補(bǔ)陽還五湯對腦缺血大鼠海馬組織circRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的影響

陳博威，唐榮梅，易 健，龍紅萍，劉柏炎*

補(bǔ)陽還五湯對腦缺血大鼠海馬組織circRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的影響

陳博威1，唐榮梅1，易 健2，龍紅萍2，劉柏炎1*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

研究補(bǔ)陽還五湯對腦缺血大鼠海馬組織環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）-微小RNA（microRNA，miRNA）-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的影響，探討其治療腦缺血的作用機(jī)制。運(yùn)用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-Q-TOF/MS）分析補(bǔ)陽還五湯化學(xué)成分；SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、補(bǔ)陽還五湯（5 g/kg）組及丁苯酞組（54 mg/kg）組，除對照組外，其余各組采用大腦中動脈栓塞法復(fù)制腦缺血模型，給予藥物干預(yù)7 d后，采用神經(jīng)行為學(xué)評分、蘇木素-伊紅（HE）染色法及免疫組化法評估補(bǔ)陽還五湯療效，采用競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）芯片篩選差異表達(dá)的circRNAs及mRNAs，通過基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析差異基因參與的主要生物學(xué)過程，采用qRT-PCR法驗(yàn)證基因芯片結(jié)果，最后構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。補(bǔ)陽還五湯中共鑒定出黃芪甲苷IV、芒柄花素、阿魏酸及芍藥內(nèi)酯苷等21個(gè)成分。大鼠腦缺血后出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙及海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，補(bǔ)陽還五湯能部分逆轉(zhuǎn)上述損傷并提高海馬齒狀回區(qū)增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）及巢蛋白（Nestin）蛋白表達(dá)。ceRNA芯片篩選出大鼠腦缺血后有27個(gè)差異表達(dá)的circRNAs和767個(gè)差異表達(dá)的mRNAs，補(bǔ)陽還五湯治療后有70個(gè)差異表達(dá)的circRNAs和692個(gè)差異表達(dá)的mRNAs。構(gòu)建了由7個(gè)circRNAs、9個(gè)miRNAs及15個(gè)mRNAs組成的三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。生物信息學(xué)分析顯示這些靶點(diǎn)可能通過自噬、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路等發(fā)揮作用。補(bǔ)陽還五湯可能通過影響腦缺血大鼠海馬組織的circRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)神經(jīng)再生，涉及多條通路及多個(gè)生物學(xué)過程。

補(bǔ)陽還五湯；腦缺血；環(huán)狀RNA；微小RNA；競爭性內(nèi)源RNA；基因芯片；神經(jīng)再生；黃芪甲苷IV；芒柄花素；阿魏酸；芍藥內(nèi)酯苷

腦缺血具有高發(fā)病率和高致殘率的特點(diǎn)，造成了極大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]，目前西醫(yī)治療腦缺血的臨床效果具有局限性。補(bǔ)陽還五湯是治療缺血性腦卒中的經(jīng)典方劑，其療效已得到循證醫(yī)學(xué)的證實(shí)[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯能通過誘導(dǎo)神經(jīng)再生[3]、促進(jìn)血管新生[4]等，進(jìn)而發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。然而以往研究均基于單一通路或單一靶點(diǎn)，無法系統(tǒng)闡明補(bǔ)陽還五湯治療腦缺血的作用機(jī)制。

與常規(guī)的線性RNA不同，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）特有的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其具有良好的穩(wěn)定性，更難以被降解。研究表明，circRNA在腦梗死的早期診斷和有效治療中發(fā)揮著重要作用[5]。circRNA雖不能直接編碼翻譯蛋白質(zhì)，但是其能充當(dāng)“微小RNA（microRNA，miRNA）海綿”，通過海綿吸附miRNA的方式，間接降低miRNA與下游靶向mRNA的結(jié)合，從而影響靶基因的表達(dá)，即競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）調(diào)控機(jī)制[6]。目前，circRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)已成為研究腦缺血病理生理機(jī)制的熱點(diǎn)[7]。

