乙醇的遺傳毒性研究

王天威 張文眾研究員 胡 洋 馬志遠 張夢利

(1.濰坊醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院，山東 濰坊 261000；2.華北科技學院 安全工程學院，河北 三河 065201)

0 引言

乙醇作為一種有機化合物可以作為化工原料、生化試劑、溶劑和助溶劑等，應用非常廣泛。密切接觸乙醇者面臨著醉酒、過敏和中毒等一系列健康問題。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2018年全球酒精與健康狀況報告》中提到，乙醇導致7.2%的人過早死亡，2016年全球因乙醇導致死亡的約300萬人(占全年所有死亡人數的5.3%)。由于乙醇應用廣泛，且會給接觸者帶來眾多健康風險，對長期密切接觸乙醇的從業(yè)人員有可能造成不同程度的機體損傷。目前國內外對于乙醇的遺傳毒性和靶器官實驗研究中，體外研究發(fā)現乙醇可以造成胃黏膜細胞、結腸粘膜細胞和淋巴細胞DNA斷裂。Narendra P.Singh等利用不同年齡段人體原代淋巴細胞作為實驗模型發(fā)現乙醇的代謝產物乙醛可以導致DNA單鏈和雙鏈斷裂。M.A.Kayani等利用體外微核試驗根據染色體著絲點不同發(fā)現乙醇和乙醛通過不同途徑產生遺傳毒性。體內研究發(fā)現乙醇誘導染色體畸變實驗絕大多數表現為陰性，只有極少數微核實驗為陽性，雖然已有少數研究證明乙醇具有遺傳毒性，但總體研究相對較少且不完整。乙醇對職業(yè)人群的影響并不明確。因此，本研究采用體外實驗和體內實驗相結合的方式探索乙醇的遺傳毒性和靶器官，為預防和控制乙醇對職業(yè)人群健康的影響提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：BS224S型電子天平、CR21GII型高速離心機、生物顯微鏡、水浴鍋、IX71型熒光倒置顯微鏡。

試劑和分析系統(tǒng)：胎牛血清、Giemsa染液、甘油、甲醇、無水乙醇。彗星試驗試劑盒、彗星試驗電泳系統(tǒng)、彗星圖像智能分析軟件(Comet A1.0)。

1.2 脫細胞彗星試驗方法

1.2.1 細胞核DNA的制作

細胞核DNA的制作用參考文獻[8]的方法并進一步優(yōu)化。選用未經處理、生長狀態(tài)良好的細胞，用細胞核提取液提取其細胞核。把細胞核懸浮在包埋劑中，濃度調整至10個/ml，按一定的密度固定在平面載體上，去除核膜，做成細胞核DNA板。乙醇直接作用于脫細胞核DNA染毒1h，置于4℃堿性電泳液(PH≥13)解旋30min，20V電泳20min，以尾部DNA含量(簡寫，DNA%)作為分析指標，觀察堿性環(huán)境下乙醇對脫細胞核DNA的影響。該細胞核DNA板的包埋劑即可維持細胞核DNA的完整性(完整性：即維持其圓球形不變，DNA鏈無斷裂)。

1.2.2 乙醇染毒

預先放置制備好的脫細胞核DNA板，將乙醇濃度分別設置為0.00%、0.06%、0.13%、0.25%、0.50%、1.00%、10.00%、25.00%、50.00%、100.00%，共10個組，每組10張載玻片，染毒1h。脫細胞核DNA板的檢測采用脫細胞彗星試驗檢測DNA的斷裂。

1.3 體內彗星試驗和微核試驗方法

彗星試驗參照《哺乳動物體內堿性彗星試驗》(GB 31655-2021)開展。微核試驗參照《哺乳動物紅細胞微核試驗》(GB 15193.5-2014)開展。彗星試驗與微核試驗共用一批動物。

1.3.1 實驗動物與場所

實驗動物：無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級SD大鼠100只，雌雄各半。體重200±20g，出生后天數(Postnatal Day，PND)42天，發(fā)育表現正常。購買的動物進入實驗室后適應環(huán)境3天，適應期進行檢疫和觀察，期間自由飲水和攝食。

實驗場所：濰坊醫(yī)學院科技樓C醫(yī)學實驗動物中心。

1.3.2 動物染毒劑量、方法和分組

實驗動物隨機分為5組，每組20只，雌雄各半。陰性對照組為水，陽性對照組為每千克體重40mg(40mg/kg bw)環(huán)磷酰胺(CP)，乙醇劑量組(低、中、高)按2倍倍比關系稀釋，分別為1、2、4g/kg bw。2次給受試物間隔24h，第2次給受試物后6h，動物取材開展彗星試驗和骨髓微核試驗。

