不同濃度豬、奶牛糞水中溫厭氧發(fā)酵沼液中DOM的光譜特征

婁夢函，靳紅梅，梁 棟，朱燕云，朱 寧,4，李丹陽

1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，江蘇 南京 210014 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014 4.江蘇省有機(jī)固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095

引 言

我國畜禽養(yǎng)殖場糞污產(chǎn)生量高達(dá)38億t/年[1]，其中糞水(主要由動物尿液、沖洗水、損失的飲用水及少量固體糞便等組成)占比超過80%，是畜禽養(yǎng)殖污染防控的重點(diǎn)[2]。厭氧發(fā)酵技術(shù)是畜禽養(yǎng)殖場糞水處理的重要手段，在規(guī)?；i和奶牛養(yǎng)殖場中應(yīng)用十分普遍[3]。沼液是厭氧發(fā)酵后的主要?dú)埩粑?，年產(chǎn)生量超過4億t。沼液中溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)含量豐富，它是一類分子量分布范圍廣泛、組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的非均質(zhì)有機(jī)混合物，含多種官能團(tuán)，具有絡(luò)合、離子交換吸附和氧化還原能力。同時，DOM在土壤等環(huán)境介質(zhì)中移動較快、生物有效性大，影響重金屬和有機(jī)物的遷移轉(zhuǎn)化及生物有效性等環(huán)境行為[4-6]。因此，明確畜禽糞便源沼液中DOM的含量及結(jié)構(gòu)變化對其后續(xù)還田利用的環(huán)境效應(yīng)具有重要意義。

三維熒光光譜(3DEEM)是表征DOM熒光特性的重要方法[7]。平行因子分析法(PARAFAC)常與3DEEM技術(shù)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的DOM混合體系的組分分解，進(jìn)而明確DOM各成分的相對含量和比例。近年來，利用該技術(shù)表征養(yǎng)殖廢水及其沼液中DOM熒光特性的研究不斷增多。邵一奇等[8]發(fā)現(xiàn)豬場廢水殘留沼液中DOM的芳香化程度提高，可生化性降低，類腐殖質(zhì)物質(zhì)增加，DOM有明顯的生物源特征；李有康等[9]研究發(fā)現(xiàn)畜禽糞污發(fā)酵后的沼液往往殘留大量腐殖質(zhì)，說明的腐殖酸作為高分子聚合物難以被生物降解的特性。有報(bào)道利用3DEEM-PARAFAC分析了豬場廢水DOM組成特征，發(fā)現(xiàn)類腐殖質(zhì)組分所占比例與腐殖化指數(shù)呈顯著正相關(guān)。

然而，對于不同原料、不同濃度條件下，厭氧發(fā)酵前后沼液DOM含量及結(jié)構(gòu)變化的3DEEM研究甚少。本研究對不同發(fā)酵濃度(TS為4%和8%)的豬、奶牛糞水進(jìn)行中溫批次厭氧發(fā)酵試驗(yàn)，進(jìn)而利用3DEEM-PARAFAC技術(shù)深入分析沼液中DOM的含量及組成變化。研究旨在為畜禽糞便沼液農(nóng)田利用的潛在環(huán)境效應(yīng)評價提供理論支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所需原料主要為豬、奶牛糞水(包括尿液及沖洗廢水)和活性污泥。其中，糞水分別取自本研究團(tuán)隊(duì)長期定位監(jiān)測的規(guī)?；i養(yǎng)殖場和奶牛養(yǎng)殖場的糞水收集池，活性泥取自監(jiān)測豬場的沼氣發(fā)酵罐排出的污泥。試驗(yàn)原料基本理化性質(zhì)詳見表1?；钚晕勰嘈柙趯?shí)驗(yàn)室經(jīng)中溫[(35±1)℃]馴化至甲烷含量高于55%后使用。

表1 發(fā)酵原料的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic characteristics of the raw materials

