非洲豬瘟診斷技術(shù)研究進(jìn)展

苗 春，李 偉，楊思成，邵軍軍，?；菔|

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，OIE/國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的一種急性、高度接觸性、高致病性傳染病。ASFV 是非洲豬瘟病毒科的唯一成員，也是目前已知的唯一DNA 蟲媒病毒。ASFV 基因組是一個(gè)大型線狀雙鏈DNA 分子，主要在單核巨噬細(xì)胞及網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞中復(fù)制，長(zhǎng)度為170～190 kbp，編碼150 多種蛋白，包含中間保守區(qū)和兩端可變區(qū)[1]。根據(jù)p72 蛋白編碼基因（B646L）末端約500 bp 核苷酸的差異，已鑒定出24 種ASFV 基因型[2]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將ASF 列入須通報(bào)動(dòng)物疫病名錄，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病[3]。目前暫無(wú)有效疫苗來(lái)預(yù)防該病。感染ASFV 會(huì)產(chǎn)生各種綜合癥，從最急性、急性到慢性，以及無(wú)癥狀的病毒攜帶，最主要臨床特征表現(xiàn)為高熱、出血和全身皮膚發(fā)紺壞死，尸體剖檢可見脾臟充血、腫大，淋巴結(jié)、肝臟和腎臟出血等。這些臨床特征及病理變化與豬瘟（CSF）、豬皮炎和腎病綜合征（PDNS）以及豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）尤為相似，難以鑒別，所以需要借助實(shí)驗(yàn)室診斷來(lái)確診[4]。

本文綜述了目前應(yīng)用的ASFV 檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)各種方法優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行比較分析，同時(shí)探討了未來(lái)診斷技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)，以期為我國(guó)ASF 防控提供技術(shù)參考。

1 ASF 病原學(xué)檢測(cè)

1.1 病原檢測(cè)

1.1.1 病毒分離鑒定 ASFV 感染動(dòng)物后，主要在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）中復(fù)制，并通過(guò)淋巴系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)擴(kuò)散到肝、腎等器官。《OIE 陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊(cè)》要求，ASFV 分離必須在BSL-3 及以上生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，且需要從血液、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)和扁桃體等組織樣本中分離病毒，用于下一步的實(shí)驗(yàn)室診斷。

1.1.2 紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（haemadsorption test，HAD） 紅細(xì)胞吸附性是在1960 年由Malmquist和Hay 首次發(fā)現(xiàn)的。ASFV 會(huì)粘附于豬的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞表面，產(chǎn)生特征性的“玫瑰花環(huán)”現(xiàn)象。采集發(fā)病豬的血液或組織懸液接種到豬原代骨髓細(xì)胞（PBM）、原代白細(xì)胞或肺泡巨噬細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，6 d 后確定結(jié)果。通常，如果樣本呈強(qiáng)烈陽(yáng)性，則會(huì)在培養(yǎng)后24～48 h 出現(xiàn)血液吸附而形成特征性的“玫瑰花環(huán)”現(xiàn)象。為防止非特異性的紅細(xì)胞吸附，培養(yǎng)基中需添加豬血清或血漿[5]。雖然該方法敏感性高、成本低，但需要進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，時(shí)間周期長(zhǎng)，而且現(xiàn)已分離出少量“非血吸附”的ASFV，其中大多數(shù)是低毒性的，不產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，所以HAD 不再是檢測(cè)ASFV 的首選方法，一般將HAD 與病毒分離鑒定作為ELISA、PCR 或FAT 陽(yáng)性結(jié)果確認(rèn)的參考試驗(yàn)[6]。

1.2 核酸檢測(cè)

