黃腐酸對大豆內(nèi)源激素的調(diào)控及結(jié)瘤能力的影響

侯慧云，徐夢蕾，郭昱嫻，袁紅莉，高同國，朱寶成

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物學(xué)院，北京 100194)

大豆與根瘤菌形成的特殊結(jié)構(gòu)——根瘤可以將空氣中的氮?dú)膺€原為氨而被植株直接吸收利用[1]，而根瘤的形成和發(fā)育過程受到多種植物內(nèi)源激素的共同調(diào)控[2]. 在大豆結(jié)瘤初期，生長素的準(zhǔn)確定位、運(yùn)輸和積累起著非常重要的作用[3-4]，苜蓿LAX基因(MedicagotruncatulaLAX，MtLAX)有助于生長素的積累，在皮層、根瘤菌侵染部位和生長中的根瘤原基中表達(dá)，Mtlax2突變體中侵染線形成和結(jié)瘤發(fā)育均受損[5]；細(xì)胞分裂素在結(jié)瘤初期作為一種關(guān)鍵的信號分子，可以誘導(dǎo)苜蓿和百脈根早期結(jié)瘤基因ENOD40的表達(dá)[6]，促進(jìn)根瘤原基的形成[7]；Camille等[8]研究發(fā)現(xiàn)赤霉素能夠同時(shí)調(diào)控根瘤菌侵染過程和根瘤原基形成過程；乙烯負(fù)調(diào)控根瘤的形成和發(fā)育，沉默表達(dá)乙烯的EIN2基因會出現(xiàn)超結(jié)瘤表型[9-10]；脫落酸通過干擾結(jié)瘤因子引起的鈣離子峰來控制根瘤數(shù)量[11-12]，同時(shí)，脫落酸還抑制了細(xì)胞分裂素對ENOD40的誘導(dǎo)，與細(xì)胞分裂素拮抗調(diào)控根皮層結(jié)瘤的發(fā)生[13].在根瘤原基分裂細(xì)胞中，由細(xì)胞分裂素引起的生長素局部積累對根瘤器官的形成至關(guān)重要[14].生長素、細(xì)胞分裂素和脫落酸相互平衡、相互協(xié)調(diào)，共同決定形成側(cè)根還是根瘤[6,15].

腐植酸是由動(dòng)植物殘?bào)w經(jīng)過一系列生化反應(yīng)形成的天然高分子有機(jī)混合物[16-17]，而黃腐酸是腐植酸中分子質(zhì)量最小、活性最好的全水溶有機(jī)芳香族類物質(zhì)[18]，具有生長調(diào)節(jié)劑的作用. Rezazadeh等[19]研究發(fā)現(xiàn)葉面噴施腐植酸肥顯著提高了作物根系生長、根瘤數(shù)量和根瘤含氮率. 邱小倩等[20]和張?jiān)奇肹21]也證實(shí)噴施黃腐酸可提高苜蓿結(jié)瘤數(shù)量、根瘤鮮重及單位質(zhì)量固氮酶活性，進(jìn)而提高苜蓿產(chǎn)量.另外，黃腐酸可提高土壤中固氮菌的競爭力，使其在根系的活力和數(shù)量顯著增加，從而加強(qiáng)根系的生物固氮作用[22-23]. 高同國[24]采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了黃腐酸提高大豆結(jié)瘤的機(jī)理，表明黃腐酸誘導(dǎo)結(jié)瘤過程涉及物質(zhì)運(yùn)輸、能量代謝、DNA合成與修復(fù)、氮代謝、碳代謝等過程. Capstaff等[25]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法證實(shí)黃腐酸提高苜蓿的結(jié)瘤數(shù)量，其過程涉及結(jié)瘤初期轉(zhuǎn)錄因子、根瘤菌和激素誘導(dǎo)的植物反應(yīng)相關(guān)基因、結(jié)瘤相關(guān)基因. 本研究前期經(jīng)熱裂解氣相色譜質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)黃腐酸中含有黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)[24]，并且證實(shí)黃腐酸可以提高大豆的結(jié)瘤能力.已有研究表明生長素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、赤霉素等內(nèi)源激素在大豆結(jié)瘤中起著重要調(diào)控作用[2]，但黃腐酸與內(nèi)源激素如何共同作用影響大豆結(jié)瘤數(shù)量還不清楚. 本文通過研究大豆結(jié)瘤固氮初期黃腐酸對植株內(nèi)源性激素含量和分布的影響，為解析黃腐酸提高大豆根瘤固氮的機(jī)理提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試菌株：遼寧慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumliaoningense) CCBAU 05525(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)根瘤菌研究中心保存菌種).

