M2型腫瘤相關巨噬細胞在胰腺癌組織中的表達及其與預后的關系*

陳凱，廖芮，楊洪吉，朱世凱，楊沖，董丹丹，李科，李有贊

610072 成都，四川省人民醫(yī)院，電子科技大學 器官移植中心(陳凱、楊洪吉、朱世凱、楊沖)，病理科(董丹丹、李科)； 646099 四川 瀘州，西南醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院(廖芮、李有贊)

胰腺癌臨床表現(xiàn)隱匿、早期診斷困難、臨床預后極差，且全球范圍內發(fā)病人數(shù)和病死率呈不斷上升的趨勢[1-2]，其中位生存時間6～9個月，1年生存率約18%，5年生存率僅約5%[3-4]。胰腺癌的病因及生物學行為復雜，探討胰腺癌侵襲及轉移過程的有關分子機制，對提高胰腺癌的治療效果具有重要的理論及臨床意義。巨噬細胞是機體固有免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，通過直接殺傷或誘導機體免疫應答的方式清除腫瘤細胞，廣泛參與體內固有免疫和適應性免疫[5]。然而巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中也可發(fā)揮負向調控作用，可促進腫瘤細胞生長、抑制T淋巴細胞和NK細胞抗腫瘤活性，在腫瘤侵襲和轉移中起重要作用，將其稱之為腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)[6-7]。根據(jù)細胞自身及活化微環(huán)境的多樣性，TAMs又分為經(jīng)典活化的巨噬細胞型M1型(抗腫瘤)和替代激活的M2型(促腫瘤)[8]。然而M2型TAMs在胰腺癌侵襲轉移中的作用機制尚不明確，本研究通過免疫組織化學的方法，分析胰腺癌組織中巨噬細胞的表達及其與臨床病理特征之間的關系，探討其對患者預后的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象來自2017年1月至2019年12月在四川省人民醫(yī)院器官移植中心接受手術治療的208例胰腺導管腺癌患者。納入標準：1)術后病理證實為胰腺導管腺癌；2)在我院首治患者，且術前未進行過放療、化療及抗炎治療等；3)行胰十二指腸切除術或胰體尾切除術；4)患者臨床病理及術后隨訪資料完整。本研究全部患者的知情同意均已獲得，且通過了四川省人民醫(yī)院倫理委員會的審查，符合倫理學要求。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 通過病案管理系統(tǒng)采集患者入院時的基線資料，包括性別、年齡、既往疾病史等，記錄患者臨床病理特征，包括手術方式、腫瘤部位、臨床分期、腫瘤病理類型、分化程度、淋巴結轉移、血管侵犯等。

1.2.2 免疫組化染色及結果判定 所有手術標本均常規(guī)石蠟包埋、切片，行免疫組織化學染色，首先采用鼠抗人CD68和CD163單克隆抗體單克隆抗體(北京中杉生物技術有限公司產(chǎn)品)，采用Envision二步法試劑盒和二氨基聯(lián)苯氨(DAB)顯色試劑盒(福州邁新生物技術開發(fā)有限公司產(chǎn)品)按照說明書進行操作。結果判斷：采用半定量法，在低倍視野下找到10個CD68和CD163陽性細胞聚集最多的熱點區(qū)域，在高倍視野下對熱點區(qū)域的TAMs細胞進行計數(shù)，并根據(jù)染色程度和著色細胞百分比進行結果判定。染色程度：不著色計0分、淡黃色計1分、棕黃色計2分、棕褐色計3分；著色陽性細胞占計數(shù)細胞百分比<5%計0分、5%～25%計1分、>25%～50%計2分、>50%計3分；將兩項得分相加作為總分，總分0～1分為陰性(-)、2～3分為低表達(+)、4～5分為中表達(++)、6分為高表達(+++)，統(tǒng)計時將低、中、高表達歸入陽性表達組。