研究表明，哺乳動物大腦海馬區(qū)域存在靜默的神經(jīng)干細(xì)胞。當(dāng)腦缺血時(shí)，由于微環(huán)境變化激活了神經(jīng)干細(xì)胞，促進(jìn)其增殖并移行至損傷部位，分化成熟為各類神經(jīng)細(xì)胞，重建大腦的組織結(jié)構(gòu)[8]。快速恢復(fù)缺血側(cè)腦組織血流供應(yīng)，促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移、分化和成熟，是促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能重建的有效途徑。因此，本研究擬采用腦缺血模型大鼠，運(yùn)用ceRNA芯片分析補(bǔ)陽還五湯對腦缺血大鼠海馬組織circRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的影響，以期系統(tǒng)探究補(bǔ)陽還五湯治療腦缺血的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（230±10）g，6～8周齡，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級動物房，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號SYXK（湘）2020-0010，室溫22～26 ℃，濕度45%～55%，通風(fēng)，照明晝夜規(guī)律，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。動物實(shí)驗(yàn)通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號ZYFY20201215-1）。

1.2 藥材

黃芪飲片（批號CK20122902）、赤芍飲片（批號NG20112502）、川芎飲片（批號20091001120）、桃仁飲片（批號2020050402）、當(dāng)歸飲片（批號TH20122201）、地龍飲片（批號2020090902）及紅花飲片（批號2020062001）購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院龍紅萍副研究員鑒定分別為豆科植物蒙古黃芪Bunge的干燥根、毛茛科植物川赤芍Pall.的干燥根、傘形科植物川芎Hort.的干燥根、薔薇科植物桃(L.) Batsch的干燥成熟種子、傘形科植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根、鉅蚓科環(huán)毛蚓(E. Perrier)的動物全體、菊科植物紅花L.的干燥花。

1.3 藥品與試劑

丁苯酞軟膠囊（0.1 g/粒，批號H20050299）購自石家莊恩必普藥業(yè)有限公司；動脈栓線購自北京西濃科技有限公司；RNA wait非凍型組織保存液購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑購自美國Life Technologies公司；ceRNA基因芯片由美國Agilent公司定制；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antige，PCNA）鼠抗、即用型SABC試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；巢蛋白（Nestin）兔抗購自英國Abcam公司；對照品黃芪甲苷IV（批號SA8640，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、芒柄花素（批號YZ-1248S，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、阿魏酸（批號SF8030，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、芍藥內(nèi)酯苷（批號SA8140，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 儀器

2100型生物分析儀、G2505C型芯片掃描儀、1290型超高效液相-四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UPLC-Q-TOF/MS，美國Agilent公司）；9700型qRT-PCR儀（美國ABI公司）；5418型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Vectra3智能組織切片成像系統(tǒng)（美國PerkinElmer公司）。

2 方法

2.1 補(bǔ)陽還五湯的制備

將黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁及紅花按120∶6∶4.5∶3∶3∶3∶3混合，加入5倍量蒸餾水浸泡1 h后，武火煎煮0.5 h，文火煎煮1.5 h，使用3層紗布濾過；繼續(xù)加入3倍量蒸餾水后采用相同方法提取濾液，合并2次濾液后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將藥液制備為以生藥量計(jì)2 g/mL的濃縮液，放至冰箱備用。

2.2 對照品溶液的配制

精密稱取適量黃芪甲苷IV、芒柄花素、阿魏酸、芍藥內(nèi)酯苷對照品，分別加甲醇定容在10 mL棕色量瓶中，依次配成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.1、0.1、0.4 mg/mL的對照品儲備液。精密量取各對照品儲備液200 μL，混勻置于進(jìn)樣瓶中備用。

