土茯苓解重金屬鉛毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的初步研究

李 潔，程 雙，董丹陽(yáng)，彭財(cái)英，王曉敏，劉建群，舒積成*

土茯苓解重金屬鉛毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的初步研究

李 潔1，程 雙1，董丹陽(yáng)1，彭財(cái)英1，王曉敏2，劉建群1，舒積成1*

1. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004

探究土茯苓解重金屬鉛毒性的活性物質(zhì)。以“總提取物-有效萃取部位-有效部位及有效成分”順序逐一追蹤解毒活性成分的研究思路，以急/慢性鉛致小鼠毒性為動(dòng)物模型，以鉛含量、生化指標(biāo)及組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果為指標(biāo)，確認(rèn)土茯苓解鉛毒的活性部位。依據(jù)文獻(xiàn)及前期化學(xué)研究基礎(chǔ)，采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)活性部位進(jìn)行主要成分分析。急性鉛中毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，土茯苓總提物組和醋酸乙酯組小鼠血液、肝和腎臟中鉛含量顯著降低（＜0.05）；血清丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量有所降低（＜0.05），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性有不同程度提高（＜0.05）；小鼠肝和腎損傷程度均有改善。慢性鉛中毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，土茯苓總黃酮低、中、高劑量組小鼠血液、肝和腎臟鉛含量均有下降（＜0.05），且呈劑量相關(guān)性；小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性和肌酐（creatinine，Cr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平均有不同程度地降低（＜0.05），并以土茯苓總黃酮高劑量組最為顯著；小鼠肝和腎損傷程度均有所改善，且土茯苓總黃酮高劑量組組織結(jié)構(gòu)趨近正常。新落新婦苷、落新婦苷、花旗松素、新異落新婦苷、異落新婦苷和黃杞苷6個(gè)黃酮類(lèi)化合物為總黃酮部位的主要成分，占總黃酮的58.89%。土茯苓醋酸乙酯部位對(duì)鉛致小鼠急性毒性有顯著解毒作用，且醋酸乙酯部位優(yōu)于總提物，提示醋酸乙酯部位為土茯苓解鉛毒的有效萃取部位；土茯苓總黃酮具有較好的排鉛作用，對(duì)鉛誘導(dǎo)的肝、腎功能損傷具有一定的保護(hù)作用，且呈劑量相關(guān)性，提示總黃酮為土茯苓解重金屬鉛毒的活性部位。土茯苓總黃酮主要由新落新婦苷、落新婦苷、花旗松素、新異落新婦苷、異落新婦苷和黃杞苷6個(gè)黃酮類(lèi)化合物組成，提示上述化合物可能為土茯苓解鉛毒的活性成分。

土茯苓；總黃酮；解重金屬鉛毒；新落新婦苷；落新婦苷；花旗松素；新異落新婦苷；異落新婦苷；黃杞苷

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，許多重金屬被廣泛使用，人類(lèi)與重金屬接觸是極為普遍的現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致重金屬中毒事件爆發(fā)率大幅度提高，而以鉛中毒尤為突出[1-2]，如2007年盧氏縣“12-12”鉛中毒事件、2009年濟(jì)源數(shù)千名兒童血鉛事件、2011年廣東河源鉛中毒事件等。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，鉛中毒患者每年超過(guò)5萬(wàn)例[3]。另外，重金屬污染致慢性中毒具有不易察覺(jué)的特點(diǎn)，導(dǎo)致報(bào)道中毒患者數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于實(shí)際數(shù)字。重金屬可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，直接導(dǎo)致人的腦細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷，造成兒童智力低下及老年癡呆[4]。重金屬中毒嚴(yán)重干擾患者的健康水平及生活質(zhì)量，尤其對(duì)兒童損害更為深遠(yuǎn)[5]，給患者帶來(lái)不可估量的損失。重金屬中毒已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外健康保障面臨的難題之一，現(xiàn)已造成了廣泛的社會(huì)問(wèn)題，控制其發(fā)生與發(fā)展刻不容緩。尋找重金屬中毒的預(yù)防及治療的有效方法成為生命科學(xué)研究的重點(diǎn)課題之一。而目前臨床應(yīng)用的重金屬解毒劑不能很好地滿足其治療需求，存在以下問(wèn)題[6-8]：①驅(qū)毒作用弱或?qū)Σ糠种亟饘贌o(wú)效；②治療周期長(zhǎng)，一般為1～2年；③在治療過(guò)程中，常伴隨著過(guò)敏、微量元素缺乏、電解質(zhì)不平衡和嚴(yán)重肝腎損害等不良反應(yīng)；④大多有令人難于接受的氣味，口服性較差。因此，研究開(kāi)發(fā)療效好、低毒和療程短的新型解重金屬毒的藥物已是臨床急需所趨。