1.2.3 隨訪 術后采用電話隨訪、門診復診的方式對患者術后生存情況進行隨訪以獲取患者的總生存期(overall survival,OS)，隨訪截止日期為2020年12月31日，OS是指從手術之日起至死亡或隨訪截止時所經(jīng)歷的時間?；颊呔芙^隨訪或因各種原因無法聯(lián)系者視為失訪。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。對符合或近似符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差進行統(tǒng)計描述，組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗；計數(shù)資料采用率或構成比[n(%)]進行統(tǒng)計描述，組間比較采用χ2檢驗；雙向有序變量之間的相關性檢驗采用兩組或多組獨立樣本的秩和檢驗；采用Kaplan-Meier法進行生存分析，生存期的單因素比較采用Log-rank法，采用多因素Cox比例風險回歸模型分析影響患者預后生存的獨立危險因素。以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 臨床病理特征

本研究共納入胰腺導管腺癌患者208例，其中男性92例(44.2%)、女性116例(55.8%)；年齡41～77歲，平均年齡(58.8±7.7)歲；腫瘤部位：胰頭129例(62.0%)、胰體尾79例(38.0%)；分化程度：高分化50例(24.0%)、中分化87例(41.8%)、低分化71例(34.1%)；腫瘤平均大小(3.1±0.6)cm，≤2 cm者67例(32.2%)、>2cm者141例(67.8%)；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期62例(29.8%)、Ⅲ～Ⅳ期146例(70.2%)；淋巴結轉移137例(65.9%)，血管侵犯75例(36.1%)。

2.2 胰腺癌組織中CD68、CD163的蛋白表達

CD68及CD163的蛋白表達主要定位于胞質，兩者染色均呈為棕黃或棕褐色，見圖1、2。CD68和CD163的陽性表達率分別為84.1%(175/208)和76.0%(158/208)。

圖1 胰腺癌組織中CD68的表達(免疫組化染色，×100)

圖2 胰腺癌組織中CD163的表達(免疫組化染色，×100)

2.3 CD68、CD163的表達與臨床病理特征的關系

CD68的陽性表達與腫瘤臨床分期密切相關，腫瘤臨床分期越晚其陽性表達率也越高(P<0.05)；CD163的陽性表達與腫瘤臨床分期、腫瘤大小密切相關，臨床分期越晚、腫瘤越大其陽性表達率也越高(P<0.05;表1)。

表1 CD68、CD163的表達與臨床病理特征的關系

2.4 CD68、CD163雙表達與臨床病理特征的關系

將208例胰腺癌患者依據(jù)其CD68、CD163雙表達情況分為4組：CD68-/CD163-組24例(11.5%)、CD68-/CD163+組62例(29.8%)、CD68+/CD163-組47例(22.6%)、CD68+/CD163+組75例(36.1%)。結果顯示，CD68+和CD163+雙表達與腫瘤臨床分期、腫瘤大小密切相關，臨床分期越晚、腫瘤越大其雙陽性表達率也越高(P<0.05;表2)。

表2 CD68、CD163雙表達與臨床病理特征的關系

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Clinicopathological parameterCD68-CD68+CD163-(n)CD163+(n)CD163-(n)CD163+(n)χ2/ H/ZPTumor site0.833a0.842 Head of pancreas13383048 Tail of pancreas11241727Degree of differentiation0.512c0.774 Highly differentiated8141117 Moderately differentiated9272031 Poorly differentiated7211627Clinical stage-3.454b0.001 I-II11211218 III-IV13413557Lymph node metastasis-0.132b0.895 No9201725 Yes15423050Vascular invasion-0.304b0.761 No14412949 Yes10211826

2.5 影響胰腺癌患者預后生存的單因素及多因素分析

單因素分析顯示，腫瘤大小、臨床分期及CD68、CD163陽性表達均與患者的預后生存相關(P<0.05)。進一步的多因素分析顯示，腫瘤大小>2 cm、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期及CD68陽性表達是影響胰腺導管腺癌患者預后生存的獨立危險因素(P<0.05;表3。)

表3 胰腺癌患者預后生存的單因素及多因素分析

(Table 3 continues on next page)