1.3.3 靶器官單細胞懸液制備

肝臟單細胞懸液制備：取1cm肝臟剪碎后放入離心機低速離心，棄上清制成細胞懸液。

骨髓單細胞懸液制備：剪取股骨，于臀肌粗隆處剪去一端露出骨髓，用Hank's液將骨髓沖出。

外周血單細胞懸液制備：使用毛細管眼眶靜脈叢取外周血1ml，加入乙二胺四乙酸二鈉抗凝全血。采樣后立即進行制片處理，減少間隔時間，并保證每個樣品從取樣到制片間隔時間一致。

1.3.4 樣品的處理順序

樣品做平行處理，即不同劑量組動物隨機選擇每組各一只采樣，每張載玻片上各組樣品隨機排放。

1.3.5 制片、裂解、解旋及電泳

單細胞懸液10μl加入70μl上樣膠(0.5%低熔點瓊脂糖)滴加在已經鋪有第1層瓊脂糖的彗星試驗專用載玻片上，立即蓋上蓋玻片，置4℃冰箱10min固化，移去蓋玻片；再滴加70μl上樣膠作為第3層。每個標本制2-3張玻片，放置備用。裂解液提前放入4℃冰箱至少30min。將玻片浸入預冷的細胞裂解液中，裂解液應沒過玻片，放置于4℃冰箱避光裂解4h。裂解完成后，從裂解液中取出載玻片，用純水漂洗3次，每次5min，去除過多的鹽。再將玻片置于水平電泳槽中，緩緩加入新鮮配制的電泳緩沖液，使液面高于載玻片2mm，把電泳槽置于4℃冰箱中，避光解旋20min。取出電泳槽，調節(jié)電壓為20V，電泳20min。電泳完畢，取出載玻片，用中和緩沖液漂洗3次，每次5min。

1.3.6 染色、拍照和分析

滴加Gelred熒光染料避光染色，約2min。在熒光顯微鏡下，用10×10倍數閱片。選擇玻片同一密度的幾個區(qū)域，以確保沒有重疊的尾，避免在玻片的邊緣進行評分?？梢杂^察到DNA碎片從細胞的“頭”移到“尾”，彗頭為圓形、邊緣光滑整齊，彗尾緊隨彗頭之后，呈散點狀拖尾。彗星拖尾的長度與DNA的損傷程度相關。對所有玻片進行獨立編碼和盲號閱片。用CometA1.0專業(yè)軟件定量分析。每只動物分析200個細胞的尾部DNA%。

1.3.7 骨髓微核試驗方法

取單側股骨并用Hank's液沖洗骨髓離心棄上清制備骨髓細胞懸液。將小牛血清滴于載玻片上與骨髓細胞懸液混勻，手工涂片并放入甲醇固定。固定好的樣本經Giemsa應用液染色。鏡檢計數：選擇細胞完整、分散均勻，著色適當的區(qū)域，每只動物在油鏡下計數200個嗜多染紅細胞(Polychromatic Erythrocytes，PCE)和正染紅細胞(Normochromatic Erythrocyte，NCE)計算PCE所占比例，并觀察計數至少2 000個PCE，觀察微核(Micronuclei，MN)發(fā)生率。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 脫細胞彗星試驗

脫細胞堿性和中性彗星試驗結果，見表1。乙醇濃度從0.00%～100%染毒，脫細胞核DNA彗星尾部DNA%與對照組相比無差異(

P

>0.05)。

表1 脫細胞彗星試驗結果

2.2 體內彗星試驗

2.2.1 骨髓彗星試驗

骨髓堿性彗星試驗結果，如圖1。乙醇低劑量組、中劑量組和陽性對照組尾部DNA%明顯高于對照組(

P

<0.05)，高劑量組尾部DNA%與對照組相比無差異(

P

>0.05)。雄性和雌性大鼠骨髓細胞尾部DNA%相比無差異(

P

>0.05)。骨髓中性彗星試驗結果，如圖2。陽性對照組尾部DNA%明顯高于對照組(

P

<0.05)乙醇各劑量組尾部DNA%與對照組相比無差異(

P

>0.05)。

注：堿性彗星試驗，雄性大鼠低、中、高劑量組和陽性對照組與溶劑對照組相比P值分別為0.001*、0.001*、0.485、0.001*堿性彗星試驗，雌性大鼠低、中、高劑量組和陽性對照組與溶劑對照組相比P值分別為0.001*、0.001*、0.738、0.001*中性彗星試驗，雄性大鼠低、中、高劑量組和陽性對照組與溶劑對照組相比P值分別為0.984、0.825、0.657、0.001*中性彗星試驗，雌性大鼠低、中、高劑量組和陽性對照組與溶劑對照組相比P值分別為0.987、1.000、0.980、0.001**與溶劑對照組比較，P<0.05