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

厭氧發(fā)酵試驗(yàn)在180 mL血清瓶中進(jìn)行。設(shè)置4個處理組(表2)，分別為TS為4%和8%的豬、奶牛糞水，并接種30%(W/W)的馴化活性污泥；同時設(shè)置僅加入接種污泥和蒸餾水的對照組。每個處理設(shè)置3個重復(fù)(n=3)。裝料后立即通入高純N2吹掃5 min，以確保瓶內(nèi)厭氧環(huán)境，然后密封。將密封的血清瓶放置于恒溫水浴鍋[(35±1)℃]中進(jìn)行厭氧發(fā)酵試驗(yàn)。每天定時手動搖勻物料兩次，隨后測定日產(chǎn)氣量，并取樣分析CH4含量。當(dāng)各個處理的日產(chǎn)氣量低于累積產(chǎn)氣量的1%時，反應(yīng)終止。整個發(fā)酵試驗(yàn)共計(jì)34 d。

表2 試驗(yàn)處理中發(fā)酵原料的配比Table 2 The raw material ratios in the experimental treatments

1.3 取樣

試驗(yàn)結(jié)束后，稱量沼液質(zhì)量，并充分混勻后取樣。所得沼液樣品在9 000 r·min-1下離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后得到DOM溶液。

1.4 方法

日產(chǎn)氣量采用排水法測定，甲烷含量采用氣相色譜儀(GC9890B，南京仁華色譜科技應(yīng)用開發(fā)中心)測定。DOM濃度采用TOC儀(MultiN/C3100 TOC/TN，德國耶拿分析儀器有限公司)測定，各處理的DOM含量均為扣除對照組后得到的數(shù)據(jù)。3DEEM特征采用熒光光譜儀(FS5，天美科學(xué)儀器有限公司)測量，為避免濃度差異對熒光強(qiáng)度結(jié)果的影響，首先將提取的DOM溶液的總有機(jī)碳(TOC)濃度統(tǒng)一稀釋至(10±0.1)mg·L-1。激發(fā)波長(Ex)為230～500 nm，步長為2 nm；發(fā)射波長(Em)為250～600 nm，步長為1 nm。掃描速度為1 200 nm·min-1。所有樣品均在室溫下測定，采用超純水為空白進(jìn)行背景扣除以消除拉曼散射峰。

1.5 數(shù)據(jù)處理

沼液中DOM質(zhì)量(以干重計(jì))的計(jì)算公式為

M=c×m0×TS

(1)

式(1)中，M為DOM的質(zhì)量，mg；c為DOM的濃度，mg·g-1；m0為物料總質(zhì)量，g；TS為總固體含量，%。

腐殖化指數(shù)(humification Index，HIX)的計(jì)算公式為

(2)

原料及沼液DOM熒光組分的定量分析采用MATLAB 2016R v.和DOMFluor工具箱，實(shí)現(xiàn)DOM組分的PARAFAC模型建立和驗(yàn)證。利用殘差分析與半分法確定最優(yōu)組分?jǐn)?shù)并檢驗(yàn)PARAFAC模型的準(zhǔn)確性，最終確定熒光組分的熒光峰位置和強(qiáng)度，每個成分的熒光強(qiáng)度用Fmax(RU，拉曼單位)表示[10]，用以表征各成分相對濃度的估計(jì)值。

各指標(biāo)在不同處理間的差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用最小顯著性差異(LSD)法，α=0.05；同一處理在發(fā)酵前后各指標(biāo)的差異性分析采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法。統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 26.0 v.，圖形繪制軟件為Origin 2018 v.。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)氣特征

豬、奶牛糞水中溫厭氧發(fā)酵過程中日產(chǎn)氣量、甲烷含量變化分別如圖1(a,b)所示。總體看來，各處理組的日產(chǎn)氣量在發(fā)酵初期逐漸升高，并在發(fā)酵后期不斷下降。豬、奶牛糞水在中溫厭氧發(fā)酵過程中，甲烷含量在試驗(yàn)前期緩慢上升，分別在第12 d和第4 d達(dá)到峰值，后期分別穩(wěn)定在61%和54%左右。發(fā)酵累積產(chǎn)氣量達(dá)238.0～484.8 mL·g-1VS，這與團(tuán)隊(duì)前期利用相同原料進(jìn)行中溫厭氧發(fā)酵的研究結(jié)果基本一致[11]。產(chǎn)氣結(jié)果說明，該厭氧發(fā)酵試驗(yàn)運(yùn)行正常，所得沼液具有代表性。