土茯苓為百合科植物光葉菝葜Roxb.的干燥根狀莖，據(jù)《本草綱目》中記載：“惟土茯苓氣平，味甘而淡……今醫(yī)家治楊梅瘡，不犯輕粉。服輕粉而筋骨攣痛，癱瘓不能動(dòng)履者，服之亦效”“健脾胃，強(qiáng)筋骨，去風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)，止泄瀉，治拘攣骨痛，惡瘡癰腫。解汞粉、銀朱毒”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，土茯苓對(duì)重金屬汞、鉛和砷等均有解毒作用[9-11]，提示土茯苓中可能含有能夠解重金屬毒的成分。然而，其解毒活性成分不清，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明。據(jù)此，本研究選取具代表性的重金屬中毒元素鉛為研究對(duì)象，初步闡明其解毒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為研發(fā)解鉛毒新藥提供理論基礎(chǔ)。

文獻(xiàn)及前期研究結(jié)果顯示，土茯苓具有解重金屬鉛毒性作用[10]，提示土茯苓中可能有拮抗重金屬鉛的有效部位和有效成分；土茯苓中主要化學(xué)成分包括黃酮苷、木脂素和簡(jiǎn)單酚酸，上述成分在中等極性溶劑醋酸乙酯中具有較好的溶解性；二氫黃酮苷類(lèi)衍生物為土茯苓提取物的醋酸乙酯化學(xué)部位的主要成分[12-13]。據(jù)上述結(jié)果本課題組推測(cè)，醋酸乙酯化學(xué)部位可能為土茯苓拮抗鉛毒性作用的有效萃取部位，總黃酮苷可能是其解鉛毒性的有效部位。為了驗(yàn)證上述假設(shè)，本研究采用鉛致小鼠急毒模型，比較土茯苓總提物及其醋酸乙酯萃取部位減毒作用，簡(jiǎn)單快速地證實(shí)醋酸乙酯萃取部位是否為有效萃取部位。再選擇與現(xiàn)實(shí)鉛中毒現(xiàn)狀相符的鉛致小鼠慢毒模型，以鉛含量、生化指標(biāo)及組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果為指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)總黃酮部位的減毒作用，如實(shí)地回答總黃酮是否為有效部位。再結(jié)合化學(xué)成分分析結(jié)果，初步闡明土茯苓解鉛毒的活性成分。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明種小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（贛）2018-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫（20±2）℃、相對(duì)濕度40%～60%、12 h晝夜周期的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)JZLLSC20210026）。

1.2 藥材

土茯苓購(gòu)自廣西省玉林市，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)付小梅教授鑒定為百合科植物光葉菝葜Roxb.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

石油醚（批號(hào)2009261）、醋酸乙酯（批號(hào)A2011201）、甲醇（批號(hào)2008031）、三水合乙酸鉛（批號(hào)2005191）、乙腈（批號(hào)1210131）、甲酸（批號(hào)1502051）、福爾馬林溶液（批號(hào)1710202）購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；超純水購(gòu)自屈臣氏集團(tuán)有限公司；0.9%氯化鈉溶液（批號(hào)20112965）購(gòu)自湖南金健藥業(yè)有限責(zé)任公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號(hào)20200919）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)20200918）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（批號(hào)20200915）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號(hào)20200917）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號(hào)20200916）、肌酐（creatinine，Cr）試劑盒（批號(hào)20200916）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒（批號(hào)20200916）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；30%過(guò)氧化氫（批號(hào)20180822）、硝酸（批號(hào)20200911）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ODS填料（12 nm）購(gòu)自日本YMC公司；對(duì)照品新落新婦苷、落新婦苷、花旗松素、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷為實(shí)驗(yàn)室自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%。

1.4 儀器

超凈工作臺(tái)（無(wú)錫易純凈化設(shè)備有限公司）；Multiskan Go型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；SIGMA3-18K型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；BS224S型萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋（上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；X-HB型旋渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；DB-1AB型加熱板（天津工興實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）；AA240型原子吸收光譜儀（美國(guó)Agilent公司）；LC3000 I型高效液相色譜儀（HPLC，北京鋼臣科技有限公司）；DM2500正置生物顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（南京建成生物工程研究所）。

2 方法

2.1 藥物的制備

2.1.1 土茯苓總提物的制備 取土茯苓藥材500 g，粉碎成小塊，置于圓底燒瓶中，按料液比1∶8加入雙蒸水回流提取3次，分別提取3、2、2 h，濾過(guò)，合并提取液，干燥，得土茯苓總提物83.1 g，計(jì)算提取率為16.6%。再取干燥的浸膏研細(xì)，加超純水溶解成混懸液，即得土茯苓總提物溶液（99.6 mg/mL，折算生藥量6 g/kg）。

2.1.2 土茯苓醋酸乙酯部位的制備 取土茯苓總提物干浸膏80 g，加適量雙蒸水溶解，依次采用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，分別合并萃取液，回收溶劑，得石油醚、醋酸乙酯及正丁醇萃取部位浸膏，稱(chēng)定質(zhì)量，分別為2.4、21.1、9.6 g，計(jì)算得率分別為3.0%、26.2%、12.0%。取少量醋酸乙酯部位浸膏研細(xì)，加入超純水溶解成混懸液，即得土茯苓醋酸乙酯部位溶液（26.1 mg/mL，折算生藥量6 g/kg）。