黃腐酸：由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室贈與.

供試種子：冀豆17，購買于市場.

試劑：細(xì)胞分裂素ZT、赤霉素GA3、生長素IAA、脫落酸ABA、染料木黃酮，以上試劑均購于Biotopped公司.

YMA培養(yǎng)基：甘露醇 10 g，KH2PO40.25 g，K2HPO4·3H2O 0.327 g， MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，酵母粉 0.8 g，蒸餾水1 L，pH 7.0；固體培養(yǎng)基加瓊脂20 g.

低氮植物營養(yǎng)液(1 L)：Ca(NO3)20.03 g，CaSO4·2H2O 0.582 g，KCl 0.075 g，MgSO4·7H2O 0.06 g， K2HPO4·3H2O 0.178 g，檸檬酸鐵 0.075 g，微量元素 1 mL.

微量元素配方(1 L)：H3BO32.86 g，MnSO4·H2O 2.02 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，CuSO40.512 g，H2MoO40.02 g.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 遼寧慢生根瘤菌的培養(yǎng)

將遼寧慢生根瘤菌(B.liaoningense) CCBAU 05525 在YMA固體培養(yǎng)基上28 ℃活化3 d，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 170 r/min培養(yǎng)約7 d，使OD600值達(dá)到1左右，備用.

1.2.2 大豆的栽培

大豆種子用體積分?jǐn)?shù)95%的酒精消毒1 min，用體積分?jǐn)?shù)5%的H2O2消毒3 min，無菌水沖洗5～6次后避光、浸泡過夜.將浸泡后的大豆轉(zhuǎn)入無菌帶濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙?zhí)崆坝脽o菌水潤濕，室溫避光催芽，待大豆長出1 cm左右的芽時(shí)備用. 在超凈工作臺中將滅菌蛭石裝到中間帶孔、用無菌紗布連接低氮培養(yǎng)液的雙層瓶中.將發(fā)芽的大豆種進(jìn)蛭石中，上層用封口膜隔絕外界，放置于人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng).培養(yǎng)箱設(shè)定為光照16 h，溫度25 ℃；黑暗8 h，溫度22 ℃，濕度60%.當(dāng)幼苗長出蛭石層面2～3 cm時(shí)將上層封口膜剪開，保證植株生長.

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

待植株的子葉剛好張開，正要長出第1片真葉的時(shí)候，對幼苗進(jìn)行處理.處理分5組，如表1所示，其中G為對照組，G300H、G500H、G1000H為實(shí)驗(yàn)組，GM為陽性對照組.接種后，分別在第1、2、3、5、8、12天取樣，每個(gè)處理取3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)分離根、莖、葉，并分別用錫紙包好，液氮冷凍5 min后放-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?長出根瘤的，將其從根系分離并計(jì)數(shù).

1.2.4 植物內(nèi)源激素的提取

采用陳雪梅等[26]的高效液相色譜法(HPLC)法略加改動(dòng). 將樣品放入液氮研磨后，分3次加6 mL 體積分?jǐn)?shù)80%(含體積分?jǐn)?shù)1%冰乙酸)的甲醇提取液，4 ℃浸提15 h后，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，吸取上清液1 mL，與3 mL體積分?jǐn)?shù)1%的冰乙酸溶液混勻，過C18萃取小柱，用6 mL 體積分?jǐn)?shù)10%的甲醇清洗雜質(zhì)，再加入0.5 mL 體積分?jǐn)?shù)80%(含體積分?jǐn)?shù)1%冰乙酸)的甲醇洗脫，收集洗脫液過0.22 μm微孔濾膜后，直接上樣測定各激素含量.

1.2.5 植株內(nèi)源激素的測定條件

所用儀器為Agilent Technologies 1260型高效液相色譜儀. 色譜柱為Hadesil C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動(dòng)相為甲醇和超純水(體積比45∶55)，進(jìn)樣量為50 μL，流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm，定量方法為外標(biāo)法，通過ZT、IAA、GA3、ABA標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，每個(gè)樣品3次重復(fù).

