與鯡魚(yú)精子DNA相互作用及其影響因素的光譜學(xué)分析

呂嘉楠，李軍生，黃國(guó)霞，閻柳娟，馬 紀(jì)

廣西科技大學(xué)廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006

引 言

圖1 多環(huán)芳烴CHR的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of CHR

DNA具有獨(dú)特的雙螺旋結(jié)構(gòu)，對(duì)許多芳香雜環(huán)有很強(qiáng)的親和力。Lerman早在1961年就提出具有平面芳香稠環(huán)結(jié)構(gòu)的分子會(huì)以嵌入方式與DNA結(jié)合，首先證明了嵌入作用是這種親和力的來(lái)源。后來(lái)陸續(xù)有學(xué)者提出通過(guò)嵌入作用原理，利用雙鏈DNA去除一些諸如溴化乙錠、二噁英、吖啶等有害成分物質(zhì)。這些構(gòu)想為創(chuàng)建新型多環(huán)芳烴消除技術(shù)提供了新思路。因此，探索和揭示CHR與DNA體外條件下的相互作用及其影響因素，對(duì)于創(chuàng)建利用DNA消除CHR的新方法至關(guān)重要。

研究平面剛性結(jié)構(gòu)有機(jī)小分子與DNA相互作用的方法有很多，其中，紫外可見(jiàn)分光光度法最為經(jīng)典，而共振光散射法也因其對(duì)復(fù)合物的粒子體積變化高度敏感且能提供更豐富的信息等被研究者廣泛應(yīng)用。王倩倩[2]等應(yīng)用共振光散射法計(jì)算香檸檬烯的DNA結(jié)合飽和值，根據(jù)其對(duì)DNA的結(jié)合能力分析其潛在毒性。Gao[3]等通過(guò)共振光散射法計(jì)算獲得了三羥基蒽醌的DNA結(jié)合飽和值，并以大黃酚、大黃酸、茜素為參考，建立了快速評(píng)估三羥基蒽醌毒性的方法。Li[4]等也通過(guò)共振光散射法計(jì)算黃曲霉毒素B1的DNA結(jié)合飽和值，說(shuō)明其嵌入DNA的能力要小于溴化乙錠，大于補(bǔ)骨脂素，為判斷黃曲霉毒素B1與DNA的相互作用提供了定量參考。然而目前應(yīng)用光譜法探索環(huán)境因素對(duì)CHR與DNA體外相互作用的影響，從而創(chuàng)造最佳的環(huán)境結(jié)合條件以達(dá)到高效去除目的的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本文主要是利用紫外可見(jiàn)吸收光譜和共振光散射法研究CHR與鯡魚(yú)精子DNA的體外相互作用，并通過(guò)計(jì)算CHR與DNA結(jié)合飽和值判斷其結(jié)合DNA的能力，分析影響二者相互作用的一些外源因素以獲得促進(jìn)CHR和DNA相互作用的條件，為設(shè)計(jì)高效去除環(huán)境中CHR的方法奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

熒光分光光度計(jì)(RF-5301PC，日本島津)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Cary-60，安捷倫科技)；漩渦混合器(XW-80A，上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；微機(jī)型精密酸度計(jì)(PHS-25CW，上海思龍科學(xué)儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4，國(guó)畫(huà)電器有限公司)。

CHR (Dr.Ehrenstorfer GmbH (Augsburg Germany)，純度>99.9%)，利用98%乙醇溶解后使用pH為7.40的Tris-HCl緩沖溶液稀釋至所需濃度。鯡魚(yú)精子脫氧核糖核酸(hsDNA，Solarbio公司)，溶于超純水后利用紫外分光光度計(jì)測(cè)得其260 nm處的吸光度值，并根據(jù)朗伯比爾定律計(jì)算其濃度，儲(chǔ)存于4 ℃的冰箱中。0.1 mol·L-1的三羥甲基氨基甲烷(Tris)與0.1 mol·L-1的鹽酸按照比例配置成pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液，探究pH影響因素時(shí)可利用pH計(jì)將其調(diào)配成不同pH的緩沖溶液。所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)所用的水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 CHR與DNA相互作用的紫外可見(jiàn)吸收光譜

在25 ℃，向1.0 cm×1.0 cm的石英比色皿中加入3 mL CHR溶液(9.96×10-6mol·L-1)，后逐漸向比色皿中滴加DNA溶液(4.12×10-5mol·L-1)，每次加入10 μL，充分混勻后靜置10 min使反應(yīng)達(dá)到平衡，以紫外-分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，掃描范圍200～400 nm。