2.3 補(bǔ)陽還五湯的UPLC-Q-TOF/MS分析

2.3.1 補(bǔ)陽還五湯供試品的制備 取10 mL補(bǔ)陽還五湯濃縮液置于50 mL錐形瓶中，加入70%甲醇30 mL，超聲振蕩溶解30 min，靜置后取2 mL溶液，8000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，置于進(jìn)樣瓶中。

2.3.2 色譜及質(zhì)譜條件 參照本課題組前期摸索條件[9]，Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；正離子流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，負(fù)離子流動相為乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液；梯度洗脫：0～10 min，5%～15%乙腈；10～20 min，15%～30%乙腈；20～30 min，30%～70%乙腈；30～40 min，70%～95%乙腈；體積流量為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。質(zhì)譜儀全掃質(zhì)量掃描范圍/90～1500；分辨率為30 000；干燥氣和鞘氣均為氮?dú)?；毛?xì)管電壓為4.0 kV，溫度為320 ℃。

2.3.3 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站的特點(diǎn)，設(shè)置閾值＞90，對補(bǔ)陽還五湯正負(fù)離子模式下采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，并參考相關(guān)文獻(xiàn)及對照品圖譜進(jìn)行成分定性及定量分析[10]。

2.4 模型的制備與評價(jià)

采用Longa等[11]報(bào)道的線栓法復(fù)制大鼠腦缺血模型：大鼠術(shù)前禁食禁水12 h，ip 0.3%戊巴比妥鈉麻醉，取頸正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈，將線栓經(jīng)頸總動脈送入頸內(nèi)動脈，當(dāng)線栓上黑色標(biāo)記點(diǎn)恰好位于頸總分叉時(shí)固定線栓，消毒并縫合皮膚。術(shù)后2 h進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，參照Longa等[11]報(bào)道的方法，1～3分表明造模成功。

2.5 分組與給藥

本課題組前期研究表明補(bǔ)陽還五湯以5 g/(kg·d)干預(yù)療效確切[4]，因此以該劑量進(jìn)行后續(xù)研究。將SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、補(bǔ)陽還五湯（5 g/kg）組及丁苯酞組（54 mg/kg，臨床等效劑量），每組8只。術(shù)后6 h各給藥組ig藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)7 d。所有動物均進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評估，同時(shí)每組隨機(jī)選取3只大鼠進(jìn)行ceRNA芯片分析及qRT-PCR驗(yàn)證，剩余大鼠進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)及免疫組化檢測。

2.6 神經(jīng)行為學(xué)評估

末次給藥后，運(yùn)用Ayelet Levy 14分評分法[12]對大鼠神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評估。

2.7 病理形態(tài)學(xué)檢測

末次給藥后，大鼠ip 0.3%戊巴比妥鈉麻醉，分別用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液、4%多聚甲醛進(jìn)行灌注處理后斷頭取腦，腦組織于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、透明、包埋及切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.8 免疫組化檢測

采用免疫組化法檢測海馬齒狀回區(qū)PCNA及Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量，分別代表增殖細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的情況。腦組織切片依次脫蠟、抗原修復(fù)及封閉，分別加入PCNA、Nestin抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜；分別加入生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠或兔IgG抗體，室溫孵育1 h；常規(guī)DAB染色后用蘇木素復(fù)染并封片，使用智能組織切片成像系統(tǒng)進(jìn)行全片掃描，并從缺血側(cè)海馬區(qū)采集圖像，運(yùn)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算單位面積陽性細(xì)胞數(shù)[13]。

2.9 ceRNA芯片檢測

大鼠麻醉后直接斷頭取腦，冰上迅速分離缺血側(cè)海馬組織，放入預(yù)先盛滿RNA wait液的凍存管中，嚴(yán)格按照操作流程保存，送至上海歐易生物進(jìn)行芯片檢測。采用TRIzol法提取總RNA，RNA濃度及質(zhì)量經(jīng)檢測合格后，擴(kuò)增RNA并轉(zhuǎn)錄成熒光cRNA；然后純化標(biāo)記的cRNA，將50 μL雜交溶液分布在ceRNA微陣列載玻片上，將載玻片放在Agilent雜交爐65 ℃溫育17 h；洗滌，固定和掃描混合陣列，掃描完成后通過Feature Extraction軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的抽提，生成的原始數(shù)據(jù)文件經(jīng)Genespring軟件標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