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析，采用Excel 2017制圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 黃腐酸對大豆根瘤數(shù)目的影響

接種根瘤菌后，大豆結(jié)瘤情況如圖1所示. 根瘤從第12天開始出現(xiàn)，第16天幾乎全部植株都已結(jié)瘤并且其中一些根瘤橫切面呈暗紅色，趨于成熟. 接種后第12天，G500H組結(jié)瘤數(shù)量顯著高于其他處理組，比G組多43.9%，而G1000H組此時(shí)還沒有形成明顯根瘤. 第16天G500H組結(jié)瘤數(shù)量最多，比G組多73.1%，比陽性對照GM組多18.9%；G300H組結(jié)瘤數(shù)量比G組多32.1%，而G1000H組比G組根瘤數(shù)少39.2%，即1 000 mg/L的黃腐酸抑制了大豆結(jié)瘤.實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)適宜質(zhì)量濃度的黃腐酸可以提高大豆結(jié)瘤數(shù)量，而高質(zhì)量濃度的黃腐酸反而起到抑制作用.

表1 實(shí)驗(yàn)處理

同一天不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖1 單株大豆結(jié)瘤數(shù)量Fig.1 Nodulation number of soybean per plant

2.2 黃腐酸對大豆植株中ZT含量的影響

2.2.1 黃腐酸對大豆根系ZT含量的影響

黃腐酸對大豆根系中ZT含量的影響見圖2. 與對照組(G組)相比，黃腐酸促進(jìn)了結(jié)瘤初期根部ZT的積累. G300H組在第3天ZT含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)達(dá)到最高值32.3 μg/g，第12天含量最低，為7.4 μg/g；G300H組ZT含量在第1天比G組高383.4%. G500H組ZT含量在第3天達(dá)到最高值37.7 μg/g，在第12天含量最低，為22.6 μg/g；在測定的時(shí)間內(nèi)G500H組ZT含量都比對照組的高，在第1天最高多304.3%. G1000H組從使用后就表現(xiàn)出抑制作用，與對照組相比其值偶有增加. 陽性對照GM組在第1天表現(xiàn)出最高值47.3 μg/g，在第3天表現(xiàn)最低值1.1 μg/g. G300H組和G500H組與對照G組相比，ZT含量增加，表現(xiàn)為促進(jìn)作用，其在第1天最高，比對照G組含量分別高383.4%和304.3%，表明300 mg/L和500 mg/L的黃腐酸均可提高根中ZT含量.

同一天不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖2 黃腐酸對結(jié)瘤初期大豆根部ZT含量的影響Fig.2 Effect of fulvic acid on ZT content of soybean roots at the early stage of nodulation

2.2.2 黃腐酸對大豆莖部ZT含量的影響

黃腐酸對大豆莖中ZT含量的影響見圖3.與對照組相比，黃腐酸促進(jìn)了結(jié)瘤初期莖中ZT的積累. G300H組在第2天達(dá)到最高值52.0 μg/g，在第12天處于最低值2.5 μg/g. G500H組在第2天達(dá)到較高值66.4 μg/g，但在第8天出現(xiàn)極高的現(xiàn)象，達(dá)到了81.9 μg/g；G500H組ZT含量在第2、3、5、8天都比對照高. G1000H組從使用后就表現(xiàn)出抑制作用，只在第12天ZT含量比對照G組高.陽性對照GM組在第1天出現(xiàn)最高值28.8 μg/g；除第3天外，GM組ZT含量都比對照G組含量高.說明適宜質(zhì)量濃度的黃腐酸可以提高莖中ZT含量.