1.2.2 CHR與DNA相互作用的共振光散射光譜

在25 ℃，向1.0 cm×1.0 cm的石英比色皿中加入3.5 mL CHR溶液(2.59×10-6mol·L-1)，RF-5301PC熒光分光光度計(jì)設(shè)置λem=λex進(jìn)行同步掃描。后逐漸向CHR溶液中滴加DNA溶液(1.23×10-4mol·L-1)，每次滴加10 μL，充分混勻后靜置10 min至反應(yīng)達(dá)到平衡，進(jìn)行同步掃描并記錄。

2 結(jié)果與討論

2.1 CHR與DNA相互作用的紫外可見(jiàn)吸收光譜

在沒(méi)有或者有DNA存在的情況下，CHR的紫外光譜圖如圖2所示。當(dāng)沒(méi)有加入DNA時(shí)，CHR的最大紫外吸收峰出現(xiàn)在267 nm處，隨著DNA的逐漸加入，CHR的最大吸收峰出現(xiàn)明顯的減色效應(yīng)，且伴隨有輕微的紅移現(xiàn)象。事實(shí)上減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象與小分子和DNA的嵌插結(jié)合密切相關(guān)，這種結(jié)合是由于藥物的稠環(huán)結(jié)構(gòu)和DNA堿基對(duì)的平面環(huán)結(jié)構(gòu)中π—π芳香基團(tuán)的強(qiáng)烈堆積作用造成的[5]。因此由CHR的紫外光譜圖變化可以推測(cè)出CHR與DNA之間為嵌插結(jié)合模式。

圖2 在pH 7.40，25 ℃下沒(méi)有DNA和有DNA存在時(shí)CHR的紫外可見(jiàn)光譜[CHR]=9.96×10-6 mol·L-1,a—i:[DNA]=(0，0.14，0.27，0.41，0.54，0.68，0.81，0.94，1.07)×10-6 mol·L-1Fig.2 UV-Visible spectra of CHR in the absence and presence of DNA at 25 ℃ at pH 7.40[CHR]=9.96×10-6 mol·L-1,a—i:[DNA]=(0，0.14，0.27，0.41，0.54，0.68，0.81，0.94，1.07)×10-6 mol·L-1

2.2 CHR與DNA相互作用的共振光散射光譜

2.2.1 CHR與DNA相互作用的共振光散射光譜

DNA結(jié)合飽和值可以預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)藥物分子與DNA結(jié)合能力強(qiáng)弱[6]。因?yàn)槿魏我环N藥物分子是否具有嵌入DNA分子能力以及嵌入DNA分子能力大小是由該藥物分子的分子結(jié)構(gòu)決定。在某一條件下，一種藥物分子與DNA的結(jié)合位點(diǎn)及位點(diǎn)數(shù)量都是先天決定。因此，在共振光散射光譜檢測(cè)中，待檢測(cè)的藥物分子濃度固定且過(guò)量時(shí)，其共振光散射峰強(qiáng)度會(huì)隨著DNA的加入而不斷增強(qiáng)，但是當(dāng)藥物分子與DNA的結(jié)合達(dá)到極限后，即使再增加DNA，其共振光散射峰強(qiáng)度達(dá)到最大后也不再增強(qiáng)，繼續(xù)增加DNA，其共振光散射峰強(qiáng)度甚至反而減小。共振光散射強(qiáng)度達(dá)到最大時(shí)對(duì)應(yīng)的DNA濃度被稱為飽和DNA濃度。待測(cè)藥物分子濃度/飽和DNA濃度，即可得出該藥物分子嵌入的DNA結(jié)合飽和值。藥物分子的DNA結(jié)合飽和值由式(1)求出

(1)

共振光散射強(qiáng)度主要與散射粒子的大小、粒子濃度、溶液中相界面的形成等因素有關(guān)，相關(guān)變化通常能表示體系中相互作用的強(qiáng)度大小[7]。在有無(wú)DNA存在的情況下，CHR的共振光散射光譜如圖3所示，可以清楚地看到CHR在468 nm處有穩(wěn)定的共振光散射峰，因此選擇468 nm處的散射峰為觀察對(duì)象。由圖3看出，隨著DNA的不斷加入，CHR的共振光散射峰強(qiáng)度不斷增加，表明CHR與DNA之間發(fā)生了相互作用，并不斷形成更大體積的微粒物質(zhì)。當(dāng)DNA濃度為3.08×10-6mol·L-1時(shí)，CHR的共振光散射強(qiáng)度達(dá)到最大。繼續(xù)增加DNA，體系散射強(qiáng)度不再增大反而減小。因此，在25 ℃的條件下當(dāng)CHR的濃度為2.59×10-6mol·L-1時(shí)，其飽和DNA的濃度為3.08×10-6mol·L-1，相應(yīng)的CHR與DNA的結(jié)合飽和值則為0.84。因此推測(cè)具有平面芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的CHR是以嵌插模式與DNA結(jié)合的。

