴西國家氣象研究所）。植株花后培養(yǎng)74 d。

1.2 代謝物分析和氮含量測定

兩個試驗均在花后59 d 和30 d分別采集完全展開的第三片葉（從頂點往下數(shù)），采集葉片在液氮中快速冷凍，并儲存在 - 80℃冰箱中等待后續(xù)研究分析。代謝物提取是先在液氮中研磨，然后稱量質(zhì)量，并用乙醇提取[39]。在乙醇提取物中，筆者測定了蔗糖、果糖、葡萄糖[40]、蘋果酸[41]、總氨基酸[39]、 NH4

+[42]、NO3-[43]和葉綠素a、b的含量[44]。淀粉和蛋白含量按Bradford[45]和Fernie等[40]所述，用乙醇不溶性部分測定?？偟縿t參考Kalra （1998）[46]的方法于每次試驗結(jié)束時采集葉片進行測定。

1.3 比葉面積、解剖特征和葉密度的測定

參考Cavate等[47]的方法，兩個試驗的SLA均使用葉盤測定。第1個試驗中，從花后88 d植株的成熟葉片上采集9個1.03 cm2的圓盤狀葉片。第2個試驗中，在花后10、30、50和70 d時采樣，每個處理分別采集6個圓盤狀葉片。研究所用結(jié)果為平均值，因為試驗發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移處理間沒有差異。此外，研究采用了第2種方法（Poorter和Remkes等[3]提出）測定SLA，即葉面積與其干質(zhì)量之比（m2/kg）。在該方法中，在花后72 d使用葉面積儀（Li 3100C Li Cor，Inc.，Lincoln，NE，USA）測量每處理植株的總?cè)~面積。之后，在80℃下對葉片進行烘干稱量質(zhì)量，然后計算SLA。值得注意的是，這兩種方法的結(jié)果相似（附表S1）。

花后70 d（第2個試驗）進行葉片解剖結(jié)構(gòu)分析。為此，采集第三分枝上處于中等光照強度的完全展開的健康葉片，在FAA50[48]中真空固定48 h，保存在70%乙醇中。根據(jù)使用說明，每處理隨機選擇3個樣品，使用乙醇進行梯度脫水，并用甲基丙烯酸乙二醇酯（徠卡?包埋試劑盒）包埋處理。在旋轉(zhuǎn)切片機（型號RM2155，美國伊利諾伊州迪爾菲爾德萊卡微系統(tǒng)公司）中制作8 μm厚的橫截面，用甲苯胺藍[49]染色10 min后，用水沖洗并在室溫下干燥。載玻片用合成樹脂固定（Permount，F(xiàn)isher），以 便 在 光 學(xué) 顯 微 鏡（AX70-Olympus）中進行觀察和記錄。利用Image Pro Plus軟件（MediaCybernetics）對顯微照片的葉片進行化學(xué)計量分析。因此，試驗對每處理的3株9個區(qū)域進行了全葉厚度、柵欄薄壁組織厚度、海綿薄壁組織厚度和細胞間隙百分比的測定。根據(jù)第2個試驗，根據(jù)以下方程式計算葉片密度：

葉片密度=圓盤狀葉干質(zhì)量/（圓盤狀葉面積×葉橫截面直徑）

根據(jù)第2個試驗的描述進行葉盤取樣，測定葉盤在已知面積內(nèi)的干質(zhì)量（打孔器面積為1.03 cm2）。上述圓盤葉來自于處于同一個體發(fā)育時期和生理階段的葉片，這些葉片均為完全展開、成熟、健康和活躍的葉片。根據(jù)葉片橫截面測量葉片寬度。

1.4 統(tǒng)計分析

第1個試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，變量為基因型和供氮量，共有5個重復(fù)。數(shù)據(jù)的正態(tài)性通過夏皮洛-威爾克法檢驗矯正，然后對所有變量進行雙因素方差分析。使用多重比較法進行基因型差異顯著性分析（P≤ 0.05），根據(jù)供氮量進行回歸模型參數(shù)調(diào)整。第2個試驗采用裂區(qū)設(shè)計[50]，3個變量：遮陰（光照和遮陰）為主處理，氮供應(yīng)（20或125 mg/dm3）為副處理，兩個基因型（Biquinho和Habanero）為子處理。每處理有6個生物學(xué)重復(fù)。通過夏皮洛-威爾克法檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性，然后進行三因素方差分析。采用F檢驗和多重比較法檢驗實現(xiàn)各因素差異顯著性的分析（P≤ 0.05）。對于特定葉面積，第1個試驗中每處理5株重復(fù)，第2個試驗每處理6株重復(fù)。葉片解剖和計量統(tǒng)計學(xué)分析每處理3個生物學(xué)重復(fù)。每株有3個組織學(xué)重復(fù)，因此每處理有9個切片。使用SigmaPlot v.11.0（美國加利福尼亞州圣何塞市Systat軟件公司）和R語言[51]（R核心團隊2019）軟件繪制圖表，并進行均值比較、回歸分析和皮爾遜相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 氮素供應(yīng)對SLA的影響