2.10 基因本體（gene ontology，GO）功能分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將差異表達(dá)的circRNAs母源基因及mRNAs進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析。

2.11 qRT-PCR驗(yàn)證

將ceRNA芯片檢測后的剩余樣本進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。隨機(jī)選取5個(gè)差異表達(dá)的circRNAs，以及5個(gè)與神經(jīng)保護(hù)作用密切相關(guān)的mRNAs：小窩相關(guān)蛋白2（caveolae associated protein 2，）、小窩蛋白3（caveolin 3，）、血管性血友病因子（von willebrand factor，）、WNT家庭成員5B（Wnt family member 5B，）以及B淋巴細(xì)胞瘤-2類似物1（B-cell lymphoma 2 like 1，）。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格參照試劑盒步驟，內(nèi)參基因選用，使用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量，各引物序列詳見表1。

2.12 circRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)先前報(bào)道的方法及篩選條件[14-15]，首先以Pearson系數(shù)＞0.8篩選與差異mRNAs顯著正相關(guān)的circRNAs，隨后運(yùn)用miRBase 22.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測circRNA-miRNA和miRNA-mRNA關(guān)系對，最后以miRNA為橋梁構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。

表1 引物序列

Table 1 Sequences of primers

基因引物序列(5’-3’)片段大小/bp β-actinF: CCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG70 R: TACGTACATGGCTGGGGTGT RNO_CIRCpedia_9127F: CTGAGGGAAGTTTCCATGGTGA172 R: CAGTGCAAAGCCACAAGCAG RNO_CIRCpedia_2223F: CTATGGAGCCGAACTGGATGC121 R: CTTGGCTAGGGCACCAACTTC RNO_CIRCpedia_2904F: TTCTATTGCCACTCTGCTGATG145 R: GTCGAACAATTCACCTCCAGAC RNO_CIRCpedia_9145F: AGAGGAGACGCAGACATAGAC75 R: TGCAATGATGTCTGCTACACTG RNO_CIRCpedia_10080F: TCTCACACTCCGAGCCCAGTT146 R: GGAATCTTGAAGCATGGTAGTTCG Cav3F: GAGGACATTGTGAAGGTGGA87 R: AAAGTGGTGTAGCTCACCC Cavin2F: CACATCTGGATCCTAATGCCT80 R: TGTCACACTCTTCCATATCGT VWFF: GTGAAATGCAAGAAACGGG80 R: TCTCTTAACATTCACCTCTCCA Wnt5bF: AGCACATGTCCTACATCGG138 R: TCTCGGCTACCTATCTGCA Bcl2l1F: GGACAGCATATCAGAGCTTTGAACA88 R: TTGTCTACGCTTTCCACGCA

2.13 統(tǒng)計(jì)分析

采用差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥1.5及＜0.05篩選差異基因[16]。計(jì)量資料均以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來比較多組間均數(shù)，運(yùn)用Graphpad Prism 8作圖軟件分析。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽還五湯化學(xué)成分分析

經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS檢測得到補(bǔ)陽還五湯中各化學(xué)成分保留時(shí)間（R）及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過對采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，共鑒定出黃芪甲苷IV、芒柄花素、阿魏酸、芍藥內(nèi)酯苷等21個(gè)成分，質(zhì)量濃度分別為78.14、46.70、45.60、468.40 μg/mL，見圖1。

3.2 補(bǔ)陽還五湯對腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)及海馬齒狀回區(qū)病理形態(tài)的影響

