Cd脅迫下木槿兩年生苗的生理及富集特征

曹瓊月，孫佳檸，尹雨桐，黃靜雯，周蓓蓓，周曉麗

（鹽城師范學院海洋與生物工程學院，江蘇鹽城224007）

近幾十年來，工業(yè)化快速發(fā)展，隨之而來的重金屬污染也成為了全球性的環(huán)境污染問題。據(jù)2014 年《全國土壤污染狀況調查公報》顯示［1］，全國土壤總超標率為16.1%，無機污染物超標點位數(shù)占全部超標點位的82.8%，其中重金屬鎘（Cd）超標點位數(shù)高達7%，居無機污染物點位超標第一位。據(jù)估算，我國受Cd 等重金屬污染的耕地面積達2000 萬公頃，受到重金屬污染的糧食年均1200 萬噸［2］。重金屬污染土壤修復的技術有很多，例如隔離/密封技術、土壤清洗/沖洗技術、電動力學修復等，但是這些以工程為基礎的技術大部分不適合大面積污染土壤的修復［3］。而污染土壤的植物修復技術因其成本低、高效、環(huán)境友好以及可就地適用的特點，正成為全世界研究和開發(fā)的熱點［4］。目前在植物修復方面研究較多的是超積累植物，它們可以在污染土壤上正常生長，從土壤中提取重金屬并將其累積在植物可收割部分［5-6］。然而，許多超積累植物主根系不發(fā)達、生長緩慢、生物量低、景觀價值不高，限制了其在土壤重金屬污染修復實踐中的應用［7］，因此選擇合適的植物是高效利用植物修復技術的關鍵。

近年來研究顯示，錦葵科（Malvaceae）木槿屬（Hibiscus）多種植物對干旱、瘠薄、鹽堿等不良土壤條件表現(xiàn)出較好的適應性，是一類極具開發(fā)潛力、抗逆性強的植物類群。木槿（Hibiscus syriacus）因其較高的園藝觀賞、藥用和食用價值在熱帶和亞熱帶地區(qū)應用頗為廣泛。以往研究發(fā)現(xiàn)，木槿能在一定程度上抵御鹽堿、鋁的脅迫，而且不同品種對干旱、低溫等惡劣環(huán)境的耐受性有差異［8］。王小雪、鄧勇先后對木槿同屬植物海濱木槿（Hibiscus hamabo）、紅麻（Hibiscus cannabinus）進行Cd 脅迫研究，發(fā)現(xiàn)它們具有較強的耐Cd能力［9-10］。植物受到重金屬脅迫時，植物細胞會產生大量的活性氧自由基，過量的活性氧能導致膜脂過氧化、蛋白質和DNA 分子的氧化損傷［11］。此時，植物細胞會啟動清除活性氧的保衛(wèi)系統(tǒng)，包括各種酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化劑，從而提高植物的耐受能力［12］。但是，目前尚未有木槿（H. syriacus）耐Cd 能力的相關研究和報道。為此，本研究以木槿為試驗材料，研究不同濃度Cd脅迫對木槿葉片的質膜完整性、抗氧化酶活性的影響，探究木槿對Cd 的吸收特性，評估木槿對Cd 的富集能力，以期為木槿應用于Cd污染土壤修復提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

木槿（Hibiscus syriacus），為錦葵科木槿屬落葉灌木，是庭園中常見的灌木花種。試驗材料為長勢相同的兩年生木槿，苗木由江蘇宿遷綠楊園藝公司提供。2020 年8 月將植株移栽至塑料花盆中（盆高22 cm，上、下直徑分別為23 cm和18 cm），每盆1株，盆底放置淺壁托盤。栽培基質由黃土、泥炭土和珍珠巖按體積比5 ：3 ：1 混合而成，每盆裝基質5 kg（DW），苗木恢復正常生長以后開始Cd 脅迫處理。整個試驗在江蘇省鹽城師范學院新長校區(qū)實驗室內進行。