同一天不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖3 黃腐酸對結(jié)瘤初期大豆莖中ZT含量的影響Fig.3 Effect of fulvic acid on ZT content of soybean stems at the early stage of nodulation

2.2.3 黃腐酸對大豆葉中ZT含量的影響

黃腐酸對大豆葉中ZT含量的影響見圖4.與對照組相比，黃腐酸促進(jìn)了結(jié)瘤初期葉中ZT的積累. G300H組從接種后葉中ZT含量先減少后增多，在第3天含量降到最低值2.2 μg/g，在第1天含量最高，為16.0 μg/g. G500H組在第5天達(dá)到最低值5.0 μg/g，在第1天含量最高，為23.6 μg/g；在第1、2、3、8、12天G500H組ZT含量都比對照組高. G1000H組從使用后就基本表現(xiàn)為抑制作用，與對照組相比僅在第12天表現(xiàn)為增加. 陽性對照GM組在第2天出現(xiàn)最低值2.9 μg/g，第12天最高，為25.9 μg/g. G300H組和G500H組表現(xiàn)為促進(jìn)作用，其在第12天時(shí)最高，分別比對照組ZT含量高196.0%和245.1%.上述結(jié)果說明500 mg/L的黃腐酸提高葉中ZT含量更顯著.

同一天不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖4 黃腐酸對結(jié)瘤初期大豆葉中ZT含量的影響Fig.4 Effect of fulvic acid on ZT content of soybean leaves at the early stage of nodulation

2.3 黃腐酸對大豆植株中IAA含量的影響

2.3.1 黃腐酸對大豆根系IAA含量的影響

黃腐酸對大豆根系中IAA含量的影響見圖5.由圖5可知，黃腐酸促進(jìn)了結(jié)瘤初期根部IAA的積累. G300H組在第5天達(dá)到最低0.8 μg/g，在第12天達(dá)到最高值3.7 μg/g. G500H組在第5天達(dá)到最低0.7 μg/g，在第12天達(dá)到最高值8.1 μg/g；除第5天外，G500H組IAA含量均高于對照組. G1000H組與對照組相比其值偶有增加. 陽性對照GM組在第1天IAA含量最低，為1.3 μg/g，在第12天最高，為7.5 μg/g. 上述結(jié)果說明500 mg/L的黃腐酸提高根部IAA含量效果更好.

同一天不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖5 黃腐酸對結(jié)瘤初期大豆根部IAA含量的影響Fig.5 Effect of fulvic acid on IAA content of soybean roots at the early stage of nodulation

2.3.2 黃腐酸對大豆莖中IAA含量的影響

黃腐酸對大豆莖中IAA含量的影響見圖6.圖6表明黃腐酸促進(jìn)了結(jié)瘤初期莖中IAA的積累. G300H組在第5天達(dá)到最低值2.1 μg/g，在第12天達(dá)到最高值4.5 μg/g. G500H組IAA含量在第3天達(dá)到最低值1.6 μg/g，在第12天達(dá)到最高值13.4 μg/g；G500H組IAA含量在第1、5、8、12天都比對照組高. G1000H組前期起抑制作用，從第5天后表現(xiàn)為促進(jìn)作用. 陽性對照GM組與G300H組相似，在第5天達(dá)到最低值1.7 μg/g，在第12天達(dá)到最高值6.7 μg/g. 由此可知，500 mg/L的黃腐酸一定程度上提高了莖中IAA含量.

同一天不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖6 黃腐酸對結(jié)瘤初期大豆莖中IAA含量的影響Fig.6 Effect of fulvic acid on IAA content of soybean stems at the early stage of nodulation

2.3.3 黃腐酸對大豆葉中IAA含量的影響

黃腐酸對大豆葉中IAA含量的影響見圖7.由圖7可知，黃腐酸促進(jìn)了結(jié)瘤初期葉中IAA的積累. G300H組在第2天達(dá)到最低15.2 μg/g，在第12天達(dá)到最高值33.2 μg/g. G500H組IAA含量在第5天達(dá)到最低32.4 μg/g，在第12天達(dá)到最高值104.8 μg/g；除第5天外，G500H組IAA含量均高于對照組. G1000H組與對照組相比，前期表現(xiàn)為促進(jìn)作用而后期表現(xiàn)為抑制作用. 陽性對照GM組在第2天出現(xiàn)最低值19.9 μg/g，在第8天最高，為71.2 μg/g. 從圖7可知，G500H組基本都比G300H組IAA含量高，即500 mg/L的黃腐酸對葉中IAA含量影響最明顯.