如圖2-A所示，與對照組相比，模型組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分明顯升高（＜0.01）；與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分明顯降低（＜0.01），補(bǔ)陽還五湯組與丁苯酞組組間無明顯差異，提示補(bǔ)陽還五湯能改善腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分。如圖2-B所示，與對照組相比，模型組大鼠海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)元排列不規(guī)整，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞核固縮；與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯組與丁苯酞組大鼠海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)元排列相對整齊，細(xì)胞間隙減小，核仁清晰。

A-正離子模式 B-負(fù)離子模式 C-混合對照品正離子模式 1-腺嘌呤 2-鳥苷 3-染料木苷 4-苦杏仁苷 5-芍藥內(nèi)酯苷 6-芍藥苷 7-毛蕊異黃酮苷 8-阿魏酸 9-沒食子酰芍藥苷 10-美迪紫檀苷 11-芒柄花苷 12-美迪紫檀苷 13-黃芪異黃烷苷 14-毛蕊異黃酮 15-黃芪甲苷IV 16-黃芪皂苷II 17-芒柄花素 18-大豆皂苷I 19-異黃芪皂苷II 20-棕櫚酸 21-蒿本內(nèi)酯

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01，圖5同

3.3 差異circRNA與富集分析

基于ceRNA芯片，發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血后有17個(gè)差異表達(dá)的circRNAs，其中3個(gè)上調(diào)，14個(gè)下調(diào)；經(jīng)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后，大鼠海馬組織有70個(gè)差異表達(dá)的circRNAs，其中67個(gè)上調(diào)，3個(gè)下調(diào)（圖3-A、B）。對經(jīng)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后差異表達(dá)circRNAs的母源基因進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)GO功能的生物過程主要為細(xì)胞突觸的各類調(diào)控、神經(jīng)遞質(zhì)分泌及細(xì)胞衰老等；細(xì)胞組成主要為細(xì)胞突觸、蛋白質(zhì)復(fù)合物及鈣通道復(fù)合物等；分子功能主要為Rab GTPase蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)末端結(jié)合及離子通道結(jié)合等（圖3-C）；KEGG通路富集分析主要涉及自噬、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路等（圖3-D）。

A-模型組與對照組差異circRNAs的火山圖 B-補(bǔ)陽還五湯組與模型組差異circRNAs的火山圖 C-GO功能富集分析 D-KEGG通路富集分析

3.4 差異mRNA與富集分析

如圖4-A、B所示，大鼠腦缺血后有767個(gè)差異表達(dá)的mRNAs，其中443個(gè)上調(diào)，324個(gè)下調(diào)；經(jīng)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后，大鼠海馬組織有692個(gè)差異表達(dá)的mRNAs，其中236個(gè)上調(diào)，456個(gè)下調(diào)。補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后差異表達(dá)的mRNAs GO功能富集的生物過程主要為G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及內(nèi)吞作用等；細(xì)胞組成主要為細(xì)胞膜、肌球蛋白絲及細(xì)胞間隙連接等；分子功能主要為G蛋白偶聯(lián)受體活性、清道夫受體活性及多糖結(jié)合等（圖4-C）；KEGG通路富集分析涉及細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、血管平滑肌收縮及各類代謝等（圖4-D）。

A-模型組與對照組差異mRNAs的火山圖 B-補(bǔ)陽還五湯組與模型組差異mRNAs的火山圖 C-GO功能富集分析 D-KEGG通路富集分析

3.5 補(bǔ)陽還五湯對腦缺血大鼠海馬齒狀回區(qū)PCNA及Nestin蛋白表達(dá)的影響

基因芯片KEGG主要富集結(jié)果中的自噬及PI3K-Akt信號通路等均與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖及神經(jīng)再生密切相關(guān)[17-18]，因此進(jìn)一步驗(yàn)證補(bǔ)陽還五湯對腦缺血大鼠海馬齒狀回區(qū)PCNA及Nestin蛋白表達(dá)的影響。如圖5所示，對照組大鼠海馬齒狀回區(qū)有極少量的PCNA及Nestin陽性細(xì)胞；與對照組比較，模型組大鼠海馬齒狀回區(qū)PCNA及Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量增加（＜0.01）；補(bǔ)陽還五湯或丁苯酞干預(yù)后，PCNA及Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多（＜0.01），提示補(bǔ)陽還五湯能促進(jìn)腦缺血大鼠缺血海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)神經(jīng)再生。