2.1.3 土茯苓總黃酮的制備 取上述土茯苓醋酸乙酯部位浸膏17.8 g，用25%甲醇水進(jìn)行溶解，以O(shè)DS為填料，25%甲醇水溶液為上樣溶劑沖洗3個(gè)柱體積，收集洗脫液，再用60%甲醇水溶液為洗脫溶劑洗脫3個(gè)柱體積，收集洗脫液，將此部分洗脫液旋干，得土茯苓總黃酮浸膏14 g，計(jì)算得率為78.7%。再取適量總黃酮粉末，用超純水進(jìn)行溶解，制備得低、中、高質(zhì)量濃度（10、20、30 mg/mL）的總黃酮水溶液，分別折算生藥量3、6、9 g/kg。

2.1.4 醋酸鉛水溶液的制備

（1）40 mg/mL醋酸鉛水溶液：精密稱(chēng)取無(wú)水醋酸鉛粉末0.4 g，加10 mL超純水溶解，即得40 mg/mL醋酸鉛水溶液。

（2）0.9 mg/mL醋酸鉛水溶液：精密稱(chēng)取無(wú)水醋酸鉛粉末1.8g，加2 L超純水進(jìn)行溶解，即得0.9 mg/mL的醋酸鉛水溶液。

2.2 土茯苓醋酸乙酯萃取部位解重金屬鉛毒性研究

2.2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥 將48只雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、土茯苓總提物（6 g/kg）組和土茯苓醋酸乙酯（6 g/kg）組，空白組飲用超純水，其余組ip質(zhì)量濃度為40 mg/mL的醋酸鉛溶液（4 mL/kg），1次/d，連續(xù)3 d，建立急性鉛中毒模型。鉛中毒模型建立后，各給藥組ig藥物（10 mL/kg），空白組和模型組ig 0.9%氯化鈉溶液，每天早晚2次，連續(xù)3 d。末次給藥后，禁食不禁水24 h。

2.2.2 血液及肝、腎組織中鉛含量測(cè)定 末次給藥24 h后，每組隨機(jī)取6只小鼠，摘眼球取血于抗凝管中。采用石墨爐原子吸收光譜法[14]測(cè)定血、肝和腎中鉛含量，樣品處理方法如下。

（1）血液樣品的處理：精密吸取各組抗凝血0.5 mL于50 mL錐形瓶中，加入10 mL混合酸[濃硝酸-過(guò)氧化氫（4∶1）]消化，于次日在通風(fēng)櫥中開(kāi)始加熱消解，120 ℃加熱1 h，180 ℃加熱4～5 h，再逐漸升溫至200 ℃，加熱期間不時(shí)觀察燒杯內(nèi)液體顏色和量的變化，若杯內(nèi)液體過(guò)少且呈棕紅色時(shí)，則向杯內(nèi)補(bǔ)加約1～2 mL混合酸，若杯內(nèi)液體變得澄清或略帶黃色，則向杯內(nèi)加入超純水趕酸。待杯內(nèi)白煙冒盡，少量液體為無(wú)色澄清或略顯黃色時(shí)，可取下錐形瓶至室溫后，將杯內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，用1%硝酸溶液沖洗表面皿，同時(shí)潤(rùn)洗錐形瓶3次，將每次的洗液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，最后用1%硝酸溶液定容至刻度，消解液放入4 ℃冰箱保存待測(cè)。同法制備2個(gè)空白樣品。

（2）肝、腎組織樣品的處理：小鼠脫頸椎處死，取肝、腎，去除結(jié)締組織，0.9%氯化鈉溶液洗去血漬，再用濾紙吸干，每組隨機(jī)取6只小鼠肝腎用于測(cè)定鉛含量，于?80 ℃冰箱保存。組織消解方法同血液樣品消解方法一致。

2.2.3 生化指標(biāo)的測(cè)定 每組用于鉛含量測(cè)定后剩余的6只小鼠摘眼球取血，室溫靜置30 min，3000 r/min離心，取血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組血清MDA水平和SOD、GSH-Px活性。

2.2.4 肝、腎組織病理切片觀察 用于鉛含量測(cè)定后剩余6只小鼠脫頸椎處死，取肝、腎組織，用福爾馬林溶液浸泡固定，用蘇木精-伊紅（HE）染色法對(duì)肝、腎組織進(jìn)行染色，切片，觀察肝、腎組織的病理變化。

2.3 土茯苓總黃酮解重金屬鉛毒性研究

2.3.1 造模、分組及給藥 將60只雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和土茯苓總黃酮高、中、低劑量（9、6、3 g/kg）組，空白組小鼠飲用超純水，其余組自由飲用含鉛水溶液（0.9 mg/mL）30 d，建立慢性鉛中毒模型。鉛中毒模型建立后，各給藥組ig藥物（10 mL/kg），空白組和模型組ig 0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)30 d。末次給藥后，禁食不禁水24 h。

2.3.2 血液及肝、腎組織中鉛含量的測(cè)定 按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定。

2.3.3 生化指標(biāo)的測(cè)定 每組中用于鉛含量測(cè)定后剩余的6只小鼠摘眼球取血，室溫靜置30 min，3000 r/min離心，取血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清AST、ALT活性和Cr、BUN水平。

2.3.4 肝、腎組織病理切片觀察 按“2.2.4”項(xiàng)下方法檢測(cè)。

2.4 土茯苓總黃酮的成分分析及含量測(cè)定

依據(jù)文獻(xiàn)和本課題組前期研究結(jié)果，選取分離得到量大的黃酮化合物作為對(duì)照品，進(jìn)行土茯苓總黃酮的成分分析并測(cè)定主要成分的含量。