1.2 試驗設計與處理

參考前人的研究和《土壤環(huán)境質量標準》（GB15618-1995），將 Cd 濃度設置為 0、1.0、2.5 和5.0 mg/kg（以每千克干重土壤含量計），以CdCl2·2.5H2O 配置不同濃度的鹽溶液。采用澆灌法，逐次加入鹽溶液以平衡蒸發(fā)的水分，具體處理過程如下：1.0 mg/kg 處理組僅加 Cd 溶液 1 次、2.5 mg/kg 處理組分 2 次加入 Cd 溶液、5.0 mg/kg 處理組分 3 次加入Cd 溶液，使各處理組土壤中Cd 的最終質量濃度分別達到1.0、2.5、5.0 mg/kg，對照處理以蒸餾水代替。每次間隔2 d加入Cd 溶液，并盡可能保證Cd 與土壤混合均勻。單盆為一個處理，每個處理3 個重復，共12盆植株，脅迫時間為45 d（從第一次加入Cd溶液計算）。試驗期間定期澆水，澆水后將托盤中滲出的溶液重新倒入盆中，以保持各處理Cd 含量，避免水分及Cd的流失。

1.3 植物樣品的采集及測定方法

1.3.1 丙二醛含量及抗氧化酶活性的測定

脅迫處理45 d 后，收集新鮮的木槿葉片樣品，用超純水反復沖洗葉片表面，擦干，準確稱取0.3 g新鮮葉片，測定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量及抗氧化酶活性。MDA 含量用硫代巴比妥酸（Trichloroacetic acid-thiobarbituric acid，TCA-TBA）顯色法測定，用氮藍四唑（Nitro-blue tetrazolium，NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性，使用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性，使用過氧化氫法測定過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性，使用抗壞血酸法測定抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbateperoxidase，APX）活性。

1.3.2 Cd含量的測定

將木槿根部用乙二胺四乙酸二鈉（Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na2）溶液浸泡30 min，以去除根表吸附的重金屬離子Cd，再用超純水反復清洗3 ～5 遍。用剪刀將植株根、莖、葉剪成1 cm 小段，恒溫干燥箱40℃烘干至恒重，用液氮研磨成粉末，再次烘干至恒重，過200 目篩，裝入信封保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取 0.50（±0.0005）g 植物樣品，轉移至 50 mL的三角燒瓶中，加入8 mL 高氯酸（HClO4）和2 mL 硝酸（HNO3）進行“濕法灰化”，時間持續(xù)48 h，用電熱板加熱消煮至溶液澄清，冷卻后加入2 mL 稀硝酸（HNO3：H2O =1：1），再次加熱消煮至白色煙霧消失，冷卻后用蒸餾水潤洗至25 mL 容量瓶中定容［13］。每個樣品均做3 個重復處理，并采用國家標準物質茶葉（GSB-7）、柑橘葉（GSB-11）進行質量監(jiān)控。樣品消煮均設置相應硝化的混合酸作為空白對照，以達到消除硝化和測定過程中可能產生的誤差。處理好的樣品用電感耦合等離子體質譜（Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）測定其中的Cd含量。

1.3.3 計算方法

重金屬 Cd 富集系數(shù)（Bioconcentration factors，BCF）= 根部或地上部 Cd 含量/土壤中 Cd 含量。轉運系數(shù)（Translocation factor，TF）= 植物地上部分Cd含量/地下部分Cd含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Office Excel 2010 和 SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用新復極差法（Duncan）檢驗各數(shù)據(jù)組間的差異顯著性，P＜0.05 為差異顯著。實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同濃度Cd 脅迫下木槿葉片MDA 含量的變化

圖1 為不同濃度Cd 脅迫下木槿葉片MDA 含量的變化。與對照相比，Cd脅迫處理增加了木槿葉片內MDA的含量，隨著Cd處理濃度的增加，MDA含量表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在1.0 和2.5 mg/kg Cd 脅迫下，木槿葉片MDA 含量顯著高于對照，分別提高了38%和58%。在5.0 mg/kg Cd 脅迫下，木槿葉片MDA 含量與對照相比提高了3.3%，無顯著差異。