3.6 差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

通過qRT-PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果（圖6），發(fā)現(xiàn)挑選的5個(gè)circRNAs中、及經(jīng)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后顯著上調(diào)（＜0.05、0.01），經(jīng)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后顯著下調(diào)（＜0.01），經(jīng)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后有上調(diào)趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；另外挑選的5個(gè)mRNAs經(jīng)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后均顯著上調(diào)（＜0.01），結(jié)果均與芯片結(jié)果相似，證明基因芯片結(jié)果具有一定的可靠性。

圖5 補(bǔ)陽還五湯對腦缺血大鼠海馬齒狀回區(qū)PCNA及Nestin蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

3.7 circRNA-miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了進(jìn)一步闡明差異circRNAs的生物學(xué)功能，首先篩選出與差異mRNAs顯著正相關(guān)的circRNAs，接著以miRNA為核心，預(yù)測具有結(jié)合位點(diǎn)的circRNA-miRNA和miRNA-mRNA關(guān)系對，最終構(gòu)建出由7個(gè)circRNA、9個(gè)miRNA及15個(gè)mRNA組成的circRNA-miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)（圖7）。

圓形：circRNA；方形：miRNA；三角形：mRNA；紅色：上調(diào)基因；綠色：下調(diào)基因

4 討論

中醫(yī)學(xué)將腦缺血?dú)w納于“中風(fēng)”范疇，并認(rèn)為氣虛血瘀為中風(fēng)病的基本證候之一[19]。補(bǔ)陽還五湯由清代著名醫(yī)家王清任所創(chuàng)，專用于中風(fēng)氣虛血瘀證的診治。方中重用黃芪，補(bǔ)益元?dú)馐箽馔源傺?；?dāng)歸長于活血，有化瘀而不傷血之妙；佐以赤芍、川芎、紅花、桃仁輔以活血祛瘀，地龍通經(jīng)活絡(luò)，為益氣活血的代表方。臨床研究亦表明補(bǔ)陽還五湯能改善腦梗死患者的血腦屏障，降低缺血再灌注損傷，促進(jìn)腦內(nèi)微血管新生[20]。

中藥湯劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)極其復(fù)雜，僅依靠傳統(tǒng)研究方法無法系統(tǒng)闡明中藥基于“整體觀念”治療的作用機(jī)制。目前，基于基因芯片的高通量檢測手段能夠從整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平探討藥物的治療機(jī)制，并已逐漸用于篩選中醫(yī)證候特異性標(biāo)志物及中藥治療機(jī)制研究[21]。但截至目前，還未見補(bǔ)陽還五湯對腦缺血大鼠海馬組織circRNA-miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的報(bào)道。本研究結(jié)果表明，補(bǔ)陽還五湯能夠改善腦缺血大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分及缺血側(cè)海馬組織的病理形態(tài)，與之前的報(bào)道一致[22-23]。此外，還發(fā)現(xiàn)了70個(gè)差異表達(dá)的circRNAs和692個(gè)差異表達(dá)的mRNAs可能與補(bǔ)陽還五湯抗腦缺血損傷有關(guān)。通過生物信息學(xué)方法，本研究進(jìn)一步構(gòu)建了補(bǔ)陽還五湯影響的腦缺血大鼠海馬circRNA- miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，為揭示補(bǔ)陽還五湯多靶點(diǎn)協(xié)同治療腦缺血的作用機(jī)制提供了新思路。