為了明確供氮量對辣椒（C.chinense）SLA的影響，本研究在5個氮劑量下，種植了在坐果率、果實大小、庫源比和葉片形態(tài)方面存在差異的兩個商品種（Biquinho和Habanero）[34]。每個品種以供氮量為變量調(diào)整回歸模型從而闡明SLA的變化（圖1a）。由圖1可知，不同處理下，兩品種的SLA均隨氮供應(yīng)的增加而下降。在20 mg/dm3和50 mg/dm3的氮素處理下，品種Biquinho的SLA高于品種Habanero（圖1a）。

在第2個試驗中，結(jié)合兩個輻照度水平（800和400 μmol/（m2·s），研究兩種基因型的辣椒在中度缺氮和充足氮（20和125 mg/dm3）條件下SLA的變化。由表1可知，光照、供氮和基因型對辣椒SLA有顯著的三重交互作用（P= 0.041）。因此，可以根據(jù)基因型，確定光照或氮供應(yīng)水平之間是否存在差異（圖1b）。兩種基因型葉片的SLA在遮陰條件下都有所增加，但只有Biquinho的SLA在供氮量變化時表現(xiàn)出顯著差異（圖1b）。值得注意的是，盡管第1次500 μmol/（m2·s）和第2次800 μmol/（m2·s）試驗的溫室輻照度不同，兩個品種在不同供氮量下的SLA表現(xiàn)出相似的變化（圖1）。

圖1 a．5個氮水平和500 μmol/（m2·s）處理下，花后88 d兩個辣椒品種的SLA； b.光照水平800和400 μmol/（m2·s）、氮供應(yīng)（20和125 mg/dm3）和基因型（Biquinho和Habanero）對SLA的三重影響

研究每株植物的總?cè)~面積除以單株葉片的總干質(zhì)量以便進一步明確SLA的變化。正如預(yù)期的那樣，該分析證實了遮陰可提高兩種辣椒的SLA。在光照和遮陰條件下，SLA的值由19.36 ± 0.75 m2/kg 變?yōu)?7.49 ± 0.88 m2/kg（表1和附表S2）。此外，由表1可知針對SLA，氮供應(yīng)和基因型存在互作（表1）。結(jié)果表明，在20 mg/dm3氮條件下，品種Biquinho葉片表現(xiàn)出較高的SLA，而Habanero的SLA未觀察到氮效應(yīng)（圖2a）。

2.2 供氮對不同基因型葉片和薄壁組織厚度影響的差異

接下來，研究決定評估氮供應(yīng)和輻照度水平對SLA相關(guān)參數(shù)的影響。遮陰對相關(guān)解剖性狀的影響是獨立于供氮或基因型之外的，而供氮效應(yīng)與基因型有關(guān)（表1）。Habanero的植株在20 mg/dm3的氮處理下表現(xiàn)出較厚的葉子，而Biquinho的葉片厚度沒有影響（圖2b）。但在125 mg/dm3的氮處理下，Biquinho表現(xiàn)出較厚的柵欄組織，而對Habanero的柵欄薄壁組織厚度沒有受到氮供應(yīng)的影響（圖2c，3）。相比之下，在20 mg/dm3的氮處理下，Habanero表現(xiàn)出更厚的海綿狀薄壁組織，而Biquinho的該組織厚度與氮供應(yīng)無關(guān)（圖2 d，3）。此外，在20 mg/dm3的氮處理下，Habanero比Biquinho的海綿狀薄壁組織更厚，而在125 mg/dm3的氮處理下兩個材料無明顯差別?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明Biquinho主要表現(xiàn)為柵欄薄壁組織的改變，而Habanero顯示了海綿狀薄壁組織的變化，以響應(yīng)不同的氮供應(yīng)（圖3）。