2.4.1 樣品的制備

（1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取新落新婦苷對(duì)照品5.66 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得新落新婦苷對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密稱(chēng)取落新婦苷對(duì)照品10.59 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得落新婦苷對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密稱(chēng)取花旗松素對(duì)照品9.87 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得花旗松素對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密稱(chēng)取新異落新婦苷對(duì)照品5.05 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得新異落新婦苷對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密稱(chēng)取異落新婦苷對(duì)照品2.01 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得異落新婦苷對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密稱(chēng)取黃杞苷對(duì)照品4.08 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得黃杞苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。

（2）混合對(duì)照品溶液的制備：分取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇定容，即得新落新婦苷、落新婦苷、花旗松素、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷質(zhì)量濃度分別為90.56、169.44、157.92、80.80、32.16、65.28 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

（3）供試品溶液的制備：精密稱(chēng)取土茯苓總黃酮干膏35.0 mg，甲醇溶解，定容于10 mL量瓶中，精密吸取1 mL溶液于2 mL量瓶中，甲醇定容，得1.75 mg/mL的供試品溶液。

2.4.2 成分分析 根據(jù)混合對(duì)照品溶液和供試品溶液的HPLC圖譜，對(duì)比分析土茯苓醋酸乙酯部位中總黃酮的主成分。色譜條件：SP ODS-A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～25 min，15～20% A；25～30 min，20% A；30～35 min，20%～30% A；35～45 min，30%～100% A；45～55 min，100% A；55～60 min，15% A；體積流量為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為室溫；塔板理論數(shù)以落新婦苷峰計(jì)不少于8000。

2.4.3 主要成分含量測(cè)定 采用外標(biāo)兩點(diǎn)法，計(jì)算新落新婦苷、落新婦苷、花旗松素、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷占總黃酮的量。色譜條件：SP ODS-A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（18∶82）；體積流量為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為室溫；塔板理論數(shù)以落新婦苷峰計(jì)不少于8000。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果采用表示。

3 結(jié)果

3.1 土茯苓醋酸乙酯部位解重金屬鉛毒性研究

3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般臨床觀察 小鼠染鉛毒2 d后，毛發(fā)偏黃無(wú)光澤且粗糙毛躁，與空白組相比，模型組小鼠對(duì)外界更為敏感，易受刺激，日常聚集成團(tuán)，飲食量減少，體質(zhì)量增長(zhǎng)減緩。給予藥物進(jìn)行干預(yù)后，各給藥組小鼠鉛中毒癥狀均有不同程度的改善。

3.1.2 各給藥組對(duì)急性鉛中毒小鼠血液、肝和腎組織鉛含量的影響 如表1所示，小鼠急性鉛中毒后，模型組小鼠血液鉛含量超過(guò)400 μg/L，提示造模成功，同時(shí)與空白組相比，小鼠體內(nèi)肝、腎鉛含量顯著升高（＜0.05）。與模型組相比，土茯苓總提物組和土茯苓醋酸乙酯組小鼠血、肝、腎鉛含量均顯著降低（＜0.05）。與土茯苓總提物組相比，土茯苓醋酸乙酯組小鼠血液中鉛含量降低的程度與總提物相當(dāng)，差異沒(méi)有顯著性，但小鼠肝、腎中的鉛含量顯著降低（＜0.05）。結(jié)果表明，土茯苓總提物組及土茯苓醋酸乙酯組均可降低小鼠體內(nèi)鉛含量，且土茯苓醋酸乙酯組的效果優(yōu)于土茯苓總提物組，提示土茯苓中有效成分具有解鉛毒的作用，且多集中在醋酸乙酯部位，故推測(cè)醋酸乙酯部位為解重金屬鉛毒的活性部位。

3.1.3 各給藥組對(duì)急性鉛中毒小鼠的血清生化指標(biāo)水平的影響 如表2所示，與空白組相比，模型組小鼠血清MDA含量明顯增加（＜0.05），GSH-Px、SOD活性明顯降低（＜0.05）。與模型組相比，土茯苓總提物組和土茯苓醋酸乙酯組小鼠血清MDA含量有所降低（＜0.05），GSH-Px、SOD活性均有不同程度地升高（＜0.05）。與土茯苓總提物組相比，土茯苓醋酸乙酯組小鼠血清MDA含量有所降低（＜0.05），GSH-Px、SOD活性有所升高（＜0.05）。結(jié)果表明，土茯苓總提物組及土茯苓醋酸乙酯組對(duì)急性鉛中毒小鼠均具有保護(hù)作用，且土茯苓醋酸乙酯組的作用優(yōu)于土茯苓總提物組。