同一天不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖7 黃腐酸對結(jié)瘤初期大豆葉中IAA含量的影響Fig.7 Effect of fulvic acid on IAA content of soybean leaves at the early stage of nodulation

2.4 黃腐酸對大豆植株中GA3含量和分布的影響

2.4.1 黃腐酸對大豆根系GA3含量的影響

黃腐酸對大豆根系中GA3含量的影響見圖8.圖8表明，黃腐酸促進(jìn)了結(jié)瘤初期根部GA3的積累. G300H組在第5天達(dá)到最低值13.7 μg/g，在第8天達(dá)到最高值87.2 μg/g；G300H組GA3含量在第1、2、8、12天均高于對照組. G500H組GA3含量整體呈先升后降趨勢，在第1天最低，為42.6 μg/g，第8天最高，為330 μg/g；除第5天外，G500H組GA3含量均比對照組高. G1000H組在第3天達(dá)到最低值20.8 μg/g，在第8天達(dá)到最大值189.3 μg/g；除第3天外，G1000H組GA3含量都比對照組的高，其也表現(xiàn)出了促進(jìn)作用. 陽性對照GM組GA3含量變化一直處于波動(dòng)中，其在第5天出現(xiàn)最高值145.5 μg/g，第3天最低，為13.6 μg/g. G300H組在第2天時(shí)最高，比對照組高217.9%，G500H組和G1000H組在第8天分別比對照組高581.6%和291.0%. 即500 mg/L黃腐酸提高根系GA3含量更顯著.

同一天不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖8 黃腐酸對結(jié)瘤初期大豆根部GA3含量的影響Fig.8 Effect of fulvic acid on GA3 content of soybean roots at the early stage of nodulation

2.4.2 黃腐酸對大豆莖中GA3含量的影響

黃腐酸對大豆莖中GA3含量的影響見圖9.圖9表明，黃腐酸促進(jìn)了結(jié)瘤初期莖中GA3的積累. G300H組GA3含量在第2天達(dá)到最高值153.1 μg/g，在第12天最低，為15.7 μg/g. G500H組在第8天達(dá)到最高值181.3 μg/g，在第2天最低，為50.8 μg/g；除第5天外，G500H組GA3含量都比對照組的高. G1000H組與對照組相比，前期表現(xiàn)為抑制作用，從第5天開始表現(xiàn)為促進(jìn)作用. 陽性對照GM組GA3含量在第1天出現(xiàn)最大值156.3 μg/g，在第3天達(dá)到最低值26.0 μg/g. 綜合來看500 mg/L的黃腐酸對提高莖中GA3含量效果更好.

同一天不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖9 黃腐酸對結(jié)瘤初期大豆莖中GA3含量的影響Fig.9 Effect of fulvic acid on GA3 content of soybean stems at the early stage of nodulation

2.4.3 黃腐酸對大豆葉中GA3含量的影響

黃腐酸對大豆葉中GA3含量的影響見圖10.圖10表明，黃腐酸促進(jìn)了結(jié)瘤初期葉中GA3含量的積累. G300H組GA3含量在第5天達(dá)到最低24.2 μg/g，在第12天達(dá)到最高值67.2 μg/g；在第3、8、12天G300H組GA3含量均比對照組高. G500H組GA3含量在第12天達(dá)到最高值127.9 μg/g，在第3天達(dá)到最低值17.3 μg/g；在第2、8、12天G500H組GA3含量均比對照組高. G1000H組GA3含量在第1天出現(xiàn)最高值131.2 μg/g；在第1、3、5、8、12天G1000H組GA3含量均比對照組高. 陽性對照GM組在第3天出現(xiàn)最低值19.3 μg/g，在第1天其值最高，為107.6 μg/g. G300H、G500H、G1000H組在第12天分別比對照組高223.2%、515.0%、59.8%. 表明黃腐酸可以提高葉中GA3含量.