圖2 對氮供應(yīng)（20或125 mg/dm3）和C.chinense（Biquinho或Habanero）基因型交互作用下的（a）比葉面積（SLA）（花后74 d的總?cè)~面積與葉干質(zhì)量比）、（b）葉厚度、（C）柵欄和（D）海綿狀薄壁組織（平均值± SE）進行方差分析（表1）

圖3 花后70 d，遮陰和光照下，中度缺氮（20 mg/dm3）和氮充足（125 mg/dm3）時Biquinho和 Habanero兩個品種成熟葉片的橫截面

表1 利用三因素方差分析法以表明光照（光照和遮陰）、供氮（20或125 mg/dm3）、C.chinense基因型（Biquinho或Habanero）及其互作對成熟葉片的比葉面積、葉面厚度、柵欄和海綿狀薄壁組織的影響（第2個試驗）

在第2個試驗中，SLA分析是指開花后10 d、30 d、50 d、70 d（它們之間沒有差異）[47]和74 d[3]收獲的葉盤平均數(shù)表示，同時選用開花70 d的材料進行解剖特征和葉密度的測定。數(shù)據(jù)用F值表示，且通過P值進行顯著性分析。粗體數(shù)值表示數(shù)據(jù)通過F測驗在P≤ 0.05下的統(tǒng)計學(xué)意義。

aSLA的測定參照Cavate等[47]的方法。

bSLA的測定通過總?cè)~面積除以葉片的總干 質(zhì)量[3]。

此外，我們觀察到，遮陰對解剖特征的影響與氮供應(yīng)或基因型無關(guān)（附表S2）。與光下葉片厚度（217.7 ± 8.5 μm）相比，遮陰下兩個品種的葉片厚度較?。?91.6 ± 8.7 μm）（圖4a）。這與遮陰條件下較薄的柵欄和海綿狀薄壁組織的結(jié)論一致（圖4b，c）。遮陰和光照下柵欄薄壁組織的厚度分別為69.9 ± 2.6 μm和80.8 ± 4.8 μm（圖4b），海綿狀薄壁組織厚度分別為92.9 ± 6.4 μm和105.9 ±5.9 μm（圖4c）。

圖4 花后70 d，光照對兩種辣椒（Biquinho和Habanero）葉片的厚度（a）、柵欄組織厚度（b）和海綿組織厚度（c）的影響

與解剖特征相反，基因型對葉片密度沒有顯著影響（表1）。遮陰條件下Biquinho和Habanero的葉片密度較光照下的低（圖5）。隨著氮肥用量的增加，兩種辣椒均表現(xiàn)出較高的葉片密度（圖5）。

2.3 氮含量和氮代謝產(chǎn)物與SLA相關(guān)

為了確定氮供應(yīng)對碳氮相關(guān)的代謝物水平的影響，根據(jù)第1個試驗的氮供應(yīng)分析了初級代謝物的變化（附圖S1）。接下來，對SLA值、氮含量和碳氮相關(guān)代謝物之間進行皮爾遜相關(guān)分析（圖6）。皮爾遜相關(guān)分析是在兩個品種的代謝物、葉片性狀以及碳氮含量等與SLA正相關(guān)或負相關(guān)全部參數(shù)的基礎(chǔ)上進行的。氮含量與氮相關(guān)代謝物如氨基酸、蛋白質(zhì)、NH4t">+和NO3-之間呈正相關(guān)。另一方面，氮含量及氮相關(guān)代謝物含量都與SLA呈負相關(guān)（圖6）。相反，碳相關(guān)代謝物如淀粉、葡萄糖和蘋果酸的含量與SLA呈正相關(guān) （圖6）。

為了在第2個試驗中驗證初級代謝物對SLA的影響，利用之前對C.chinense[34]的研究獲得的數(shù)據(jù)，對不同光照及氮水平下對SLA和氮含量、氨基酸、蛋白質(zhì)和淀粉含量進行皮爾遜相關(guān)分析。在20～125 mg/dm3氮范圍內(nèi)，品種Biquinho的SLA隨著施氮量的增加（以及氮代謝產(chǎn)物）和柵欄薄壁組織厚度的增加而降低（圖2，7）。另一方面，在品種Habanero中觀察到的SLA微小變化，可能是為了響應(yīng)氮供應(yīng)增加，氮相關(guān)代謝物含量的輕微增加和葉片厚度（海綿狀薄壁組織）降低相互抵消后的結(jié)果。