本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后有70個(gè)差異表達(dá)的circRNAs，其中67個(gè)上調(diào)、3個(gè)下調(diào)。其中經(jīng)過驗(yàn)證的亦被稱為，研究表明可作為ceRNA海綿，形成//金屬基質(zhì)蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）軸，影響VEGFA的表達(dá)，敲除后MMP2與VEGFA表達(dá)下降，而的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了MMP2和VEGFA的表達(dá)降低，并可促進(jìn)血管新生[24]。另外，作為circRNA分子功能的效應(yīng)器，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后共有692個(gè)差異表達(dá)的mRNAs，其中236個(gè)上調(diào)、456個(gè)下調(diào)，并挑選了5個(gè)與神經(jīng)保護(hù)作用密切相關(guān)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。其中、均屬于小窩蛋白家族，細(xì)胞膜小窩為細(xì)胞膜上的特殊凹陷，是各類細(xì)胞信號分子的聚集地，在血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞中有豐富的表達(dá)[25]。本課題組前期系列研究表明，補(bǔ)陽還五湯在腦缺血后能夠通過小窩蛋白調(diào)控VEGF通路[26]、Notch信號通路[27]及PI3K/Akt/哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路[28-29]發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨核細(xì)胞合成和分泌，在腦缺血后與血管密度呈顯著正相關(guān)，已有研究表明補(bǔ)陽還五湯能夠增強(qiáng)腦缺血大鼠的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[23]。歸屬于與神經(jīng)再生密切相關(guān)的WNT信號通路，先前的研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯能在腦缺血后激活海馬區(qū)組織WNT信號通路，減輕腦缺血損傷[30]。為一類癌基因，具有調(diào)控細(xì)胞周期的作用，補(bǔ)陽還五湯類方能夠上調(diào)Bcl2蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡[17]。上述報(bào)道表明補(bǔ)陽還五湯能夠通過多靶點(diǎn)發(fā)揮腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用，也驗(yàn)證了本研究的準(zhǔn)確性。

KEGG通路富集分析進(jìn)一步預(yù)測了差異circRNAs及mRNAs的潛在功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF信號通路與PI3K-Akt信號通路可能與補(bǔ)陽還五湯的抗腦缺血機(jī)制密切相關(guān)。VEGF信號通路是調(diào)控腦缺血后血管生成的經(jīng)典通路，VEGF是胚胎發(fā)生和血管生成過程中血管形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，研究表明VEGF可在細(xì)胞膜上與其受體VEGFR結(jié)合，觸發(fā)磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（phosphorylated extracellular regulated kinase，p-ERK）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）等多個(gè)下游信號，從而促進(jìn)血管生成[31]。已有研究表明補(bǔ)陽還五湯能在腦缺血后上調(diào)VEGF及其受體的表達(dá)，促進(jìn)血管新生，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4]。PI3K/Akt信號通路是參與細(xì)胞增殖、分化及存活的重要通路，有研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后PI3K/Akt信號通路被激活，促進(jìn)多種生長刺激因子的釋放，誘導(dǎo)神經(jīng)再生[32]；而補(bǔ)陽還五湯能通過PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)缺血側(cè)海馬的神經(jīng)發(fā)生，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[33]。PCNA與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，只存在于增殖細(xì)胞中，為細(xì)胞增殖的標(biāo)志物[34]。Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，常被用來標(biāo)記神經(jīng)前體細(xì)胞增殖[35]。本研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后大鼠海馬齒狀回區(qū)PCNA及Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量增加，補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后PCNA及Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加。結(jié)合KEGG通路富集結(jié)果及已有報(bào)道，推測補(bǔ)陽還五湯可能通過多條信號通路促進(jìn)腦缺血大鼠缺血海馬區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)神經(jīng)再生。