1.2.1 PCR PCR 全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，由變性、退火、延伸3 個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR用于檢測(cè)血液、血清或器官樣本中的ASFV 基因組，在ASFV 感染早期就可通過(guò)PCR 檢測(cè)到ASFV。病毒脫氧核糖核酸的小片段可通過(guò)PCR 擴(kuò)增到可檢測(cè)的數(shù)量。該方法快速、敏感性高、特異性強(qiáng)。所有已知基因型的病毒分離株，包括非血液吸附毒株和低毒力分離毒株，都可以用PCR 檢測(cè)，甚至滅活或降解的樣品都可以檢測(cè)。Agüero 等[7]發(fā)現(xiàn)，ASFV 引物集可以與CSFV 的特定引物集相結(jié)合，采用多重反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法，可以在一次反應(yīng)中同時(shí)區(qū)分并檢測(cè)兩種病毒基因組。然而，PCR 敏感性高，樣品稍有交叉污染，就會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。為此，Luo 等[8]基于GenBank 中所有ASFV 毒株VP72基因序列的高度保守區(qū)，設(shè)計(jì)了ASFV 特異性引物，建立了PCR 檢測(cè)方法，并與兩個(gè)OIE 驗(yàn)證的PCR 檢測(cè)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明靈敏性和特異性都高于OIE 推薦的PCR 方法。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR） qPCR 是通過(guò)對(duì)體系中加入的熒光基團(tuán)產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)收集積累，最后用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。與基于凝膠的常規(guī)PCR 方法相比，qPCR 方法具有快速、靈敏度高、不易交叉污染，以及可以定量分析的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為病原學(xué)診斷中應(yīng)用最廣泛的方法。King等[9]首次根據(jù)ASFV 的VP72基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了一種TaqMan qPCR 來(lái)快速檢測(cè)ASFV DNA，靈敏度在10～100 個(gè)分子之間，并針對(duì)不同地區(qū)25 株代表9 個(gè)基因型（I、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X）的ASFV 分離株和16個(gè)非洲、歐洲蜱分離株進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)與相關(guān)的豬病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。Zsak 等[10]也基于VP72基因建立了一種實(shí)時(shí)TaqMan PCR 方法，可以通過(guò)使用便攜式檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)獲得檢測(cè)結(jié)果，從而簡(jiǎn)化聚合酶鏈反應(yīng)操作程序。該方法比OIE 推薦的常規(guī)PCR 和qPCR 具有更高的靈敏度。現(xiàn)已成為病原學(xué)診斷中應(yīng)用最廣泛的方法。

1.2.3 多重PCR（multiplex polymerase chain reaction，mPCR） 多重PCR 是在常規(guī)PCR 的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)的，在本身體系結(jié)構(gòu)中增添更多的引物來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增，因目標(biāo)片段之間有著較大的差異性，所以通過(guò)凝膠成像能直接進(jìn)行分析，是一種應(yīng)用范圍更廣、更加有效的PCR 新技術(shù)[11]。Giammarioli 等[12]基于豬瘟病毒（CSFV）、ASFV、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬細(xì)小病毒（PPV）基因組設(shè)計(jì)特異性引物，開發(fā)了一種新的熱啟動(dòng)mPCR 方法，可同時(shí)檢測(cè)豬的多種病毒感染。

1.2.4 微滴數(shù)字PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR） ddPCR是第三代PCR技術(shù)，可以在不使用標(biāo)準(zhǔn)樣品的情況下絕對(duì)定量核酸。它先對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，然后經(jīng)PCR 擴(kuò)增，再對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，最后根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。該方法更精確、更數(shù)字化，靈敏度更高。Wu 等[13]基于ASFVK205R基因的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan 探針，建立了一種準(zhǔn)確、靈敏的ASFV ddPCR 檢測(cè)方法。ddPCR 的最小檢測(cè)限約為10 拷貝/反應(yīng)，而qPCR 的檢測(cè)限為102拷貝/反應(yīng)，因此ddPCR 的檢測(cè)靈敏度是qPCR 的10 倍。

1.2.5 巢氏PCR（nested-PCR） 巢式PCR 涉及兩組引物，用于連續(xù)兩次的聚合酶鏈反應(yīng)，第二組引物用于擴(kuò)增第一批產(chǎn)物中的第二個(gè)靶標(biāo)，一般適用于一些有必要增加靈敏度和/或特異性的PCR反應(yīng)。Basto 等[14]首次建立了一種帶有內(nèi)部對(duì)照的巢式PCR 檢測(cè)方法，用于檢測(cè)不同蜱種中的ASFV DNA。檢測(cè)蜱類中的ASFV 感染狀態(tài)，有助于確定該地區(qū)有無(wú)ASFV 感染。

