肉桂萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制作用 ①

李 晨， 趙 鑫， 王文萱， 李云鵬

(黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080)

0 引 言

肉桂(CinnamomumcassiaPresl)，又稱大桂、牡桂、菌桂和中國(guó)桂等，屬雙子葉樟科喬木。肉桂主要分布在我國(guó)的廣西、廣東，此外，印度、老撾以及越南等地也有種植，其干燥樹(shù)皮可藥食兩用，也被稱為肉桂，其主要成分有多酚類、有機(jī)酸類、多糖類、揮發(fā)油等[1-3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，肉桂具抗菌、抗炎、抗氧化等性能，所以肉桂在食品、醫(yī)藥及化工等領(lǐng)域均有廣泛研究[4]。黃瓜枯萎病是可導(dǎo)致黃瓜減產(chǎn)絕收的病害之一。長(zhǎng)期以來(lái)，黃瓜枯萎病的防治以化學(xué)農(nóng)藥為主，隨著環(huán)境安全、食品安全問(wèn)題的日益嚴(yán)峻，運(yùn)用生物手段預(yù)防和控制植物病害的發(fā)生、發(fā)展受到廣泛關(guān)注[5-7]。相關(guān)研究表明，肉桂丙酮提取物及其與丁香、木香復(fù)配對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)均具有較強(qiáng)的抑制作用[8]；肉桂乙醇提取物對(duì)黃瓜幼苗抗枯萎病菌的預(yù)防效果、誘導(dǎo)抗病效果、治療效果均可達(dá)50%以上[9]。但肉桂抑菌活性物質(zhì)存在的極性部位尚不清晰，而且開(kāi)發(fā)利用研究還不多。在肉桂提取物對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制研究方面，已有研究多是測(cè)定其對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制作用，而很少研究其對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用。黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)是發(fā)生侵染的前提條件，在病害侵染和防治中同菌絲生長(zhǎng)處于同等重要地位。因此，以系列極性溶劑對(duì)肉桂乙醇粗提物進(jìn)行萃取，采用生長(zhǎng)速率法和懸滴法探究各萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制作用，明確肉桂抑菌活性萃取部位，可為開(kāi)發(fā)防治黃瓜枯萎病的植物源農(nóng)藥提供參考，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上防治黃瓜枯萎病提供綠色防控途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：肉桂(CinnamomumcassiaPresl)，采購(gòu)于哈爾濱市南崗區(qū)南京同仁堂中藥房；

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 肉桂萃取物的制備

肉桂粉碎過(guò)40目篩，按1∶5(W/V)加入80%乙醇溶液，超聲波振蕩提取60 min后過(guò)濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，用蒸餾水溶解，得到1 g/mL肉桂粗提物。依次用5倍體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取粗提物2次，得到相應(yīng)的萃取物和水相萃余物，旋轉(zhuǎn)蒸干有機(jī)溶劑，以50%乙醇定容至1 g/mL，作為母液，于4 ℃冰箱冷藏保存，備用。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

配制PDA培養(yǎng)基，其配方為馬鈴薯200 g、水1000 mL、葡萄糖20 g、瓊脂20 g。

1.2.3 萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制作用初步篩選

1.2.3.1 萃取物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定終濃度為10 mg/mL各相萃取物(含萃余物，下同)對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響：在無(wú)菌條件下，分別吸取1 mL萃取物加入99 mL冷卻至40-50 ℃滅菌PDA培養(yǎng)基中，搖勻，制成平板，以加入1 mL 50%乙醇為對(duì)照，接種菌餅，25 ℃恒溫培養(yǎng)，分別于接種后第3、4、5天用十字交叉法測(cè)定并記錄菌落直徑，按下述公式計(jì)算抑菌率。

雙聯(lián)抗血小板療法現(xiàn)已成為冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后的標(biāo)準(zhǔn)治療手段[1-3]。但雙聯(lián)抗血小板療法常會(huì)引起胃黏膜損傷，甚至導(dǎo)致消化道大出血。研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)子泵抑制劑可以預(yù)防雙聯(lián)抗血小板療法誘發(fā)的消化系統(tǒng)不良反應(yīng)[4]。但也有學(xué)者認(rèn)為，部分質(zhì)子泵抑制劑可能會(huì)影響與抗血小板密切相關(guān)的肝酶CYP2C19的功能，增加血小板反應(yīng)性，導(dǎo)致出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈血栓等并發(fā)癥[5]。埃索美拉唑是新一代質(zhì)子泵抑制劑，其對(duì)雙聯(lián)抗血小板療法的抗血小板功能影響較小[6-7]。本研究旨在探討埃索美拉唑?qū)?jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后患者雙聯(lián)抗血小板療法臨床效果的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

菌落直徑=測(cè)量直徑-接種時(shí)菌餅直徑

(1)

菌絲生長(zhǎng)抑制率=

(2)

1.2.3.2 萃取物對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用測(cè)定

采用懸滴法測(cè)定10 mg/mL各相萃取物對(duì)孢子萌發(fā)的影響，以無(wú)菌蒸餾水配制20 mg/mL各相萃取物，調(diào)整已培養(yǎng)的孢子液濃度，使其在顯微鏡(10×10)下每個(gè)視野約有200個(gè)孢子，取上述萃取物與孢子液各1 mL充分混合，以與20 mg/mL各相萃取物所含50%乙醇等量的乙醇溶液配制對(duì)照孢子混合液。分別滴混合液10 μL于凹玻片上，重復(fù)三次。于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h(此時(shí)對(duì)照萌發(fā)率在90%以上)，顯微鏡下觀察各處理孢子萌發(fā)的數(shù)量并計(jì)數(shù)，按下述公式計(jì)算抑制率。