目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為，circRNA主要利用自身的miRNA反應(yīng)元件，通過競爭性結(jié)合miRNA的方式，間接減小miRNA對其靶mRNA的抑制作用，從而實(shí)現(xiàn)對生物過程的調(diào)控[6]。因此，本研究構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，以期進(jìn)一步明確相關(guān)circRNA的ceRNA機(jī)制。最終發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可能通過及等7個(gè)circRNAs，靶向海綿吸附、及等9個(gè)miRNAs，間接調(diào)控15個(gè)mRNAs的表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。相關(guān)研究亦證實(shí)了上述部分靶點(diǎn)的作用，如在腦缺血大鼠的血漿及缺血側(cè)腦組織中表達(dá)降低，使用拮抗劑后能減少腦水腫及腦梗塞面積，并抑制細(xì)胞凋亡[36]；是血管新生的抑制分子，下調(diào)的表達(dá)能夠在大鼠腦缺血后促進(jìn)缺血側(cè)半暗帶的血管新生[37]。但針對該三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的具體ceRNA軸，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

綜上所述，本研究探討了補(bǔ)陽還五湯對腦缺血大鼠海馬組織circRNA及mRNA表達(dá)譜的影響，并初步構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，這些差異基因能夠通過多條信號通路等發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of Buyang Huanwu Decoction on circRNA-miRNA-mRNA transcriptional network in hippocampus of rats with cerebral ischemia

CHEN Bo-wei1, TANG Rong-mei1, YI Jian2, LONG Hong-ping2, LIU Bai-yan1

1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China

To reveal the effects of Buyang Huanwu Decoction (補(bǔ)陽還五湯, BHD) on circular RNA (circRNA)-microRNA (miRNA)-mRNA transcriptional network in hippocampal of rats with cerebral ischemia, explore its mechanism for treatment of cerebral ischemia.UPLC-Q-TOF/MS was used to analyze the chemical composition of BHD. SD rats were randomly divided into control group, model group, BHD (5 g/kg) group and butylphthalide (54 mg/kg) group. The middle cerebral artery embolization method was used to replicate cerebral ischemia model in all groups except control group. After 7 d of intervention, neurobehavioral scores, HE staining and immunohistochemistry were used to evaluate the efficacy of BHD, competing endogenous RNA (ceRNA) microarray was used to screen circRNAs and mRNAs differentially expressed. Main biological processes involved in differential genes was analyzed by gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichmen; qRT-PCR was used to validate the gene microarray results. Finally, circRNA-miRNA-mRNA transcriptional network was constructed.A total of 21 compounds including astragaloside IV, dormononetin, ferulic acid and paeonilactone glycosides were identified in BHD. Rats developed neurological dysfunction and hippocampal neuronal cell damage after cerebral ischemia, and BHD could partially reverse the above injury, increase the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Nestin in hippocampal dentate gyrus. The ceRNA microarray identified 27 differentially expressed circRNAs and 767 differentially expressed mRNAs after cerebral ischemia in rats, and 70 differentially expressed circRNAs and 692 differentially expressed mRNAs after BHD treatment. A ternary transcriptional network consisting of seven circRNAs, nine miRNAs and 15 mRNAs was constructed. Bioinformatics analysis showed that these targets may play a therapeutic role through autophagy, vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-protein kinase B (Akt) signaling pathway.BHD may promote the proliferation of hippocampal neural progenitor cells and induce nerve regeneration by affecting circRNA-miRNA-mRNA transcriptional network in the hippocampus of cerebral ischemia rats, involving multiple pathways and multiple biological processes.

Buyang Huanwu Decoction; cerebral ischemia; circRNA; miRNA; ceRNA; gene microarray; nerve regeneration; astragaloside IV; dormononetin; ferulic acid; paeonilactone glycosides

R285.5

A

0253 - 2670(2022)01 - 0143 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.018

2021-09-30

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82074251）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)一流學(xué)科開放基金項(xiàng)目（2021ZYX38）

陳博威（1994—），男，博士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治心腦血管疾病的研究。Tel: (0731)88536925 E-mail: clewaychan@stu.hnucm.edu.cn

劉柏炎（1970—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治心腦血管疾病的研究。Tel: (0731)88536925 E-mail: liubaiyan@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]