1.2.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop mediated isothermal amplification，LAMP） LAMP 是 用于DNA 擴(kuò)增的單管技術(shù)，使用兩套或三套引物和一種具有復(fù)制活性、高鏈置換活性的聚合酶，可在15～60 min，60～65 ℃的恒定溫度下擴(kuò)增靶序列，是一種更簡(jiǎn)便、快速、精確，且成本低的擴(kuò)增方法。Wang 等[15]設(shè)計(jì)了針對(duì)ASFVP10基因的LAMP 引物，并用偽狂犬病病毒（PRV）、PCV2、CSFV、PRRSV、PPV 和ASFV 的DNA 或cDNA 驗(yàn)證實(shí)時(shí)LAMP 和可視化檢測(cè)的特異性，證實(shí)LAMP 可以準(zhǔn)確和特異性檢測(cè)ASFV。Zhu 等[16]通過(guò)將Hive-Chip 和LAMP 相結(jié)合，設(shè)計(jì)針對(duì)5 個(gè)ASFV 基 因（B646L、B962L、C717R、D1133L 和G1340L）的LAMP 引物，并將其預(yù)固定在Hive-Chip 中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶基因之間沒有交叉反應(yīng)。該方法無(wú)需核酸提取，不依賴精密儀器，可避免因病毒的單個(gè)基因突變引起的假陰性問題，且靈敏度高、特異性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果可視化。Wang 等[17]根據(jù)ASFVP72基因高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立以中性紅為顯色指示劑的視覺LAMP 檢測(cè)方法，其特異性高，不與其他豬病毒出現(xiàn)交叉反應(yīng)，與OIE推薦的qPCR 方法敏感度相當(dāng)。

1.2.7 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA） RPA 技 術(shù)是由Piepenburg 等[18]在2006 年建立的一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)不需要模板的熱變性，反應(yīng)溫度為37～42 ℃，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間一般為10～20 min。Miao等[19]開發(fā)了一種將ASFVP72基因的 RPA 與側(cè)流檢測(cè)（LFD）相結(jié)合的快速檢測(cè)方法。RPALFD 法對(duì)ASFV 具有高度靈敏性和特異性，并且與CSFV 等其他豬病毒沒有交叉反應(yīng)。哈登楚日亞等[20]建立了ASFV 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)方法。該方法在39 ℃，20 min 內(nèi)可檢測(cè)10 個(gè)拷貝的DNA 分子，并且與CSFV、PCV2、PPV、PRV 都無(wú)交叉反應(yīng)，可用于ASFV 的定性檢測(cè)。Wang 等[21]也將RPA 與LFD 相結(jié)合，開發(fā)了一種用于ASFV 現(xiàn)場(chǎng)診斷的金納米顆粒試紙條，稱為側(cè)向流動(dòng)基因檢測(cè)（lateral flow gene assay，LFGA）。該方法使用尾部引物來(lái)產(chǎn)生一端具有單鏈尾部的雙鏈體。該雙鏈體與金納米粒子（AuNP）標(biāo)記的探針雜交，使標(biāo)記在檢測(cè)探針上的金納米粒子在試紙條的測(cè)試線上顯示紅色帶，即為陽(yáng)性。在較低的反應(yīng)溫度和較短的反應(yīng)時(shí)間下，LFGA 可以特異性區(qū)分ASFV 和CSFV，檢測(cè)限為102拷貝/μL，靈敏度與瓊脂糖凝膠電泳相當(dāng)，整個(gè)操作過(guò)程不需要任何昂貴的儀器，并且快速、特異、操作簡(jiǎn)單，對(duì)ASFV 的早期診斷非常有幫助。目前，隨著CRISPR/Cas 技術(shù)的不斷發(fā)展，已經(jīng)有研究[22]將RPA 和CRISPR/Cas12a相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度，并提供了對(duì)條帶的高靈敏度熒光檢測(cè)。這在實(shí)現(xiàn)多基因檢測(cè)的同時(shí)，為更靈敏、更快速的ASFV 診斷提供了啟示。

1.2.8 交叉引物擴(kuò)增技術(shù)（cross priming amplification，CPA） CPA 是一類等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)，利用交叉引物和探針，能夠在1 h 內(nèi)擴(kuò)增出至少4 個(gè)拷貝的基因組DNA，具有高度特異性。CPA 方法依賴于具有鏈置換活性的DNA 聚合酶，通過(guò)鏈置換進(jìn)行核酸擴(kuò)增。該技術(shù)是我國(guó)首個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核酸擴(kuò)增技術(shù)[23]。Fr?czyk 等[24]基于P72基因，設(shè)計(jì)了一組CPA 引物，可以特異性檢測(cè)豬和野豬血液、血清樣本中的ASFV DNA以及CSFV DNA，無(wú)需提取DNA，無(wú)交叉反應(yīng)性，檢測(cè)靈敏度與qPCR 一致。CPA 高度敏感，可在水浴中進(jìn)行，無(wú)需使用熱循環(huán)器。這種快速檢測(cè)技術(shù)為儲(chǔ)存、運(yùn)輸和銷毀懷疑感染ASFV 病毒的材料提供了更好的生物安全措施[24]。