同一天不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖10 黃腐酸對結(jié)瘤初期大豆葉中GA3含量的影響Fig.10 Effects of fulvic acid on the content of GA3 of soybean leaves at the early stage of nodulation

2.5 黃腐酸對大豆植株中ABA含量和分布的影響

2.5.1 黃腐酸對大豆根系A(chǔ)BA含量的影響

黃腐酸對大豆根系中ABA含量的影響見圖11.由圖11可知，G300H組在第5天達(dá)到最低值0.9 μg/g，在第12天含量最高，為2.6 μg/g；G300H組ABA含量在第2、3、5、8天均比對照組低. G500H組ABA含量在第1天最低，為0.6 μg/g，在第8天達(dá)到最高值1.9 μg/g；在第1、2、3、5、12天G500H組ABA含量均比對照組低. G1000H組與對照組相比在第3、5、12天的ABA含量均比對照組低. 陽性對照GM組ABA含量在第3天最低，為1.3 μg/g，在第12天最高，為2.4 μg/g. G300H組和G500H組分別在第5天和第1天時(shí)比對照組低48.2%和54.8%. 說明黃腐酸與黃酮類物質(zhì)類似可以降低根部ABA含量，且綜合來看500 mg/L的黃腐酸降低根中ABA含量更顯著.

同一天不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖11 黃腐酸對結(jié)瘤初期大豆根部ABA含量的影響Fig.11 Effects of fulvic acid on ABA content of soybean roots at the early stage of nodulation

2.5.2 黃腐酸對大豆莖中ABA含量的影響

黃腐酸對大豆莖中ABA含量的影響見圖12.由圖12可知，黃腐酸增加了結(jié)瘤初期莖中ABA的積累. G300H組在第5天達(dá)到最低值1.8 μg/g，第1天出現(xiàn)最高值3.6 μg/g；在第1、2、3、12天G300H組ABA含量均比對照組高. G500H組ABA含量在第5天時(shí)達(dá)到最低值2.3 μg/g，在第1天出現(xiàn)最高值3.4 μg/g；在第1、2、3、5、8天G500H組ABA含量比對照組高. G1000H組在第1、3、8、12天ABA含量都比對照組高. 陽性對照GM組在第3天達(dá)到最低值2.1 μg/g，在第2天ABA含量最高，為3.6 μg/g. G300H組和G500H組第1天分別比對照組高34.9%和29.0%. 說明黃腐酸可一定程度上提高莖中ABA含量，但不顯著.

同一天不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖12 黃腐酸對結(jié)瘤初期大豆莖中ABA含量的影響Fig.12 Effects of fulvic acid on ABA content of soybean stems at the early stage of nodulation

2.5.3 黃腐酸對大豆葉中ABA含量的影響

黃腐酸對大豆葉中ABA含量的影響見圖13.由圖13可知，黃腐酸增加了結(jié)瘤初期葉中ABA的積累. G300H組ABA含量在第1天最高，達(dá)12.2 μg/g，在第8天最低，為4.4 μg/g. G500H組在第2天達(dá)到最高值18.1 μg/g，在第5天出現(xiàn)最低值4.7 μg/g；在第2、3、8、12天G500H組ABA含量比對照組高. G1000H組在第1、2、5、8天比對照組高，也表現(xiàn)為促進(jìn)作用. 陽性對照GM組第3天達(dá)到最低值6.3 μg/g，在第1天最高，為11.3 μg/g. G500H組和G1000H組分別在第8天和第2天比對照組高95.1%和70.4%. 500 mg/L的黃腐酸對葉中ABA含量積累影響最明顯.

同一天不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖13 黃腐酸對結(jié)瘤初期大豆葉中ABA含量的影響Fig.13 Effects of fulvic acid on ABA content of soybean leaves at the early stage of nodulation

3 討論

大豆結(jié)瘤過程受到植物激素的嚴(yán)密調(diào)控.根瘤菌侵染大豆根毛后，侵染線會在1～2 d內(nèi)到達(dá)表皮細(xì)胞[27-28].而本實(shí)驗(yàn)從加入根瘤菌后，在1～2 d時(shí)ZT、IAA、GA3含量變化明顯，表明這些激素調(diào)控侵染線的形成，即調(diào)控大豆結(jié)瘤的起始時(shí)期.張偉[29]在研究根瘤原基形成和根瘤發(fā)育的動(dòng)力學(xué)中發(fā)現(xiàn)接種慢生根瘤菌，根瘤原基在接種后的第7天出現(xiàn)，根瘤在接種后第13天出現(xiàn)，按時(shí)間推算與本論文研究的根瘤在接種后第12天出現(xiàn)很接近，而各激素含量變化在第8天比較明顯，這很可能是根瘤原基的形成時(shí)期.本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的12 d內(nèi)各激素的變化規(guī)律特別是1～2 d的侵染線形成時(shí)期、第8天的根瘤原基形成時(shí)期和第12天的根瘤形成時(shí)的變化與Liu等[2]總結(jié)的各激素增加、轉(zhuǎn)運(yùn)和局部積累對結(jié)瘤的作用基本符合，但其具體機(jī)理和調(diào)控沒有深入解析.