圖1 豬、奶牛糞水發(fā)酵過程中日產(chǎn)氣量(a)和甲烷含量(b)的變化特征注：平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)Fig.1 Changes of gas productivity (a)and methane concentration (b)during the anaerobic digestion of pig and dairy manure slurriesNote:mean±standard errors (n=3)

2.2 沼液中DOM含量的變化

豬、奶牛糞水中溫厭氧發(fā)酵前后DOM的含量變化如圖2所示。產(chǎn)氣結(jié)束后各試驗(yàn)組的DOM含量下降，在PM1，PM2，DM1和DM2處理中降幅分別為84.55%，73.47%，71.78%和61.44%，降幅均達(dá)到極顯著(p<0.001)水平。分析認(rèn)為隨著厭氧發(fā)酵反應(yīng)的進(jìn)行，原料中的DOM不斷被微生物降解轉(zhuǎn)化，以CH4和CO2等氣體形式排出發(fā)酵體系。此外，厭氧發(fā)酵結(jié)束后，沼液中干物質(zhì)含量的降低也導(dǎo)致了這一變化。

圖2 豬、奶牛糞水發(fā)酵前后DOM含量變化特征注：不同大、小寫字母分別表示處理中原料和沼液的差異顯著(p<0.05)；***表示同一處理發(fā)酵前后差異顯著(p<0.001)，下同。Fig.2 Changes of DOM content in the raw and digested pig and dairy manure slurriesNote:Different capital and small letters indicate the significant (p<0.05)differences between the treatments in raw and digested materials,respectively；*** indicate significant (p<0.001)differences between the raw and digested materials.The same below.

2.3 沼液中DOM熒光強(qiáng)度變化特征

根據(jù)Ex和Em波長的不同，可將3DEEM圖劃為5個區(qū)域[12]，分別代表類胡敏酸、可溶性微生物副產(chǎn)物、類富里酸、類色氨酸和類酪氨酸，詳見表3。

表3 EEM的熒光峰劃分及歸屬Table 3 Fluorescence peak division and attribution of EEM in the raw and digested manure slurries

不同濃度的豬、奶牛糞水發(fā)酵前后的3DEEM如圖3所示，其差異反映了DOM在發(fā)酵前后的演變。各試驗(yàn)組沼液中，3DEEM的最高熒光強(qiáng)度始終出現(xiàn)在區(qū)域B，說明微生物副產(chǎn)物是原料和沼液的主要組成部分，此外還含有胡敏酸、富里酸和少量蛋白質(zhì)類物質(zhì)。但沼液中區(qū)域B的熒光強(qiáng)度均有不同程度的下降趨勢，這主要是由于原料中含量較多的可溶性微生物副產(chǎn)物等易降解物質(zhì)，在發(fā)酵過程中被微生物利用并降解轉(zhuǎn)化，因此發(fā)酵結(jié)束后熒光強(qiáng)度明顯降解。不同發(fā)酵濃度的沼液中DOM各組分亦有所差異，主要表現(xiàn)在：PM2[圖3(b)]和DM2[圖3(d)]試驗(yàn)組沼液中，區(qū)域C的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，說明厭氧發(fā)酵過程中有部分類富里酸物質(zhì)生成；而PM1[圖3(a)]和DM1[圖3(c)]處理組沼液中，熒光區(qū)域C的熒光強(qiáng)度變化不明顯。各處理組沼液中區(qū)域D、E的熒光強(qiáng)度差異不明顯，說明類色氨酸和類酪氨酸對不同發(fā)酵原料和發(fā)酵濃度的響應(yīng)不敏感。

圖3 豬、奶牛糞水(a)PM1;(b)PM2;(c)DM1;(d):DM2發(fā)酵前后DOM三維熒光光譜圖變化特征Fig.3 3DEEM changes of DOM in the raw and digested pig of (a)PM1;(b)PM2;(c)DM1;(d):DM2

2.4 沼液中DOM各組分含量變化特征

2.4.1 熒光組分解析

由于單個峰位置對物理化學(xué)條件的變化較為敏感，因此僅依據(jù)EEM光譜來評估DOM的成分可能會出現(xiàn)偏差。PARAFAC法可以降低一些熒光峰重疊，提高對熒光數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步表征DOM不同組分的含量變化[13]。

