HPLC法測(cè)定尪痹顆粒中桂皮醛、淫羊藿苷和柚皮苷成分的含量

蔣 菲，劉業(yè)飛，程慶兵，鄭 正，王 瑋（合肥市食品藥品檢驗(yàn)中心質(zhì)?？?，安徽 合肥 230061）

尪痹顆粒具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)等功效，臨床上常用于治療肝腎不足、風(fēng)濕阻絡(luò)所致的尪痹等病癥，在治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎方面效果較佳[1]；該產(chǎn)品由地黃、熟地黃、續(xù)斷、附片（黑順片）、骨碎補(bǔ)、桂枝、淫羊藿等17味藥材加工制成。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定含量測(cè)定項(xiàng)針對(duì)淫羊藿藥材中的淫羊藿苷進(jìn)行[2-3]。桂枝有發(fā)汗解肌、溫通經(jīng)脈、助陽(yáng)化氣、平?jīng)_降氣等功效[4-7]，淫羊藿有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效[8-11]，骨碎補(bǔ)有療傷止痛、補(bǔ)腎強(qiáng)骨等功效[12-15]；該藥在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的應(yīng)用也日益增多[16-19]?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中僅針對(duì)淫羊藿藥材中淫羊藿苷的測(cè)定不能全面體現(xiàn)該產(chǎn)品的質(zhì)量水平，為保障患者的用藥安全，提高現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中質(zhì)量控制手段，現(xiàn)針對(duì)尪痹顆粒中的君藥骨碎補(bǔ)、臣藥淫羊藿和佐藥桂枝，研究同時(shí)測(cè)定桂皮醛、淫羊藿苷和柚皮苷含量的HPLC方法，為該藥的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

采用SHIMADZU LC-20AD型高效液相色譜儀系統(tǒng)（配備DGU-20A型在線脫氣機(jī)、LC-20A型四元泵、SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器，日本島津儀器公司）；賽多利斯CPA 225D型電子天平（精度：十萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯儀器公司）；Waters Symmetry C18液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)沃特世儀器公司）；Milli-Q Direct 8型純水系統(tǒng)（美國(guó)默克密理博儀器公司）；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）。

1.2 藥品與試劑

尪痹顆粒樣品[遼寧好護(hù)士藥業(yè)（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，規(guī)格：6 g，批號(hào)分別為：190312、190925、200109]；實(shí)驗(yàn)用乙腈、甲醇、濃磷酸：分析純，均購(gòu)自上海化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水：純化水，由純水系統(tǒng)制備。對(duì)照品：桂皮醛，批號(hào)：110710-201821，含量以99.6%計(jì)；淫羊藿苷，批號(hào)：110737-201516，含量以94.2%計(jì)；柚皮苷，批號(hào)：110722-201815，含量以91.7%計(jì)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：0.5%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（見(jiàn)表1）；檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液分別精密稱(chēng)取柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛對(duì)照品適量，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇超聲處理5 min（功率300 W，頻率40 kHz）使溶解，制成質(zhì)量濃度分別為550、942、996 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.2 對(duì)照品混合溶液取“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，分別精密量取5.0 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

2.2.3 供試品溶液取尪痹顆粒樣品適量，研細(xì)混勻，取1.0 g精密稱(chēng)定，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理25 min（功率300 W，頻率40 kHz），取出放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻，采用0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液按尪痹顆粒藥材比例和加工工藝分別制備缺骨碎補(bǔ)、缺淫羊藿和缺桂枝的陰性樣品，陰性樣品按“2.2.3”項(xiàng)供試品溶液處理，制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專(zhuān)屬性考察

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液和空白溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。結(jié)果顯示柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛與相鄰峰之間分離度均> 1.5，3種成分色譜峰理論塔板數(shù)均> 3000，且對(duì)照品溶液與供試品溶液中3種成分色譜峰保留時(shí)間一致，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾峰存在。見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC色譜圖A - 對(duì)照品混合溶液，B - 供試品溶液，C - 骨碎補(bǔ)陰性對(duì)照溶液，D - 淫羊藿陰性對(duì)照溶液，E - 桂枝陰性對(duì)照溶液，F(xiàn) - 空白溶液；1 - 柚皮苷，2 - 淫羊藿苷，3 - 桂皮醛Fig 1 HPLC chromatogramA - mixed solution of reference substance, B - sample solution, C -rhizoma drynariae negative reference solution, D - epimedium negative reference solution, E - ramulus cinnamomi negative reference solution,F - blank solution; 1 - naringin, 2 - icariin, 3 - cinnamaldehyde

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，分別精密量取0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇制備含柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。詳見(jiàn)表2。

表2 回歸方程和線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 儀器精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液，按色譜條件進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示柚皮苷、淫羊藿苷、桂皮醛峰面積RSD分別為1.25%、1.08%、0.96%，表明儀器精密度良好。

2.6 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取尪痹顆粒（批號(hào)：190312）樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果顯示柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛峰面積RSD分別為1.87%、2.06%、1.42%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 方法重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批尪痹顆粒（批號(hào)：190312）樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算3種成分的含量。結(jié)果顯示柚皮苷、淫羊藿苷、桂皮醛的RSD分別為2.69%、2.51%、1.93%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收考察試驗(yàn)