黃酮類物質(zhì)在大豆結(jié)瘤過程中具有重要的作用.在結(jié)瘤初期，生長素在根部的局部積累對根瘤的形成至關(guān)重要，而查爾酮合酶突變體表現(xiàn)出生長素局部積累能力的喪失，結(jié)果嚴(yán)重地抑制了結(jié)瘤[30]，這說明了黃酮類物質(zhì)可以調(diào)控生長素的轉(zhuǎn)運(yùn).外源加入黃酮類物質(zhì)可以抑制生長素在豆科植物根部的向頂性運(yùn)輸[31]，而不影響向基性運(yùn)輸，這使得生長素能夠在結(jié)瘤敏感區(qū)(根毛)積累，從而引起根瘤器官的形成.本研究所使用的黃腐酸含有黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)[24]，這可能也是黃腐酸促進(jìn)大豆結(jié)瘤的原因之一.在調(diào)控生長素在根部的局部積累中，細(xì)胞分類素也對其起到一定作用[6].從Ng等[31]的研究中發(fā)現(xiàn)根瘤菌接種到細(xì)胞分裂素受體缺陷型的蒺藜苜蓿后，生長素的向頂性運(yùn)輸不受抑制，致使生長素?zé)o法在結(jié)瘤敏感區(qū)積累，從而影響根瘤形成，這表明細(xì)胞分裂素通常在生長素信號的上游發(fā)揮作用，而細(xì)胞分裂素作為結(jié)瘤信號參與結(jié)瘤的起始，很可能是通過調(diào)控黃酮類物質(zhì)或結(jié)瘤因子來影響生長素轉(zhuǎn)運(yùn)的.黃腐酸中含有的黃酮類物質(zhì)也可能具有調(diào)控作用.

目前對共生體系的研究結(jié)果表明，其受到植物和共生菌的共同調(diào)控.植物體中除了內(nèi)源激素調(diào)控外，還存在一套結(jié)瘤負(fù)調(diào)控系統(tǒng)(即AON系統(tǒng))，二者在發(fā)揮作用時(shí)存在部分交叉且完整的作用機(jī)制都不清楚，此外共生菌也會通過分泌一些信號肽或激素作用于植物來調(diào)控結(jié)瘤.由此可見，植物結(jié)瘤本身受到多方因素的調(diào)控，而黃腐酸不僅可以提高共生菌的競爭力同時(shí)誘導(dǎo)結(jié)瘤相關(guān)基因的表達(dá)，還可以通過影響植物激素來調(diào)控結(jié)瘤過程，在大豆結(jié)瘤的不同時(shí)期和過程都發(fā)揮作用.但由于結(jié)瘤過程中涉及共生雙方的時(shí)空表達(dá)的基因和調(diào)控的物質(zhì)很多，十分復(fù)雜，所以目前具體分子機(jī)制尚不清楚，也沒有形成完整的表達(dá)及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本實(shí)驗(yàn)僅僅從植物內(nèi)源激素含量與分布方面分析黃腐酸對結(jié)瘤的影響，而后續(xù)的相關(guān)基因的挖掘和功能驗(yàn)證是課題組工作的重點(diǎn)內(nèi)容和重心.

4 結(jié)論

適宜的黃腐酸質(zhì)量濃度提高大豆的結(jié)瘤固氮能力，高質(zhì)量濃度的黃腐酸抑制了大豆結(jié)瘤固氮能力.這可能是由于適宜質(zhì)量濃度的黃腐酸(如500 mg/L)通過增加大豆根莖葉中ZT、IAA、GA3等3種激素含量，降低根系A(chǔ)BA含量同時(shí)提高葉中ABA含量來發(fā)揮促進(jìn)效果，而高質(zhì)量濃度的黃腐酸(如1 000 mg/L)對激素的調(diào)控起到相反作用的結(jié)果.