3.1.4 各給藥組對(duì)急性鉛中毒小鼠肝、腎組織的病理?yè)p傷情況 肝臟肉眼可見(jiàn)模型組小鼠肝臟腫脹、粘連，邊緣鈍圓，顏色稍暗，表面有大小不等的淡白色滲出物附著。其余各組未見(jiàn)異常。病理切片結(jié)果如圖1所示，空白組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)完整，清晰，肝細(xì)胞大小正常，肝索在中央靜脈周?chē)史派錉?，無(wú)異常改變。模型組小鼠肝臟損傷較為嚴(yán)重，中央靜脈旁有較多灰色沉積物，肝血竇增寬，淤血，肝細(xì)胞脂肪變性，部分細(xì)胞核固縮。各給藥組小鼠肝損傷程度均有所改善，土茯苓總提物組小鼠的肝小葉中央靜脈擴(kuò)張，細(xì)胞水腫，有少量點(diǎn)狀壞死。土茯苓醋酸乙酯組小鼠肝小葉周?chē)猩僭S淋巴細(xì)胞聚集，輕微嗜酸樣變性。綜上表明急性鉛中毒對(duì)肝臟具有顯著的損傷作用，同時(shí)推測(cè)土茯苓醋酸乙酯萃取部位有效成分對(duì)鉛中毒所致的肝損傷具有一定的改善作用。

表1 土茯苓醋酸乙酯部位對(duì)急性鉛中毒小鼠血液、肝、腎組織鉛含量的影響(, n = 6)

Table 1 Effect of ethyl acetate part of Smilacis Glabrae Rhizoma on Pb contents in blood, liver and kidney tissues of mice with acute lead poisoning(, n = 6)

組別劑量/(g·kg?1)血鉛/(μg·L?1)肝臟鉛/(μg·g?1)腎臟鉛/(μg·g?1) 空白—49.48±1.590.08±0.020.17±0.06 模型—429.03±58.02*14.43±2.14*30.60±2.49* 土茯苓總提物6145.48±34.32△7.22±0.46△21.03±0.19△ 土茯苓醋酸乙酯6103.72±23.64△3.43±0.51△#12.43±0.61△#

與空白組比較：*＜0.05；與模型組比較：△＜0.05；與土茯苓總提物組比較：#＜0.05，表2同

*< 0.05blank group;△< 0.05model group;#< 0.05total extract fromgroup, same as Table 2

表2 土茯苓醋酸乙酯部位對(duì)急性鉛中毒小鼠血清MDA水平及SOD、GSH-Px活性的影響(, n = 6)

Table 2 Effect of ethyl acetate part of Smilacis Glabrae Rhizoma on MDA level and SOD, GSH-Px activities in serum of mice with acute lead poisoning(, n = 6)

組別劑量/(g·kg?1)SOD/(U·mL?1)MDA/(nmol·mL?1)GSH-Px/(U·mL?1) 空白—191.08±2.631.23±0.16296.61±14.83 模型—152.99±1.79*3.81±0.31*87.36±9.28* 土茯苓總提物6168.29±8.43△2.98±0.12△154.16±21.80△ 土茯苓醋酸乙酯6185.27±1.28△#1.85±0.12△#238.34±37.94△#

圖1 土茯苓醋酸乙酯部位對(duì)急性鉛中毒小鼠肝臟病理變化的影響 (HE, ×200)

腎臟肉眼可見(jiàn)模型組小鼠腎臟顏色稍暗，表面有形狀多樣，大小不等的淡白色滲出物附著。其余各組小鼠腎臟肉眼未見(jiàn)異常。病理切片結(jié)果如圖2所示，空白組腎小球、腎小管未見(jiàn)異常，腎血管無(wú)擴(kuò)張充血。模型組小鼠近曲小管不規(guī)則，管腔嚴(yán)重?cái)U(kuò)張，小管細(xì)胞空泡變性，少量細(xì)胞脫落，細(xì)胞管型；腎小球增大，細(xì)胞間質(zhì)水腫，有出血現(xiàn)象，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生。各給藥組小鼠腎損傷情況有不同程度改善，土茯苓總提物組小鼠腎小管輕微擴(kuò)張，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間質(zhì)水腫。土茯苓醋酸乙酯組仍可見(jiàn)少量腎小管囊腔變大，周?chē)I小管疏松。綜上表明急性鉛中毒對(duì)腎臟具有顯著的損傷作用，同時(shí)推測(cè)土茯苓醋酸乙酯萃取部位有效成分對(duì)急性鉛中毒所致的腎損傷具有一定的改善作用。

圖2 土茯苓醋酸乙酯部位對(duì)急性鉛中毒小鼠腎臟病理變化的影響 (HE, ×200)

3.2 土茯苓總黃酮解重金屬鉛毒性研究

3.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般臨床觀察 小鼠染鉛毒初期，毛發(fā)粗糙、無(wú)光澤，活動(dòng)更頻繁，與空白組相比，模型組小鼠對(duì)外界更為敏感，易受刺激，日常聚集成團(tuán)，易怒好斗，飲食量稍有減少，體質(zhì)量增長(zhǎng)減緩。給予藥物進(jìn)行干預(yù)后，各給藥組小鼠鉛中毒癥狀均有不同程度的改善。

3.2.2 各給藥組對(duì)慢性鉛中毒小鼠體質(zhì)量的影響 如圖3所示，與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量下降；給予藥物進(jìn)行干預(yù)后，各給藥組小鼠中毒癥狀有不同程度改善，且體質(zhì)量增長(zhǎng)程度與正常組小鼠無(wú)顯著差異。7周后，小鼠體質(zhì)量接近上限體質(zhì)量，故體質(zhì)量增長(zhǎng)情況趨于平緩。