3 討論

本次研究比較了在坐果率、果實大小和葉片形態(tài)上具有差異的兩個C.chinense種辣椒（Biquinho和Habanero），以便進一步了解氮、光強及其互作對果實類植物SLA的影響。我們之前的研究表明，辣椒植株葉片中的氮含量與施氮量成比例增加[34]。本研究表明，SLA與品種無關(guān)，各品種SLA均隨N劑量的增加而降低（圖1a）。為了更好地理解這一效應(yīng)，研究分析了不同光照水平以及在氮缺乏和充足情況下影響葉片密度、厚度及調(diào)節(jié)SLA因子[52]的性狀。遮陰條件下兩個品種的SLA均有所增加，且基因型和N劑量之間存在交互作用（圖1）。葉片密度隨著較高的細胞含量（如細胞內(nèi)含物、淀粉粒和晶體）和較高的細胞壁沉積[13,52]或更小的空氣空間體積而增加[2]。現(xiàn)有的研究中，在葉片橫截面上，柵欄薄壁組織比海綿薄壁組織顯示出更少的細胞間隙（圖3）。這兩個品種在葉片結(jié)構(gòu)參數(shù)（如柵欄和海綿狀薄壁組織）方面對氮肥的反應(yīng)不同（圖2）。Biquinho的柵欄薄壁組織厚度增加（圖2c），而Habanero的海綿薄壁組織減少（圖2d）。有趣的是，Habanero的葉片厚度減小，而Biquinho在較高氮劑量下卻保持穩(wěn)定（圖2b）。上述結(jié)果表明，這兩個品種具有明顯的葉肉細胞擴張，這可能會調(diào)節(jié)其SLA和葉片厚度，但保持穩(wěn)定的葉片密度（圖5）。

圖5 花后70 d，不同光照水平800和400 μmol/（m2·s）與N供應(yīng)（20和125 mg/dm3）水平下Biquinho和Habanero辣椒的葉片密度

考慮到葉密度與代謝產(chǎn)物的關(guān)系，所有非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（可溶性糖和淀粉）與蛋白質(zhì)的總和可能對葉生物量有相當(dāng)大的影響[2,53-55]。本研究中，所有初級代謝產(chǎn)物貢獻了葉片干質(zhì)量的9.5%～28.1%（附圖S1），以響應(yīng)氮供應(yīng)量的增加。與其他代謝物相比，氨基酸、蛋白質(zhì)和淀粉含量的變化幅度更大。氨基酸在干葉中的質(zhì)量為0.7%～17%，蛋白質(zhì)占干葉質(zhì)量的0.6%～3.8%，兩者均與氮含量正相關(guān)，與SLA負相關(guān)（圖6）。另一方面，淀粉（占干葉質(zhì)量的2.1%～10.3%）與氮含量負相關(guān)，與SLA正相關(guān)（圖6）。與之一致的是，前人的研究表明，缺氮會導(dǎo)致碳代謝改變，例如蘋果酸和其他有機酸水平降低，淀粉水平增加[56-57]。 總之，當(dāng)?shù)?yīng)增加時與氮代謝相關(guān)的代謝物的合成是一個重要特征，此特征也與葉片密度增加有關(guān)（圖5）。

圖6 5個氮水平下，Biquinho和Habanero兩個辣椒品種的SLA、葉特性、碳含量、氮含量及碳氮相關(guān)代謝物間的皮爾遜相關(guān)分析

Poorter等[2]認為在與氮代謝相關(guān)的細胞成分中，蛋白質(zhì)水平可能對SLA產(chǎn)生影響。蛋白質(zhì)含量的數(shù)量變化可能超過葉子中非結(jié)構(gòu)碳水化合物的變化[58]。本研究的結(jié)果表明氨基酸水平的變化也是決定SLA響應(yīng)氮供應(yīng)變化的重要因素（圖7和附圖S1）。某些氨基酸水平有利于調(diào)節(jié)硝酸鹽的吸收和氮同化[59-60]，同時也有助于滲透調(diào)節(jié)[61]，而滲透調(diào)節(jié)反過來又在細胞伸展中發(fā)揮有效作用[62]。因此，除了代謝作用外，氨基酸可能還具有結(jié)構(gòu)功能，不僅通過參與增加葉片密度直接影響SLA，而且可通過調(diào)控葉片解剖結(jié)構(gòu)來影響SLA?？偟膩碚f，由養(yǎng)分供應(yīng)驅(qū)動的葉面積和葉質(zhì)量之間關(guān)系的變化與葉密度的變化比與單位面積葉體積的變化關(guān)系更密切[2,8]。因此，我們推測兩種基因型（圖1a）的SLA反應(yīng)，至少部分的可以用氮和碳代謝相關(guān)初級代謝物（附圖S1）來解釋（圖5）。然而，還需要進一步的研究來充分闡明這些代謝物在控制辣椒葉片密度方面的具體功能。