圖1 Cd脅迫對木槿葉片MDA含量的影響Fig.1 Effects of Cd stress on H. syriacus leaf MDA content

2.2 不同濃度Cd脅迫下木槿葉片抗氧化酶活性的變化

圖2 為不同濃度Cd 脅迫對木槿葉片SOD 活性的影響。隨著Cd處理濃度的增加，木槿葉片SOD酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。與對照相比，1.0和2.5 mg/kg Cd 脅迫處理顯著增加了木槿葉片SOD酶活性，分別提高了29.4%和9.9%。而5.0 mg/kg Cd脅迫處理下，木槿葉片SOD 酶活性顯著低于對照，降低了30.2%。

圖2 Cd脅迫對木槿葉片SOD活性的影響Fig.2 Effects of Cd stress on H. syriacus leaf SOD activity

圖3為不同濃度Cd脅迫對木槿葉片POD活性的影響。與對照相比，Cd脅迫處理增加了木槿葉片內POD 的活性，隨著 Cd 處理濃度的增加，POD 活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在1.0和2.5 mg/kg Cd脅迫下，木槿葉片POD 活性顯著高于對照，分別提高了128%和75%。在5.0 mg/kg Cd 脅迫下，木槿葉片POD活性與對照相比提高了0.18%，無顯著差異。

圖3 Cd脅迫對木槿葉片POD活性的影響Fig.3 Effects of Cd stress on H. syriacus leaf POD activity

圖4 為不同濃度Cd 脅迫對木槿葉片CAT 活性的影響。隨著Cd處理濃度的升高，木槿葉片CAT活性逐漸降低。在1.0 mg/kg Cd脅迫下，木槿葉片CAT活性與對照相比提高了3.75%，無顯著差異。在2.5和5.0 mg/kg Cd 脅迫下，木槿葉片CAT 活性顯著低于對照，分別下降了22.4%和81.6%。

圖4 Cd脅迫對木槿葉片CAT活性的影響Fig.4 Effects of Cd stress on H. syriacus leaf CAT activity

圖5 為不同濃度Cd 脅迫對木槿葉片APX 活性的影響。隨著Cd 處理濃度的升高，木槿葉片APX活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在1.0 和2.5 mg/kg Cd 脅迫下，木槿葉片CAT 活性顯著高于對照，分別提高了46%和367%。在5.0 mg/kg Cd 脅迫下，木槿葉片APX 活性顯著低于對照，下降了37%。該研究結果表明，在較低Cd 濃度脅迫下，木槿葉片APX活性增加，說明其增強了清除氧自由基的能力，但其活性在較高Cd濃度脅迫下開始下降，指示其抗性保護能力是有一定限度的。

圖5 Cd脅迫對木槿葉片APX活性的影響Fig.5 Effects of Cd stress on H. syriacus leaf APX activity

2.3 主成分分析

將不同濃度Cd 脅迫下測得的木槿葉片5 個生理指標進行主成分分析，提取出特征值大于1的2個主成分和生理指標主成分特征向量（表1）。從表1 可知，前2 個主成分的累計貢獻率達到91.276%，基本能反應原5個指標的絕大部分信息。第一主成分特征值3.416，貢獻率達到68.313%，SOD、POD、MDA這3個特征向量的值較大，均與耐Cd脅迫呈正相關。第二主成分特征值1.148，貢獻率達到22.962%，CAT、APX 這2 個特征向量的值較大，其中CAT 與耐 Cd 脅迫呈負相關，APX 與耐 Cd 脅迫呈正相關。歸納可知，細胞的保護酶對木槿的耐Cd脅迫發(fā)揮著重要作用。

表1 主成分規(guī)格化特征向量、特征值和貢獻率Table 1 The principal component normalized eigenvectors，eigenvalues and variance contribution