1.2.9 原位雜交技術(shù)（in situ hybridization，ISH） ISH 就是將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，目前已發(fā)展出熒光原位雜交技術(shù)（FISH）以及多彩色熒光原位雜交技術(shù)（mFISH）。FISH 克服了放射性探針檢測(cè)周期長(zhǎng)且危害人體健康的缺點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基因定位、染色體識(shí)別等研究中。Bentolila 等[25]進(jìn)行了小鼠的量子點(diǎn)熒光原位雜交（QD-FISH），發(fā)現(xiàn)QD-FISH 探針可穿透完整的間期細(xì)胞核和中期染色體，并顯示出對(duì)致密染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域的良好靶向，且空間位阻最小，表明QD-FISH 探針在QD-FISH 應(yīng)用中十分有效。Ballester[26]開發(fā)了一種新ISH 法，使用地高辛標(biāo)記探針，來(lái)鑒定用福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的ASFV 基因組，檢測(cè)效果良好。

1.2.10 生物傳感器技術(shù) 該方法通過(guò)生物識(shí)別元件識(shí)別分析物，然后換能器將生物識(shí)別元件捕獲目標(biāo)分析物后發(fā)生的反應(yīng)轉(zhuǎn)換成等效信號(hào)，最后由檢測(cè)器系統(tǒng)將信號(hào)進(jìn)行處理和分析，從而得到分析結(jié)果[27]。Biagetti 等[28]利用DNA/LNA 探針作為ASFVVP72基因保守區(qū)的互補(bǔ)識(shí)別元件，建立了一種基于生物傳感器的方法來(lái)檢測(cè)豬血液中的ASFV。其檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）分別為178 拷貝/μL 和245 拷貝/μL，該結(jié)果和OIE推薦的qPCR 敏感性相當(dāng)。該方法可用于ASF 的初步診斷及篩檢，具有快速、簡(jiǎn)便、成本低的優(yōu)點(diǎn)。Wu 等[29]將PCR、Cas12a 和側(cè)流生物傳感器（LFB）結(jié)合起來(lái)，基于Cas12a 的生物傳感器靶向不同ASFV 菌株中VP73基因的保守區(qū)域，同時(shí)檢測(cè)7 種不同基因型的ASFV 病毒。該方法具有極高特異性和靈敏性，而且操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低，可以普遍用于檢測(cè)ASFV 和其他病毒。

2 血清學(xué)檢測(cè)

2.1 抗體檢測(cè)

2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） ELISA 是目前血清檢測(cè)最常用的方法，也是OIE 指定的ASF 首選血清學(xué)診斷方法。ELISA 的敏感性、特異性都較高，操作方便快速，適用于檢測(cè)多頭豬樣本，能夠快速檢測(cè)群體中的ASFV 抗體。但是，當(dāng)檢測(cè)樣品發(fā)生降解或在-20 ℃放置太長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，ELISA 檢測(cè)的靈敏度就會(huì)降低。目前，常用作檢測(cè)ASFV 抗原的蛋白有p30、p54、p72、pp62 等。Gallardo 等[30]通過(guò)使用桿狀病毒表達(dá)p30、p54 和pp62 重組蛋白建立的重組ELISA 檢測(cè)方法，不僅顯示出比OIE 推薦方法（ELISA）更高的靈敏度，而且還減少了檢測(cè)出假陽(yáng)性的概率，極大程度提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。Giménez-lirola[31]等基于多重?zé)晒馕⒅榈拿庖邷y(cè)定法（FMIA）對(duì)ASFV 的3 種重組多肽（p30、p54、p72）感染豬后產(chǎn)生的早期血清抗體進(jìn)行比較，以選擇最佳候選抗原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p30 是早期診斷的最佳抗原；通過(guò)表達(dá)ASFV p30蛋白，開發(fā)了一種能夠檢測(cè)血清或口腔液標(biāo)本中ASFV 抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（I-ELISA），其對(duì)兩種樣本類型都具有高度特異性，而且在8 DPI 時(shí)，就可以檢測(cè)到口腔液抗體，與OIE 推薦的I-ELISA 敏感度相當(dāng)。