圖3 土茯苓總黃酮對(duì)慢性鉛中毒小鼠體質(zhì)量的影響

3.2.3 各給藥組對(duì)慢性鉛中毒小鼠血液和肝、腎組織鉛含量的影響 如表3所示，小鼠慢性鉛接觸后，模型組小鼠血液鉛含量超過(guò)200 μg/L，提示造模成功，同時(shí)與空白組相比，模型組小鼠肝、腎鉛含量顯著升高（＜0.05）。與模型組相比，土茯苓總黃酮低、中、高劑量組小鼠血、肝、腎鉛含量顯著降低（＜0.05），且呈劑量相關(guān)性。結(jié)果表明，土茯苓總黃酮可顯著降低慢性鉛中毒小鼠血、肝、腎鉛含量，且土茯苓總黃酮高劑量組效果最優(yōu)。

3.2.4 各給藥組治療慢性鉛中毒小鼠后血清生化指標(biāo)檢測(cè)水平 如表4所示，與空白組相比，模型組小鼠血清ALT、AST活性顯著升高（＜0.05）；與模型組相比，各給藥組小鼠血清ALT、AST活性均有不同程度地降低（＜0.05）；與土茯苓總黃酮高劑量組相比，土茯苓總黃酮中劑量組小鼠血清ALT活性與低劑量組ALT、AST活性均顯著升高（＜0.05）。結(jié)果表明，慢性鉛接觸會(huì)升高小鼠血清ALT、AST活性，損傷肝組織與功能，而土茯苓總黃酮類(lèi)對(duì)鉛誘導(dǎo)的肝損傷具有一定的修復(fù)作用，從而降低小鼠血清ALT、AST活性，且土茯苓總黃酮高劑量組效果最好。

表3 土茯苓總黃酮對(duì)慢性鉛中毒小鼠血液、肝、腎組織鉛含量的影響(, n = 6)

Table 3 Effect of total flavonoids from Smilacis Glabrae Rhizoma on Pb contents in blood, liver and kidney tissues of mice with chronic lead poisoning(, n = 6)

組別劑量/(g·kg?1)血鉛/(μg·L?1)肝臟鉛/(μg·g?1)腎臟鉛/(μg·g?1) 空白—13.01±3.450.04±0.010.12±0.22 模型—265.78±36.44*0.28±0.07*1.14±0.05* 土茯苓總黃酮3187.26±23.84△#0.18±0.05△0.83±0.18△ 6138.94±9.40△#0.16±0.05△0.76±0.16△ 9112.73±9.61△0.11±0.01△0.73±0.23△

與空白組比較：*＜0.05；與模型組比較：△＜0.05；與土茯苓總黃酮（9 g·kg?1）組比較：#＜0.05，表4同

*< 0.05blank group;△< 0.05model group;#< 0.05total flavonoids from(9 g·kg?1) group, same as Table 4

表4 土茯苓總黃酮對(duì)慢性鉛中毒小鼠血清ALT、AST活性及Cr、BUN水平的影響(, n = 6)

Table 4 Effect of total flavonoids from Smilacis Glabrae Rhizoma on ALT, AST activities and Cr, BUN levels in serum of mice with chronic lead poisoning(, n = 6)

組別劑量/(g·kg?1)ALT/(U·L?1)AST/(U·L?1)Cr/(μmol·L?1)BUN/(mmol·L?1) 空白—24.62±2.7939.74±1.1711.38±1.455.94±0.89 模型—44.20±3.30*58.63±2.38*19.35±1.10*11.32±0.95* 土茯苓總黃酮334.19±11.23△#49.75±1.39△#16.05±1.63△#10.06±0.39△# 625.87±0.20△45.23±1.81△#12.54±1.40△9.68±0.49△# 921.53±3.81△40.23±1.63△11.56±0.57△7.21±0.63△

與空白組相比，模型組小鼠血清Cr、BUN水平顯著升高（＜0.05）；與模型組相比，各給藥組小鼠血清Cr、BUN水平均有不同程度地降低（＜0.05）；與土茯苓總黃酮高劑量組相比，土茯苓總黃酮中劑量組小鼠血清BUN水平與低劑量組Cr、BUN水平均顯著升高（＜0.05）。結(jié)果表明，慢性鉛接觸會(huì)升高小鼠血清Cr、BUN水平，損傷腎小球，降低腎臟代謝廢物的能力，而土茯苓總黃酮對(duì)鉛誘導(dǎo)小鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用，且土茯苓總黃酮高劑量組保護(hù)效果最好。

3.2.5 各給藥組對(duì)慢性鉛中毒小鼠肝、腎組織的病理?yè)p傷情況 肝臟病理切片結(jié)果如圖4所示，模型組小鼠肝臟損傷較為嚴(yán)重，肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核固縮、溶解，肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中央靜脈擴(kuò)張，有瘀血，門(mén)匯區(qū)周?chē)芗牧馨图?xì)胞浸潤(rùn)。各給藥組小鼠肝臟損傷程度均有所改善，其中土茯苓總黃酮高劑量組修復(fù)作用優(yōu)于土茯苓總黃酮低、中劑量組，組織結(jié)構(gòu)趨于正常，但仍可見(jiàn)少量點(diǎn)狀壞死。綜上表明慢性鉛中毒對(duì)肝臟具有顯著的損傷作用，同時(shí)土茯苓總黃酮對(duì)慢性鉛中毒所致的肝損傷具有較好的改善作用。