(3)

孢子萌發(fā)抑制率=

(4)

1.2.4 抑菌活性萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌的毒力測(cè)定

以初步篩選中抑菌活性較強(qiáng)的萃取物為供試萃取物，分別采用生長(zhǎng)速率法和懸滴法測(cè)定終濃度為5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL的萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制率，具體方法同上。計(jì)算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和抑制中濃度(IC50)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析方法

數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel軟件進(jìn)行處理，以DPS7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析和毒力回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌抑制作用的初篩

2.1.1 肉桂萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

如表1所示，濃度為10 mg/mL時(shí)，肉桂80%乙醇提取物的4種萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率由大到小為：石油醚萃取物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>水相萃余物，說(shuō)明肉桂抑菌活性物質(zhì)主要存在于石油醚相和正丁醇相中。隨著時(shí)間的推移，石油醚萃取物和正丁醇萃取物的菌絲生長(zhǎng)抑制率呈先上升后下降的趨勢(shì)，而乙酸乙酯萃取物和水相萃余物的抑制率呈上升趨勢(shì)。

表1 肉桂萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率(%)

2.1.2 肉桂萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

如表2所示，在濃度為10 mg/mL時(shí)，石油醚萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的抑制率顯著高于其他萃取物，正丁醇萃取物次之，而乙酸乙酯萃取物和水相萃余物的抑制作用微弱。

表2 肉桂萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

綜合分析肉桂各萃取物對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)石油醚萃取物抑菌活性很強(qiáng)，正丁醇萃取物也有一定的抑菌活性，因此選擇石油醚萃取物和正丁醇萃取物進(jìn)行毒力分析試驗(yàn)，進(jìn)一步明確其抑菌作用。

2.2 肉桂抑菌活性萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌的毒力分析

2.2.1 肉桂抑菌活性萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的毒力分析

如表3所示，肉桂石油醚萃取物和正丁醇萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用均隨濃度的增加而增強(qiáng)，濃度為20 mg/mL和30 mg/mL的石油醚萃取物抑制率差異不顯著，其他各濃度石油醚萃取物的抑制率差異均達(dá)極顯著水平；各濃度正丁醇萃取物的抑制率差異均極顯著。對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和計(jì)算，得到肉桂石油醚萃取物的毒力回歸方程為y=3.2492+2.2403x，相關(guān)系數(shù)r為0.9226，IC50為6.05 mg/mL；肉桂石油醚萃取物的毒力回歸方程為y=3.2222+1.3885x，相關(guān)系數(shù)r為0.9857，IC50為19.07 mg/mL。

表3 不同濃度肉桂抑菌活性萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率(%)

2.2.2 肉桂抑菌活性萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的毒力分析

如表4所示，肉桂石油醚萃取物和正丁醇萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的抑制作用均隨濃度的增加而增強(qiáng)，濃度為20 mg/mL和30 mg/mL的石油醚萃取物抑制率差異不顯著，其他各濃度石油醚萃取物抑制率差異均極顯著；濃度為10 mg/mL和20 mg/mL的正丁醇萃取物抑制率差異不顯著，其他各濃度正丁醇萃取物抑制率差異極顯著。對(duì)表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和計(jì)算，得到肉桂石油醚萃取物的毒力回歸方程為y=3.6914+1.7895x，相關(guān)系數(shù)r為0.9533，IC50為5.39 mg/mL；肉桂石油醚萃取物的毒力回歸方程為y=2.3907+1.8706x，相關(guān)系數(shù)r為0.9411，IC50為24.83mg/mL。進(jìn)一步證實(shí)，肉桂石油醚萃取物的抑菌活性很強(qiáng)，肉桂正丁醇萃取物也有一定抑菌活性。

表4 不同濃度肉桂石油醚萃取物和正丁醇萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的抑制率(%)

3 結(jié)論與討論

肉桂石油醚萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制中濃度(IC50)均低于7 mg/mL，其次是正丁醇萃取物，其對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制中濃度(IC50)均低于25 mg/mL。總體上，兩種萃取物對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制作用都隨濃度的升高而增強(qiáng)，均可作為防治黃瓜枯萎病植物源殺菌劑的潛力資源。

在食品防腐保鮮和醫(yī)藥領(lǐng)域中，肉桂的抑菌活性及活性成分已被大量研究，相關(guān)的應(yīng)用研究也成為食品防腐保鮮和醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[10-11]。在農(nóng)業(yè)病害防治方面，肉桂這一抑菌植物資源也應(yīng)得到足夠重視。肉桂抑制黃瓜枯萎病菌的抑菌物質(zhì)主要存在于石油醚相和正丁醇相中，其抑制黃瓜枯萎病菌的活性成分及抑菌機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。在此基礎(chǔ)上應(yīng)著重于應(yīng)用方法和劑量的研究，從而為黃瓜枯萎病防治提供綠色防護(hù)新途徑。