2.1.2 間接熒光抗體試驗(yàn)（indirect fluorescent anti-body test，IFA） IFA 是一種免疫標(biāo)記技術(shù)，應(yīng)用熒光標(biāo)記的二抗，通過(guò)與抗原抗體復(fù)合物中的抗體結(jié)合而檢測(cè)未知抗原。Heimerman 等[32]通過(guò)對(duì)ASFV 感染的Vero 細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光抗體（IFA）染色，共回收了29 種單克隆抗體（mAb），并對(duì)其中的IFA 陽(yáng)性抗體進(jìn)行進(jìn)一步表征，發(fā)現(xiàn)這些抗體均位于p72 的高度保守區(qū)域內(nèi)，這為開發(fā)新的ASFV 抗體和抗原檢測(cè)方法提供了機(jī)會(huì)。Wu 等[33]開發(fā)了一組針對(duì)ASFV p30 的mAb，并對(duì)其中的14 種進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)IFA 等方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這些抗原區(qū)域3 和4 在宿主抗體反應(yīng)中高度保守并具有免疫優(yōu)勢(shì)，從而為ASF 血清學(xué)檢測(cè)的開發(fā)和改進(jìn)提供了有價(jià)值的工具。

2.1.3 膠體金快速免疫層析法（gold immunochromatography assay，GICA） GICA 是一種以膠體金標(biāo)記的抗原或抗體作為示蹤標(biāo)志物，以纖維素膜用作載體的免疫標(biāo)記技術(shù)。吳海濤等[34]以硝酸纖維素（NC）膜上分別包被的ASFV p72多克隆抗體和SPA 作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，制備了用于檢測(cè)ASFV 的膠體金免疫試紙條。該試紙條在10 min 內(nèi)就可以檢測(cè)出陽(yáng)性抗原，敏感性和特異性良好，而且具有高度穩(wěn)定性，在ASFV 臨床檢測(cè)中有良好的應(yīng)用前景。

2.1.4 免疫印跡法（immunoblotting test，IBT） IBT 通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分待測(cè)樣品不同組分，在電流作用下，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上，通過(guò)特異性抗體作為探針，對(duì)靶抗原蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析。Alcaraz 等[35]在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白p54，首次建立了ASFV 重組蛋白的IBT 法。該法對(duì)檢測(cè)感染豬的ASFV 具有高度的特異性和敏感性，而且消除了因抗原中含有細(xì)胞蛋白從而產(chǎn)生的假陽(yáng)性，并避免了在抗原生產(chǎn)中使用活病毒。

2.2 抗原檢測(cè)

2.2.1 熒光抗體試驗(yàn)（fluorescent antibody test，F(xiàn)AT） FAT 是檢測(cè)抗原的一種輔助方法，具有快速、方便、敏感、特異等特點(diǎn)，而且可以鑒別“非紅細(xì)胞吸附”的毒株，也能區(qū)分由ASFV 引起的CPE 和由其他病毒、接種物細(xì)胞毒性產(chǎn)生的CPE，可作為HAD 試驗(yàn)的補(bǔ)充試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)[2]。FAT 需用熒光素對(duì)抗原進(jìn)行標(biāo)記，但對(duì)熒光素的特異性要求較高，非特異性的熒光素染色會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果；對(duì)于急性ASF 檢出率較高，對(duì)于亞急性和慢性ASF 的檢出率僅為40%；對(duì)人員要求較高，需要熒光顯微鏡，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[6]。

2.2.2 抗原ELISA ELISA檢測(cè)的原理為抗體（抗原）被吸附在固相載體表面，樣品中的抗體或抗原與其結(jié)合形成復(fù)合物，酶標(biāo)抗體再與該復(fù)合物結(jié)合，根據(jù)加入底物后顏色反應(yīng)判定結(jié)果。Vidal 等[36]基于抗vp73 單克隆抗體建立了一種用單克隆抗體檢測(cè)豬樣品中ASFV 蛋白的改良固相ELISA，檢測(cè)到vp73 的最低抗原質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL，低于普通ELISA 試驗(yàn)檢測(cè)最極限（0.5 μg/mL）。