圖3 在pH7.40，25 ℃，沒(méi)有DNA和有DNA存在時(shí)CHR的共振光散射光譜[CHR]=2.59×10-6 mol·L-1,a—k:[DNA]=(0，0.35，0.70，1.05，3.42，1.39，1.73，2.07，2.41，2.75，3.08)×10-6 mol·L-1Fig.3 RLS spectra of CHR with and without DNA at 25 ℃ at pH 7.40[CHR]=2.59×10-6 mol·L-1,a—k:[DNA]=(0，0.35，0.70，1.05，3.42，1.39，1.73，2.07，2.41，2.75，3.08)×10-6 mol·L-1

2.2.2 環(huán)境因素的影響

由圖4(a)所示，當(dāng)溫度從25 ℃上升至65 ℃時(shí)，RLS強(qiáng)度呈先增大后減小的趨勢(shì)，30 ℃時(shí)達(dá)到最大，這種現(xiàn)象可能是因?yàn)闇囟容^低時(shí)分子間相對(duì)運(yùn)動(dòng)較慢，溫度上升導(dǎo)致分子間相對(duì)運(yùn)動(dòng)加快。隨著溫度繼續(xù)升高，DNA分子結(jié)構(gòu)破壞，降低了CHR和DNA的結(jié)合作用力，導(dǎo)致RLS強(qiáng)度的降低。因此將30 ℃作為CHR-DNA體外相互作用的標(biāo)準(zhǔn)條件。

由圖4(b)所示，30 ℃時(shí)，從酸性到堿性環(huán)境下RLS強(qiáng)度呈先增大后逐漸減小的趨勢(shì)，在pH為7.40時(shí)達(dá)到最大值。分析認(rèn)為在酸性條件下，DNA磷酸基團(tuán)中的磷酸根負(fù)離子會(huì)與氫離子相互吸引，使得堿基周?chē)患罅繗潆x子，阻礙了CHR與DNA的結(jié)合。堿性環(huán)境可能會(huì)誘發(fā)DNA變性甚至解旋，直接導(dǎo)致CHR與DNA 分子之間的結(jié)合位點(diǎn)減少。因此，將pH 7.40作為CHR-DNA體外相互作用的標(biāo)準(zhǔn)條件。

圖4 (a)不同溫度下，CHR-DNA體系共振光散射峰強(qiáng)度的變化；(b)30 ℃時(shí),不同pH下CHR-DNA體系共振光散射峰強(qiáng)度的變化(p<0.05)[CHR]=2.59×10-6 mol·L-1，[DNA]=1.65×10-6 mol·L-1Fig.4 (a)Changes of RLS intensity of CHR-DNA at different temperature；(b)Changes of RLS intensity of CHR-DNA at different pH at 30 ℃ (p<0.05)[CHR]=2.59×10-6 mol·L-1，[DNA]=1.65×10-6 mol·L-1

在30 ℃，pH 7.40時(shí)，由圖5(a)可以看到CHR-DNA體系的散射峰強(qiáng)度隨著氯化鈉溶液濃度的逐漸增加而逐漸減弱。分析認(rèn)為鈉離子會(huì)與DNA磷酸基團(tuán)中的磷酸根負(fù)離子相互吸引，使得DNA堿基周?chē)患罅库c離子，磷酸骨架的電荷斥力降低[8]，導(dǎo)致DNA鏈緊縮，一方面阻礙小分子與DNA的結(jié)合，另一方面可能會(huì)使得已經(jīng)被結(jié)合的小分子擠出DNA。因此選擇加入最低濃度的氯化鈉來(lái)探討其對(duì)CHR的DNA結(jié)合飽和值的影響。

在30 ℃，pH 7.40時(shí)，從圖5(b)可以看到CHR-DNA體系的散射峰強(qiáng)度隨著氯化鈣溶液濃度的逐漸增加而逐漸減弱。氯化鈣與氯化鈉在體系中產(chǎn)生的作用相似，且Ca2+所帶電荷更多，體積更大，其影響也更顯著。因此同樣選擇加入最低濃度的氯化鈣來(lái)探討其對(duì)CHR的DNA結(jié)合飽和值的影響。