對本研究中沼液的3DEEM進(jìn)行PARAFAC分析，共解析出4個熒光組分[圖4(a)]，即：C1(主峰Ex/Em=275/300 nm、次峰Ex/Em=225/300 nm)歸屬為類酪氨酸物質(zhì)[14]；C2(Ex/Em=275/430 nm)歸屬為類富里酸組分；C3(主峰Ex/Em=275/350 nm、次峰Ex/Em=225/350 nm)歸屬為類色氨酸組分；C4(Ex/Em=225/450 nm)歸屬為類胡敏酸組分[7]。其中，C1和C3為可溶性微生物副產(chǎn)物組分，它們主要由微生物活動產(chǎn)生，屬于游離態(tài)或蛋白質(zhì)類的結(jié)合態(tài)氨基酸；C2和C4為類腐殖質(zhì)組分，芳香族結(jié)構(gòu)較豐富、分子量較大、分子結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，難被微生物降解[7]。

2.4.2 熒光組分的相對含量

原料及沼液中DOM的PARAFAC熒光組分的Fmax變化如圖4(b)所示。與原料相比，沼液DOM中可溶性微生物副產(chǎn)物(C1、C3)的相對含量均呈顯著(p<0.05)下降，PM1，PM2，DM1，DM2中C1和C3的相對含量分別下降了98.01%，38.11%，58.94%和60.27%。PM1和DM1處理中沼液的DOM中類富里酸組分(C2)的降幅分別為12.63%和13.93%，而PM2和DM2處理中沼液的C2組分卻提高了113.71%和2.00%。分析認(rèn)為由于PM1和DM1處理中發(fā)酵原料濃度低，反應(yīng)底物不足，微生物分解和腐化程度不高，故富里酸的產(chǎn)生量降低；而PM2和DM2處理中發(fā)酵原料充足，微生物分解和腐化程度高，故富里酸產(chǎn)生量增加。PM1，PM2，DM1和DM2處理中沼液的類胡敏酸組分(C4)的相對含量分別增加33.43%，194.07%，30.39%和62.24%。說明，厭氧微生物可將易利用的有機(jī)物分解成小分子單體，通過聚合作用向更穩(wěn)定的胡敏酸、富里酸轉(zhuǎn)化，腐殖化程度提高[15]。與其他處理相比，只有PM2處理中沼液的4個組分總量高于發(fā)酵原料，這主要是C2和C4組分明顯增加所導(dǎo)致，同時也說明高發(fā)酵濃度的豬糞沼液中腐殖化程度更高。

圖4 豬、奶牛糞水發(fā)酵前后DOM的PARAFAC熒光組分(a)及Fmax(b)變化特征Fig.4 PARAFAC fluorescence components (a)and Fmax (b)of DOM in the raw and digested pig and dairy manure slurries

2.4.3 腐殖化指數(shù)

通常情況下，HIX(腐質(zhì)化指數(shù))與物料的芳香化程度密切相關(guān)。PM1，PM2，DM1和DM2處理中沼液DOM的HIX均極顯著(p<0.001)提高(圖5)，增幅分別為115.99%，180.77%，52.53%和89.01%。這說明豬、奶牛糞沼液中DOM的芳香化程度明顯提高。沼液中DOM腐殖化程度的增加對于沼液還田后土壤質(zhì)量的提升及污染物的鈍化/降解可能產(chǎn)生積極效應(yīng)[8]。

圖5 豬、奶牛糞水發(fā)酵前后DOM腐殖化指數(shù)變化特征注：**和***表示同一處理發(fā)酵前后差異顯著(p<0.01,p<0.001)Fig.5 Changes of DOM humification index in the raw and digested pig and dairy manure slurriesNote:** and *** indicate significant (p<0.01,p<0.001)differences between the raw and digested pig and dairy manure slurries,respectively

3 結(jié) 論

豬、奶牛糞水經(jīng)中溫厭氧發(fā)酵后，沼液中DOM的含量極顯著(p<0.001)下降。沼液的DOM主要由可溶性微生物副產(chǎn)物、類富里酸、類胡敏酸和少量類蛋白組分構(gòu)成。沼液DOM中類胡敏酸的相對含量均顯著增加(p<0.05)，而類富里酸的相對含量僅在TS為8%的處理中增加。沼液中DOM的腐殖化指數(shù)均極顯著(p<0.01)增加，而豬糞沼液DOM的腐殖化程度明顯高于奶牛糞沼液。