2.4 不同濃度Cd脅迫下木槿對Cd的累積特征

2.4.1 不同濃度Cd脅迫下木槿各部位的Cd含量

圖6 為不同濃度Cd 脅迫下木槿各部位的Cd 含量。通過對木槿不同部位Cd 含量的測定，不難發(fā)現(xiàn)，木槿根部Cd 積累量隨著Cd 處理濃度的增大而顯著增加，與對照相比，根部Cd 含量分別提高了271%、436%和655%，即木槿根部對Cd 的富集能力呈顯著增加趨勢。對木槿莖部而言，不同濃度Cd處理顯著增加了莖部Cd 含量，與對照相比，分別提高了64%、59%和33%。在1.0和2.5 mg/kg Cd脅迫下，木槿莖部對Cd 的富集能力相似，無顯著差異，而在5.0 mg/kg Cd 脅迫下，木槿莖部對Cd 的富集能力顯著低于前兩種情況。在1.0 和2.5 mg/kg Cd 脅迫下，木槿葉部對Cd 的積累量顯著高于對照，分別提高57%和300%，但在5.0 mg/kg Cd脅迫下，木槿葉部對Cd 的積累量顯著低于對照，下降了70%?？傮w來看，木槿不同部位對Cd 的累積量表現(xiàn)為根＞葉＞莖，說明地下部分比地上部分具有更強的Cd 富集能力。

圖6 不同濃度Cd脅迫下木槿各營養(yǎng)器官Cd的含量Fig.6 The Cd concentrations in different organs of H. syriacus under Cd stress

2.4.2 不同濃度Cd 脅迫下木槿各部位對Cd 的富集系數(shù)與轉運系數(shù)

植物從土壤中提取重金屬的能力可用富集系數(shù)表示，而重金屬在植物體內的遷移與累積情況可用轉移系數(shù)表示，轉移系數(shù)越大，說明重金屬在植物地上部分的累積越多。

由表2 可知，不同濃度Cd 脅迫下，木槿根對Cd的富集系數(shù)為10.65 ～17.30，均大于1，在1.0 mg/kg Cd脅迫下，木槿根對Cd的富集能力最強，而Cd脅迫濃度為2.5 mg/kg 時，木槿根對Cd 的富集能力最弱。除了Cd 脅迫濃度為5.0 mg/kg 時，木槿葉片對Cd 的富集系數(shù)小于1，其余Cd 脅迫條件下，木槿莖、葉對Cd 的富集系數(shù)均大于1，只是莖、葉對Cd 的富集系數(shù)要遠遠小于根對Cd的富集系數(shù)。

表2 木槿對Cd的富集和轉運系數(shù)Table 2 Enrichment and transport coefficient of Cd in H. syriacus

從轉運系數(shù)看，不同濃度Cd脅迫條件下木槿對Cd的轉運系數(shù)均小于1，說明木槿由根向莖、葉轉運Cd 的能力較弱，木槿將大部分Cd 積累在根部，限制Cd向上轉移。

3 討論

生物體內自由基作用于脂質發(fā)生過氧化反應的最終產物是MDA，它的含量是衡量植物逆境生長的重要指標，可以反映植物遭受逆境傷害的程度［14］。張鳳琴等［15］指出重金屬會誘變脂質過氧化，重金屬濃度越高，植物體內脂質過氧化產物MDA積累越多。在本試驗中，被脅迫的木槿葉片MDA含量明顯上升，說明木槿葉片在重金屬脅迫下受到明顯的氧化傷害。隨著Cd脅迫濃度的增加，不斷積累的活性氧使植物受到的氧化損傷程度增大，其細胞膜組成發(fā)生變化，結構遭到破壞。但是，在最大濃度Cd（5.0 mg/kg）脅迫下，木槿葉片MDA 含量與對照相比無顯著差異，可能與MDA 在葉片內的累積有關系。