在30 ℃，pH 7.40時(shí)，從圖5(c)可看出CHR-DNA體系的散射峰強(qiáng)度隨著維生素C溶液濃度的增加呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，當(dāng)維C濃度為8×10-5mol·L-1，散射峰強(qiáng)度達(dá)到最大值。維生素C通過(guò)OH和C—O基團(tuán)與DNA磷酸、堿基和脫氧核糖供體原子與DNA發(fā)生相互作用，當(dāng)其濃度較高時(shí)，生物大分子的結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)輕微的螺旋失穩(wěn)現(xiàn)象[9]。因此選擇加入8×10-5mol·L-1的維生素C來(lái)探討其對(duì)CHR的DNA結(jié)合飽和值的影響。

在30 ℃，pH 7.40時(shí)，從圖5(d)可看出CHR-DNA體系的散射峰強(qiáng)度隨著SLS濃度的逐漸增加呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。在十二烷基磺酸鈉(SLS)濃度為10-7mol·L-1時(shí)，CHR-DNA相互作用后的散射峰強(qiáng)度達(dá)到最大。SLS是一種陰離子表面活性劑，低濃度時(shí)會(huì)使得體系中散射粒子分散且穩(wěn)定，導(dǎo)致共振散射峰強(qiáng)度的增大，而當(dāng)表面活性劑濃度過(guò)高時(shí)部分(SLS)會(huì)與DNA發(fā)生疏水作用形成膠束[10]，膠束體系中疏水性和粘性增強(qiáng)，DNA堿基通過(guò)氫鍵配對(duì)的能力被削弱，從而減少或阻止CHR與DNA的結(jié)合。因此選擇加入10-7mol·L-1的SLS溶液來(lái)探討其對(duì)CHR的DNA結(jié)合飽和值的影響。

圖5 (a)，(b)，(c)，(d)分別為在不同氯化鈉、氯化鈣、維生素C、SLS濃度下，CHR-DNA體系散射峰強(qiáng)度的變化(p<0.05)[CHR]=2.59×10-6 mol·L-1,[DNA]=1.65×10-6 mol·L-1Fig.5 (a),(b),(c),(d)was respectively effect of different concentration of NaCl, CaCl2,Vitamin C,SLS on RLS intensity of CHR-DNA (p<0.05) [CHR]=2.59×10-6 mol·L-1,[DNA]=1.65×10-6 mol·L-1

在30 ℃、pH 7.40的條件下，固定CHR的濃度為2.59×10-6mol·L-1，此時(shí)CHR 的DNA結(jié)合飽和值計(jì)算為0.94，分別加入氯化鈉(0.000 1 mol·L-1)，氯化鈣(0.000 1 mol·L-1)，維生素C(8×10-5mol·L-1)，SLS(10-7mol·L-1)后，各條件下的DNA結(jié)合飽和值總結(jié)于表1。從表1可看出最低濃度的氯化鈉、氯化鈣存在時(shí)，CHR的DNA結(jié)合飽和值均小于標(biāo)準(zhǔn)條件下CHR的DNA結(jié)合飽和值，說(shuō)明陽(yáng)離子的存在對(duì)CHR與DNA的結(jié)合有削弱作用，可能會(huì)直接導(dǎo)致去除率的降低。而維生素C和SLS存在的情況下，CHR的DNA結(jié)合飽和值均大于標(biāo)準(zhǔn)條件下CHR的DNA結(jié)合飽和值，說(shuō)明一定濃度的維生素C和SLS對(duì)CHR與DNA的結(jié)合是起到促進(jìn)作用的，若向CHR-DNA的體系中加入這些環(huán)境因素，則有助于提高污水中CHR的去除率。

表1 CHR的DNA結(jié)合飽和值Table 1 Saturation value binding with DNA of CHR

3 結(jié) 論

利用紫外可見(jiàn)吸收光譜與共振光散射法研究了CHR與DNA的相互作用，結(jié)果表明兩者之間為嵌插結(jié)合，說(shuō)明了建立新的基于DNA嵌插原理的CHR去除法具有可行性。當(dāng)CHR的濃度為2.59×10-6mol·L-1時(shí)，25 ℃條件下CHR的DNA結(jié)合飽和值為0.84，而30 ℃，pH 7.40下CHR的DNA結(jié)合飽和值則為0.94，在此基礎(chǔ)上探究了一些環(huán)境污水中可能存在的物質(zhì)或者洗滌劑中的主要成分對(duì)CHR與DNA相互作用的影響，發(fā)現(xiàn)CHR的DNA結(jié)合飽和值隨環(huán)境共存物的不同而變化，結(jié)果表明可以嘗試著將氯化鈉、氯化鈣、維生素C、SLS這幾種因素應(yīng)用于下一步的消除研究以測(cè)定其對(duì)污水中CHR去除率的影響。綜上所述，研究CHR與DNA體外相互作用及其影響因素非常有意義，相信本工作將會(huì)為很多領(lǐng)域中解決多環(huán)芳烴污染提供新的見(jiàn)解。