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FactorUnivariate analysisMultivariate analysisHR(95%CI)χ2PHR(95%CI)χ2PLymph node metastasis No13.6000.05812.9590.085 Yes1.028 (0.996-1.060)1.004 (0.992-1.016)Vascular invasion No12.0580.151 Yes1.468 (0.869-2.481)CD68 Negative11 Positive3.347 (1.518-7.378)10.5070.0012.754 (1.249-6.072)6.3090.012CD163 Negative11 Positive2.121 (1.030-4.368)4.1640.0412.091 (0.926-4.722)3.1480.076

3 討 論

胰腺導管腺癌與其它實體腫瘤一樣，腫瘤間質中包含了很多浸潤性免疫細胞，這其中TAMs占大多數(shù)，然而巨噬細胞具有很大的異質性，在腫瘤微環(huán)境中可作為免疫系統(tǒng)負向調控因素，絕大部分的TAMs被激活為M2型TAMs，抑制T細胞和NK細胞的抗腫瘤活性，產(chǎn)生大量抗炎因子，促進腫瘤細胞的增殖發(fā)展。腫瘤組織內或者癌周浸潤的高密度M2型TAMs往往伴隨著不良的預后。TAMs作為重要的免疫細胞，在胰腺腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉移過程中同樣發(fā)揮著重要作用。Wei等[9]報道，97例非功能性胰腺神經(jīng)內分泌腫瘤TAMs浸潤與術后復發(fā)關系密切，CD68評分高是其復發(fā)的重要預后因素。Song等[10]報道，151例非功能性胰腺神經(jīng)內分泌腫瘤TAMs的高表達與淋巴結轉移、高Ki-67指數(shù)等相關。但目前針對M2型TAMs與胰腺導管腺癌的關系尚不十分明了。

本硏究采用免疫組織化學法檢測由CD68、CD163標記的M2型TAMs在胰腺導管腺癌組織中的浸潤表達情況，發(fā)現(xiàn)CD68和CD163的陽性表達率分別為84.1%和76.0%。王夢一等[11]的研究顯示，CD68、CD163在胰腺癌標本呈現(xiàn)較高的陽性表達率，且主要聚集在腫瘤侵襲的邊緣、淋巴管、血管和神經(jīng)周圍，其陽性表達率與腫瘤大小、臨床分期、血管侵犯、淋巴結轉移密切相關。CD68、CD163是預測腫瘤復發(fā)轉移重要指標，可有效的評估多種腫瘤的復發(fā)風險[12-13]。本研究結果也顯示，CD68、CD163的陽性表達與腫瘤臨床分期、腫瘤大小相關。提示由CD68、CD163標記的M2型TAMs在胰腺癌侵襲、進展、轉移中起重要作用，并與胰腺癌的惡性生物學行為有關，影響胰腺癌患者的預后。

丁軍利等[14]、葉良濤等[15]對M2型TAMs在胰腺腫瘤患者癌組織中的表達及其與臨床病理相關因素進行研究，發(fā)現(xiàn)CD68、CD163都具有較高的陽性表達率，且與腫瘤大小、淋巴結轉移、血管侵犯和臨床分期等相關。本研究中對影響胰腺癌患者預后生存進行單因素及多因素分析顯示，腫瘤大小>2 cm、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期及CD68陽性表達是影響胰腺導管腺癌患者預后生存的獨立危險因素，危險比越大，預后死亡的風險越高。這就可以解釋為何病理分級相同的患者，其預后之間可能存在巨大差異[16]，說明胰腺導管腺癌預后與多種危險因素的綜合影響密切相關[17-18]，除了單純的評估腫瘤本身臨床病理因素外，還需要重點考慮腫瘤微環(huán)境對預后的影響[19-20]。

綜上所述，M2型TAMs在胰腺導管腺癌組織中廣泛浸潤，CD68和CD163的陽性表達與腫瘤臨床分期、腫瘤大小密切相關，腫瘤大小>2 cm、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期及CD68陽性表達是預測胰腺導管腺癌患者預后的獨立危險因素。M2型TAMs可作為胰腺導管腺癌預后的潛在分子標志物。后續(xù)研究中，可以進一步深入研究其相關調節(jié)機制可能為胰腺癌的治療提供新的思路。

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