圖4 土茯苓總黃酮對(duì)慢性鉛中毒小鼠肝臟病理變化的影響 (HE, ×200)

腎臟病理切片結(jié)果如圖5所示，模型組腎小球囊腔明顯變大，腎小管擴(kuò)張，管腔不規(guī)則，腎小管上皮細(xì)胞有空泡，且灰色沉積物較多。各給藥組小鼠腎臟損傷程度均有所改善，其中土茯苓總黃酮高劑量組修復(fù)作用優(yōu)于土茯苓總黃酮低、中劑量組，組織結(jié)構(gòu)接近正常，但仍可見(jiàn)瘀血。綜上表明慢性鉛中毒對(duì)腎臟具有顯著的損傷作用，土茯苓總黃酮對(duì)慢性鉛中毒所致的腎損傷具有較好的改善作用。

圖5 土茯苓總黃酮對(duì)慢性鉛中毒小鼠腎臟病理變化的影響 (HE, ×200)

3.3 土茯苓總黃酮成分分析

3.3.1 主要成分特征圖譜分析 根據(jù)混合對(duì)照品溶液和供試品溶液的特征圖譜分析結(jié)果顯示，土茯苓主要有6個(gè)特征共有峰，分別為新落新婦苷、落新婦苷、花旗松素、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷（圖6）。

3.3.2 土茯苓總黃酮6個(gè)主要成分的總含量 如表5所示，新落新婦苷、落新婦苷、花旗松素、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷6個(gè)主要成分在土茯苓總黃酮中占58.89%。

1-新落新婦苷 2-落新婦苷 3-花旗松素 4-新異落新婦苷 5-異落新婦苷 6-黃杞苷

表5 土茯苓總黃酮中6個(gè)主要成分的含量

Table 5 Contents of six main components in total flavonoids from Smilacis Glabrae Rhizoma

成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 新落新婦苷8.20 落新婦苷35.80 花旗松素0.09 新異落新婦苷5.19 異落新婦苷5.46 黃杞苷4.15 合計(jì)58.89

4 討論

本研究采用ip醋酸鉛水溶液構(gòu)建急性鉛中毒小鼠模型，探究土茯苓醋酸乙酯萃取部位（中等極性）解重金屬鉛毒性作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重金屬鉛能夠引起機(jī)體嚴(yán)重的過(guò)氧化損傷，產(chǎn)生大量的MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化物，損傷機(jī)體抗氧化系統(tǒng)，對(duì)肝、腎組織均具有嚴(yán)重的損傷作用。首先通過(guò)比較各組小鼠血液、肝臟和腎臟中的鉛含量發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血鉛含量高于400 μg/L，表明急性鉛中毒小鼠模型造模成功，同時(shí)與空白組小鼠相比，模型組小鼠肝、腎組織中的鉛含量顯著升高；與模型組小鼠相比，各給藥組小鼠血液、肝臟及腎臟中的鉛含量均顯著降低，其中土茯苓醋酸乙酯組小鼠體內(nèi)鉛含量降低的程度更顯著，提示土茯苓醋酸乙酯部位的有效成分具有良好的排鉛作用。其次通過(guò)比較各組小鼠血清生化指標(biāo)水平發(fā)現(xiàn)，各給藥組小鼠血清MDA水平和SOD、GSH-Px活性趨于正常，其中土茯苓醋酸乙酯組小鼠效果顯著，提示土茯苓總提物及醋酸乙酯萃取物對(duì)急性鉛中毒小鼠均具有保護(hù)作用，且醋酸乙酯萃取物的保護(hù)作用優(yōu)于總提物。最后通過(guò)比較肝臟及腎臟病理組織切片發(fā)現(xiàn)，重金屬鉛對(duì)小鼠肝臟及腎臟均有顯著的損傷作用，且對(duì)腎臟的損傷高于肝臟；土茯苓總提物及醋酸乙酯萃取物對(duì)于急性鉛誘導(dǎo)的小鼠肝、腎組織損傷具有一定的修復(fù)作用。綜上，急性鉛中毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)土茯苓解重金屬鉛毒性的有效萃取部位為醋酸乙酯部位。