由于兩種基因型在氮和碳相關(guān)代謝物對葉片密度等性狀影響上表現(xiàn)出相似的行為（附圖S1），因此研究認為氮由中度缺乏到充足供應(yīng)（圖1b、2a）時，基因型之間的SLA不同源于葉片解剖結(jié)構(gòu)的可塑性不同（圖2b-d）。氮充足時，由于葉片密度的增加和柵欄薄壁組織的增厚，品種Biquinho的SLA降低（圖2c、3、5）。相反，隨著氮供應(yīng)的增加，品種Habanero由于海綿薄壁組織的變化導(dǎo)致葉片厚度的下降[30]，厚度變薄補償了葉片密度的變化，從而使SLA沒有變化（圖2b、d、3、5）。此外，由于柵欄薄壁組織比海綿薄壁組織密度更大[63]，在中度缺氮至充足氮范圍內(nèi)，品種Biquinho的SLA敏感性更高。Xiong等[8]研究不同品種水稻葉面積/葉質(zhì)量比對施氮變化的響應(yīng)差異時也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。

本研究明確了Biquinho和Habanero兩種基因型辣椒SLA變化的不同原因。研究結(jié)果表明，兩種基因型辣椒在氮供應(yīng)量增加時SLA均有所降低，這是因為氮和碳相關(guān)代謝物（主要是氨基酸、蛋白質(zhì)和淀粉）的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致葉片密度增加（圖7和附圖S1）。然而，在中度缺氮到氮充足范圍內(nèi)，辣椒的SLA也受到材料表型可塑性的影響。隨著供氮量的增加，SLA在兩個基因型中表現(xiàn)出不同的變化，品種Biquinho具有更高的葉密度和更厚的柵欄薄壁組織，而Habanero辣椒則觀察到更高的葉密度和更薄的葉片厚度（與更薄的海綿薄壁組織 有關(guān)）。

雖然本研究沒有發(fā)現(xiàn)細胞間隙比例的改變，但研究氮供應(yīng)對葉細胞數(shù)量、細胞壁厚度、細胞擴張將有助于在分子水平上更好地理解氮對SLA及器官發(fā)生的影響[64]。了解環(huán)境條件如何影響葉片形態(tài)對于固定棲息地中的物種生存非常重要[31]。與其他物種類似[3,31-33]，Biquinho和Habanero采用了類似的策略來降低SLA以保證在弱光環(huán)境下存活。雖然兩個品種在極低和極高氮劑量下表現(xiàn)出相同的行為，但在中等氮劑量下栽培時表現(xiàn)不同。由此，在極端氮水平下Biquinho和Habanero辣椒在代謝方面表現(xiàn)出和其他研究一樣的響應(yīng)行為。然而，在中度缺氮或氮充足的條件下，兩種辣椒采用不同策略與結(jié)構(gòu)特征去調(diào)節(jié)SLA。推測這些品種的自然（或繁殖）棲息地中的氮可用性可以顯著影響SLA行 為[3]。鑒于SLA是決定不同物種在其自身環(huán)境中適應(yīng)性的一個重要特征，因此有必要進一步研究SLA對氮供應(yīng)的分子、結(jié)構(gòu)和生理調(diào)節(jié)響應(yīng)。

作者貢獻

LAS, JAC-A和AN-N設(shè)計試驗。LAS和JAC- A執(zhí)行試驗和采樣。LAS, JAC-A, PMAC, EATP和NMS進行分析測試。LAS, RPO-G, EATP和AN-N撰寫論文。FMD, RPO-G, PMAC, AZ, WLA, RS, EATP和AN-N審閱修訂論文。

Acknowledgements

由國家科學(xué)技術(shù)發(fā)展委員會資助（CNPq）（ANN 306818/2016-7號，LAS 501090/2015-0號，WLA 402511/2016-6號）。米納斯吉拉斯州研究擴展基金會（FAPEMIG）[授權(quán)編號：CRARED-00053-16 ANN]。感謝CNPq向RPO-G（流程號152121/2019-6）、ANN、FMD和WLA授予的研究經(jīng)費。RS得到了愛爾蘭農(nóng)業(yè)、食品和海洋部（DAFM）研究經(jīng)費（VICCI編號：14/S/819）的支持。我們還感謝Franciele Santos Oliveira女士對樣品制備的支持。