在重金屬脅迫下，細胞膜受到損傷時，植物自身具有的抗氧化酶系統(tǒng)能夠維持自由基在植物體內產生和清除的動態(tài)平衡。一般認為，植物耐受重金屬脅迫的物質基礎之一是SOD、POD、CAT、APX等活性的維持和提高。SOD是防護氧自由基對細胞膜傷害的一種重要保護酶，主要功能是清除活性氧，作為植物抗氧化保護系統(tǒng)的第一道防線，適度提高其活性可以增強植物的抗逆能力［16］。POD 是植物體內的另一種保護酶，主要作用是清除線粒體或細胞質中產生的低濃度H2O2，從而提高植物的抗逆能力［16］。植物遭遇逆境條件后能否正常生長與酶促防御系統(tǒng)有關，其中CAT 是關鍵酶之一，它與SOD 和POD 協(xié)同作用，清除植物體內過剩的自由基，提高抗逆能力［16］。細胞內自由基的組成和水平直接受到胞內抗氧化酶的活性水平及相對大小的影響，只有各種酶協(xié)同配合才能有效清除細胞內的活性氧，使細胞免于氧化損傷［17］。本研究中，在1.0和 2.5 mg/kg Cd 處理下，木槿葉片 SOD、POD 活性均顯著高于對照，表明Cd 脅迫下激發(fā)了木槿葉片SOD、POD 活性，能夠有效清除多余的O2?-和 H2O2。但是，隨著Cd 處理濃度的進一步增大，木槿葉片SOD、POD 活性顯著低于或與對照無顯著差異。相似地，羅潔文［18］等的研究同樣發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下，類蘆（Neyraudia reynaudiana）POD 活性隨 Cd 濃度增加而降低。木槿葉片APX 活性表現(xiàn)出與SOD 和POD 相同的變化，都呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。所以，可以認為，植物抗氧化物酶活性的增加是植物的一種保護機制，但是高濃度的Cd脅迫能導致植物抗氧化酶系統(tǒng)遭到破壞，酶活性降低，影響植物正常生長。本研究中，隨著Cd 處理濃度的增加，木槿葉片CAT 活性一直呈現(xiàn)下降趨勢，可能是由于CAT 降解速度快導致的。

生物富集系數(shù)表示植物對元素吸收和貯存的能力［19］，植物體不同器官對重金屬的富集系數(shù)是不同的。本研究顯示，木槿不同器官對Cd的富集能力表現(xiàn)為根＞莖＞葉，木槿將大部分Cd 富集在根部，這與馮蓮蓮等［20］和婁騰雪等［21］發(fā)現(xiàn)水稻和鹽角草體內的Cd 主要富集在根部的研究結論相同。大多數(shù)植物吸收的Cd 主要積累在根系，而地上部含量較低［22］，可能是Cd進入根皮層細胞后被多種有機物質結合沉積［23］，根部累積了大量的Cd，阻止其向地上部轉移，緩解了Cd對地上部的毒害作用［24］。轉移系數(shù)是衡量Cd從地下部向地上部轉運效率的指標［19］，Cd 進入根細胞后，部分Cd 被儲存在根細胞的液泡中，但有一部分通過木質部被轉運至植物體的地上部分。本研究結果顯示，從土壤中吸收的Cd大部分被保留在木槿的根部，只有少量的Cd被轉運到地上部，其轉運系數(shù)均小于1，這與王新和吳燕玉［25］對水稻的研究結果類似。木槿可能通過控制Cd 向地上部轉運來降低Cd 脅迫對其生長的影響，提高其對Cd 的耐性。此外，雖然只有少部分的Cd 被運轉至地上部莖葉，但由于木槿地上部的生物量大，地上部仍然可以積累大量的Cd，不失為污染土壤植物修復的良好選擇。

4 結論

重金屬Cd脅迫使木槿葉片受到氧化損傷，對葉片抗氧化酶具有一定影響，木槿通過調節(jié)其在體內的水平，增強植物對Cd 的耐性，降低重金屬脅迫對其產生的毒害作用，但是高濃度Cd抑制了木槿葉片抗氧化酶的活性。隨著Cd 脅迫濃度的增加，木槿根、莖、葉對Cd 的累積量顯著增加，其中根部對Cd的富集能力最強，木槿將大部分Cd累積在根部。本研究結果為利用木槿改良Cd 污染土壤的植物修復技術，開發(fā)適合Cd污染土壤種植的優(yōu)良樹種提供了新思路。