結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果[13]可知，土茯苓醋酸乙酯萃取部位中黃酮類(lèi)成分為其主要成分，推測(cè)總黃酮成分為解重金屬鉛毒性的有效部位。本研究采用自由飲用含鉛水溶液（0.9 mg/mL）30 d建立慢性鉛中毒模型，探究土茯苓總黃酮有效部位對(duì)慢性鉛中毒小鼠排鉛以及肝、腎功能的保護(hù)作用。結(jié)果表明，慢性鉛接觸會(huì)對(duì)小鼠的肝、腎造成功能性損傷，干擾機(jī)體正常運(yùn)行，影響小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。首先通過(guò)比較各組小鼠血液、肝臟和腎臟中的鉛含量發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血鉛含量超過(guò)200 μg/L，提示慢性鉛中毒小鼠模型造模成功，同時(shí)與空白組小鼠相比，模型組小鼠肝、腎組織中的鉛含量顯著升高；與模型組小鼠相比，土茯苓總黃酮組小鼠血液、肝臟及腎臟中的鉛含量顯著降低，且呈劑量相關(guān)性，表明土茯苓總黃酮類(lèi)成分可顯著降低慢性鉛中毒小鼠血液、肝臟及腎臟中的鉛含量，具有良好的排鉛作用，且總黃酮高劑量組效果最優(yōu)。其次通過(guò)比較各組小鼠血清生化指標(biāo)水平發(fā)現(xiàn)，各給藥組小鼠血清中ALT、AST活性和Cr、BUN水平趨于正常，其中總黃酮高劑量組效果顯著，表明土茯苓總黃酮類(lèi)成分對(duì)鉛誘導(dǎo)的小鼠肝臟及腎臟損傷具有一定的保護(hù)作用，且總黃酮高劑量組的保護(hù)效果最好。最后通過(guò)比較肝臟及腎臟病理組織切片發(fā)現(xiàn)，重金屬鉛對(duì)小鼠肝臟及腎臟均有顯著的損傷作用，且對(duì)腎臟的損傷高于肝臟，與急性鉛中毒模型組表現(xiàn)相同；土茯苓總黃酮對(duì)于慢性鉛誘導(dǎo)的小鼠肝、腎組織損傷具有一定的修復(fù)作用。因此，通過(guò)慢性鉛中毒實(shí)驗(yàn)，可以初步闡明土茯苓解重金屬鉛毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)為總黃酮類(lèi)成分。利用HPLC法分析土茯苓總黃酮中的主要成分及含量，通過(guò)對(duì)比分析混合對(duì)照品和樣品的特征圖譜發(fā)現(xiàn)總黃酮中主要有6個(gè)特征共有峰，分別為新落新婦苷、落新婦苷、花旗松素、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷，且上述6個(gè)化合物的含量占總黃酮的58.89%，由此推測(cè)它們可能是土茯苓解重金屬鉛毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)。但其確切的作用機(jī)制及相關(guān)化合物的活性有待進(jìn)一步研究，本課題組后期將對(duì)土茯苓解重金屬鉛毒性的有效成分進(jìn)行更深入的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Primary investigation for material basis offor detoxification of heavy metal Pb

LI Jie1, CHENG Shuang1, DONG Dan-yang1, PENG Cai-ying1, WANG Xiao-min2, LIU Jian-qun1, SHU Ji-cheng1

1. Key Laboratory of Modern Chinese Medicine Preparation, Ministry of Education, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicines, Nanchang 330004, China 2. Basic Medical College of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

To investigate the active components for relieving the toxicity of heavy metal Pb from Tufuling ().The research order from identifying total extract, effective extraction parts to effective parts and effective components was used. The acute and chronic toxicity induced by Pb mice models were established. The detoxification effects were evaluated by Pb content, biochemical indexes and morphological detection. According to the literature and previous chemical research, HPLC was used to analyze the principal components of the active parts.The results of acute toxicity test showed that compared with model group, Pb contents in blood, liver and kidney of mice in total extract fromgroup and ethyl acetate fraction group were significantly lower than that of model group (< 0.05); The content of malondialdehyde (MDA) in serum was decreased (< 0.05), glutathione peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD) activities were increased (< 0.05); Liver and kidney damages were ameliorated. The results of slow toxicity test showed that compared with model group, Pb contents in blood, liver and kidney of mice in total flavonoids ofgroup were significantly reduced with dose-dependent manner (< 0.05); Alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) activities and creatinine (Cr), blood urea nitrogen (BUN) levels in serum were reduced (< 0.05), and high-dose total flavonoids ofgroup was most significant; Liver and kidney damages in mice were relieved, and tissue structure of high-dose total flavonoids ofgroup showed almost like normal. The main components of total flavonoids were neoastilbin, astilbin, taxifolin, neoIsoastilbin, isoastilbin and engelitin, which account for 58.89% of total flavonoids.Ethyl acetate extraction parts fromshows significant detoxification effect on Pb-induced toxicity in mice, and ethyl acetate extraction part was better than total extract in general, suggesting that ethyl acetate extraction part is the effective extraction part ofto detoxify Pb; Total flavonoids ofshows good lead excretion effect, and shows protective effect on liver and kidney damage induced by Pb with dose-dependent relationship. Besides, total flavonoids ofare mainly composed of six flavonoids including neoastilbin, astilbin, taxifolin, neoisoastilbin, isoastilbin and engelitin, which suggests that these compounds may be the active components ofin relieving Pb toxicity.

; total flavonoids; detoxification of heavy metal Pb; neoastilbin; astilbin; taxifolin; neoisoastilbin; isoastilbin; engelitin

R285.5

A

0253 - 2670(2022)01 - 0117 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.015

2021-09-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81760721）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81760703）；江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20161BAB205219，20181BAB205077）

李 潔（1998—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)。Tel: 15270819030 E-mail: 2236759877@qq.com

舒積成，男，教授。Tel: (0791)87118658 E-mail: shujc210@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]