2.2.3 側(cè)向流動(dòng)免疫色譜分析（lateral flow assay，LFA） LFA 又稱“試紙條”測(cè)定方法，是近幾年來(lái)發(fā)展比較迅速的試紙條快速檢測(cè)技術(shù)，其以條狀纖維層析材料為固相，借助毛細(xì)管的吸附作用使樣品在層析材料上移動(dòng)，樣品中的待測(cè)物與層析材料上一定區(qū)域的配體發(fā)生特異性的免疫結(jié)合反應(yīng)，可通過(guò)目測(cè)標(biāo)記物的顯色反應(yīng)短時(shí)間獲得直觀的測(cè)試結(jié)果[37-38]。Sastre 等[39]基于ASFV vp72 蛋白的單克隆抗體建立的一種用于抗原檢測(cè)的LFA，其靈敏度與市售抗原ELISA 試驗(yàn)相當(dāng)。該法具有快速、特異、經(jīng)濟(jì)且易于使用的優(yōu)點(diǎn)。此外，該法可直接用于檢測(cè)血液，非常適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)設(shè)施不足甚至缺乏的場(chǎng)所。

2.3 常用檢測(cè)技術(shù)比較

目前ASFV 常用檢測(cè)方法主要表現(xiàn)在病原、核酸、抗原與抗體4 個(gè)方面，其中病原檢測(cè)主要有紅細(xì)胞吸附和病毒分離方法，核酸檢測(cè)主要通過(guò)普通PCR、qPCR 與RPA 等方法，抗原檢測(cè)常用抗原ELISA 與LFA 等，而抗體可通過(guò)GICA、ELISA、IFA 與IBT 等方法檢測(cè)（表1）。每種診斷技術(shù)都有其特點(diǎn)，可為不同情況下的ASFV 診斷提供多種選擇。qPCR 敏感性高、特異性強(qiáng)，可以快速對(duì)ASFV 進(jìn)行定量分析，是診斷ASFV 感染最可靠的“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]，但是需要專業(yè)人員操作而且對(duì)設(shè)備要求高。mPCR 可以同時(shí)檢測(cè)及區(qū)分ASFV 及多種病毒感染，節(jié)約了大量時(shí)間，但操作步驟繁瑣。LAMP 技術(shù)是一種特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)單易用且經(jīng)濟(jì)高效的ASFV 核酸檢測(cè)手段，可在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可以立即用肉眼觀察到，但是操作過(guò)程中易造成氣溶膠污染，形成假陽(yáng)性。抗原ELISA 可用作檢測(cè)豬群體ASFV 抗體，操作簡(jiǎn)便快速，但敏感性低于PCR。LFA 是近年來(lái)發(fā)展迅速的新檢測(cè)方法，具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低的優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及一些缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)設(shè)施的場(chǎng)所，具有很好的應(yīng)用前景，但該方法不能對(duì)抗原絕對(duì)定量而且需要兩個(gè)抗原表位。

表1 ASFV 常用檢測(cè)方法及其優(yōu)缺點(diǎn)

3 展望

ASF 給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了沉重打擊，而且2021 年以來(lái)，在我國(guó)又出現(xiàn)了變異毒株，使ASFV防控愈加困難。目前，OIE 批準(zhǔn)的診斷方法主要包括病毒分離、FAT、ELISA、IFA、PCR 和IBT。這些方法往往需要昂貴的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和熟練的技術(shù)人員，并且在現(xiàn)有的診斷技術(shù)中，缺乏能鑒別ASFV病理變化的病原學(xué)診斷方法。而快速、簡(jiǎn)便、可靠的ASF 診斷和監(jiān)測(cè)方法對(duì)于控制ASF 格外重要。CRISPR 技術(shù)[40-45]與RPA 結(jié)合是目前發(fā)展較快的檢測(cè)技術(shù)，具有良好的發(fā)展?jié)摿Γ軐z測(cè)靈敏度提高10 倍，但卻增加了更多的反應(yīng)時(shí)間，因此縮短反應(yīng)時(shí)間是今后新的研究方向。在今后的發(fā)展中，不同診斷技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用也將成為未來(lái)診斷技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)。