圖2 大鼠骨髓細胞堿性彗星圖片

2.2.2 肝臟彗星試驗

肝臟堿性彗星試驗和中性彗星試驗，見表2。乙醇各劑量組尾部DNA%與對照組相比無差異(

P

>0.05)。

表2 大鼠肝臟細胞彗星試驗結果

2.2.3 外周血彗星試驗

外周血堿性彗星試驗和中性彗星試驗結果，見表3。乙醇各劑量組尾部DNA%在與對照組相比無差異(

P

>0.05)。

表3 大鼠外周血細胞彗星試驗結果

2.3 骨髓微核試驗

骨髓微核試驗結果，見表4。乙醇各劑量組PCE/NCE比值與對照組相比無差異，陽性對照組PCE/(PCE+NCE)比值與對照組比值之差小于20%。乙醇各劑量組MN率與對照組相比無差異(

P

>0.05)，陽性對照組MN率明顯高于對照組(

P

<0.05)。

表4 骨髓微核試驗結果

3 討論

脫細胞彗星試驗是基于去除細胞膜和核膜形的細胞核DNA作為模型與受試物直接反應，避免細胞膜和核膜阻礙受試物。本研究以脫細胞核DNA為模型觀察乙醇造成的DNA損傷，為乙醇的遺傳毒性識別提供快捷、高效的分析方法。脫細胞彗星試驗結果顯示，乙醇無法直接導致DNA鏈斷裂的作用。不排除乙醇和DNA形成了加合物/交聯物，導致DNA彗尾無法形成。本課題組之前已成功建立脫細胞、肝臟和外周血細胞彗星試驗陽性對照模型，故本實驗沒再重復。

注：*與溶劑對照組比較，

P

<0.05

肝臟是乙醇代謝的主要場所，90%以上的乙醇經由肝臟進行降解清除。乙醇是一種已知致癌物，其機制與乙醇的代謝產物乙醛，以及乙醇所誘導的氧化應激反應有關。還可以通過甲基化與活性氧誘導表觀遺傳。乙醇在體內通過乙醇脫氫酶生成乙醛，在內質網上生成損害機體的活性氧，當攝入過量乙醇時，來不及代謝的乙醇及其代謝產物經由血液到達全身各處。體內研究發(fā)現，短期和長期暴露乙醇導致小鼠外周血白細胞DNA單鏈斷裂。但本研究結果顯示：短期乙醇暴露不會導致肝臟和外周血細胞DNA單鏈和雙鏈的斷裂。

在本研究中，乙醇所導致的骨髓細胞DNA單鏈斷裂呈現倒置的“U”字形。在一定劑量范圍內，乙醇的過量攝入使得體內乙醛無法及時清除，導致體內乙醛濃度上升對細胞DNA造成損傷?；钚匝醯纳梢彩荄NA損傷的關鍵。乙醇氧化成乙醛產生大量活性氧，這些活性氧通過細胞色素P450形成羥自由基進而誘導脂質過氧化反應并最終導致細胞DNA的損傷。本研究中隨著劑量的增加，高劑量組無法觀測到DNA單鏈的斷裂。推測是由于過量乙醇攝入，大量氧化成的乙醛來不及轉化為無害的乙酸，這些突然增多的乙醛有可能與DNA結合形成DNA加合物，乙醇也能夠明顯誘導過度表達CYP4502E1的HepG2細胞DNA加合物的形成，本課題組在前期研究中發(fā)現乙醛與DNA形成加合物/交聯物阻礙了DNA斷片的移動。

微核試驗有假陽性結果低、方便快捷的特點，常用于檢測細胞染色體斷裂。長期乙醇暴露實驗中，體外研究表明乙醇對2種淋巴細胞染毒導致MN數量升高，體內研究表明乙醇對小鼠暴露32周后進行骨髓微核試驗，未發(fā)現染色體斷裂。由此可見，長期體外和體內乙醇暴露導致染色體斷裂結果不一致，本研究短期體內乙醇暴露也未發(fā)現染色體斷裂。提示體內骨髓微核不是乙醇遺傳毒性的敏感生物標志物。

4 結論

骨髓是短期體內乙醇暴露致DNA斷裂的靶器官；骨髓細胞彗星試驗DNA損傷呈倒置的“U”字形。本研究僅分析了乙醇導致DNA單鏈和雙鏈斷裂作用，因為DNA加合物的形成會阻礙DNA斷片的移動，肝臟和外周血以及高劑量組骨髓細胞未觀察到DNA斷裂并不代表DNA沒有受到損傷，可能是乙醇直接或間接與DNA形成加合物，因此在未來的研究中需要進一步探索乙醇所導致的DNA加合物劑量—反應關系及其機制。乙醇作為世界衛(wèi)生組織公布的已知致癌物，對其遺傳毒性和靶器官的研究較少，本研究所能檢索到的文獻大都較久遠，對于此方面研究亟待拓展。