取已知含量的尪痹顆粒（批號(hào)：190312）樣品，研細(xì)混勻，取1.0 g精密稱(chēng)定，置25 mL棕色容量瓶中，平行稱(chēng)取6份，分別精密加入柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制得6份加樣回收溶液，按色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。根據(jù)檢測(cè)量和加入量計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示柚皮苷、淫羊藿苷、桂皮醛的平均加樣回收率分別為100.49%、101.07%、99.10%，三種成分的RSD分別為2.06%、1.40%、1.83%（n= 6）。

2.9 市售樣品檢測(cè)

取3個(gè)批次的尪痹顆粒樣品，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算3份供試品中3種成分的含量；同時(shí)，分別采用2020版《中國(guó)藥典》中骨碎補(bǔ)和桂枝2種藥材方法測(cè)定柚皮苷和桂皮醛含量，采用2020版《中國(guó)藥典》中尪痹顆粒中成藥個(gè)論方法測(cè)定淫羊藿苷含量，分別比較檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，采用國(guó)家藥典方法檢測(cè)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果一致，見(jiàn)表3。但采用此方法縮短了分析時(shí)間，提高了工作效率，且能更全面的體現(xiàn)該產(chǎn)品的質(zhì)量水平。

表3 含量檢測(cè)結(jié)果. mg·g-1Tab 3 Results of content test. mg·g-1

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化

取柚皮苷對(duì)照品，加甲醇制備1 mL溶液中含柚皮苷質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的波長(zhǎng)測(cè)試溶液，以同法制備淫羊藿苷、桂皮醛質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的波長(zhǎng)測(cè)試溶液；按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，設(shè)置二極管陣列檢測(cè)器波長(zhǎng)掃描范圍為200 ～ 400 nm，上述溶液分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖和光譜圖。由3種成分光譜圖可以看出，柚皮苷、淫羊藿苷、桂皮醛分別在284、271、289 nm處有最大吸收，3種成分最大吸收接近，結(jié)合色譜圖響應(yīng)，最終確定282 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

中藥成分檢測(cè)常用的流動(dòng)相體系為甲醇體系和乙腈體系。因桂皮醛和淫羊藿苷極性較弱，選擇甲醇體系時(shí)，洗脫時(shí)間久，分析檢測(cè)效率低，因此實(shí)驗(yàn)選擇乙腈體系。取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液和空白溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別選擇乙腈-0.5%磷酸體系、乙腈-水體系作為流動(dòng)相，考察2種乙腈體系對(duì)3種成分分離、定量等的影響。結(jié)果顯示選擇乙腈-水體系時(shí)，柚皮苷色譜峰峰型較差，定量結(jié)果準(zhǔn)確性偏低；選擇乙腈-0.5%磷酸體系時(shí)，3種成分分離效果、峰型均較好，定性、定量結(jié)果準(zhǔn)確。

3.3 提取溶劑的選擇

柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛均易溶于甲醇，2020版《中國(guó)藥典》中骨碎補(bǔ)和桂枝藥材中的柚皮苷和桂皮醛采用甲醇提取，淫羊藿藥材中的淫羊藿苷采用稀乙醇提取。其中柚皮苷、淫羊藿苷在甲醇中穩(wěn)定，有研究表明桂皮醛在甲醇中有微弱分解[20]。取已知含量的尪痹顆粒（批號(hào)：190312）樣品，研細(xì)混勻，取1.0 g精密稱(chēng)定，置25 mL棕色容量瓶中，以甲醇作為提取溶劑，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理，制備供試品溶液，于室溫下分別放置0、6、12、24 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣1次，按色譜條件分別進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示4次檢測(cè)結(jié)果平均RSD為2.07%，表明甲醇超聲提取檢測(cè)桂皮醛方法是穩(wěn)定可行的。

3.4 提取方法的優(yōu)化

尪痹顆粒是由17味藥材組成，基質(zhì)中含有的藥材種類(lèi)多，較為復(fù)雜，前處理方法的優(yōu)化，對(duì)于提高分析效率和檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性有重要影響。取“2.9”項(xiàng)下3批次尪痹顆粒供試品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法，分別設(shè)定提取時(shí)間為15、20、25、30 min，結(jié)果顯示提取時(shí)間設(shè)定在25 min以上時(shí)，待測(cè)物的提取量基本無(wú)變化；分別設(shè)定超聲功率為250、280、300、320、350 W，結(jié)果顯示設(shè)定提取功率為300 W以上時(shí)，待測(cè)物的提取量基本無(wú)變化，故實(shí)驗(yàn)提取方法設(shè)定超聲功率為300 W，時(shí)間為25 min。

綜上，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)尪痹顆粒分析了現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)目存在的不足，建立了采用甲醇超聲提取，HPLC法定量檢測(cè)尪痹顆粒中的柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛3種成分的分析方法?？疾炝朔椒ǖ膶?zhuān)屬性、線性、穩(wěn)定性等參數(shù)，結(jié)果顯示與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法比較，此方法分析時(shí)間短、效率高，彌補(bǔ)了單一指標(biāo)成分含量測(cè)定作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的不足，能夠?yàn)槿姹O(jiān)測(cè)該產(chǎn)品的質(zhì)量水平及完善國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)參考。