麻痹性貝毒產(chǎn)毒藻株的三維熒光光譜識別技術研究

曾偉基，茍偲鈺，曹潔茹，江天久*，畢衛(wèi)紅

1.暨南大學赤潮與海洋生物學研究中心，水體富營養(yǎng)化與赤潮防治廣東省高校重點實驗室，廣東 廣州 510632 2.燕山大學信息科學與工程學院,燕山大學海洋科學與工程研究院，河北省特種光纖與光纖傳感重點實驗室，河北 秦皇島 066004

引 言

麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poisoning，PSP)主要指石房蛤毒素(saxitoxin，STX)及其衍生物，是一種神經(jīng)毒素[1]。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的麻痹性貝毒毒素已有 57種，主要由甲藻產(chǎn)生，如膝溝藻屬(Gonyaulax)、亞歷山大藻屬(Alexandrium)、裸甲藻屬(Gymnodinium)等。雙殼貝類濾食產(chǎn)毒甲藻后，PSP可在貝類體內(nèi)累積，人類誤食這類貝類可引起麻痹性貝類毒素中毒。近年來，我國沿海大部分海域頻發(fā)貝類毒素中毒事件[2]，不僅帶來十分嚴峻的食品安全問題，還給近海養(yǎng)殖和海產(chǎn)加工業(yè)帶來嚴重損失[3]。

目前PSP的檢測方法有生物檢測法[4]、高效液相色譜法[5]等。這些方法已經(jīng)相對成熟，但仍然存在時效性差、成本高、需要專業(yè)人員操作等缺點。本課題組以前期建立的魚毒性藻類快速識別為基礎[6]，基于微藻的產(chǎn)毒特性與其生長周期[7]和培養(yǎng)條件如光照、溫度，鹽度[8-9]等環(huán)境因子密切相關，產(chǎn)麻痹性貝毒藻sxt基因與光合作用、碳循環(huán)等具有密切聯(lián)系[10-12]。其中小波函數(shù)特征譜作為原始熒光光譜在小波空間的投影能從多尺度細化浮游植物的熒光信息更好地凸顯目標樣本的特征熒光值，Daubechies(db)小波系具有良好的正交性，雙正交性，緊支撐性且近似對稱等特點[13]，本文利用Db7小波函數(shù)提取實驗藻的特征峰，并通過fisher判別方法建立判別函數(shù)，實現(xiàn)對產(chǎn)麻痹性貝毒藻類快速識別的目的，為麻痹性貝類毒素的高效快速監(jiān)測和管理提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(Hitachi F4600，日本)，OLYMPUS CKX41倒置顯微鏡(OLYMPUS 公司)，光照氣候培養(yǎng)箱(上海一恒公司)，化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 藻種培養(yǎng)

實驗選取微藻微小亞歷山大藻(臺灣株)(Alexandriumminimum，AMSY)、塔瑪亞歷山大藻(大亞灣株)(Alexandriumtamarense，ATDY)、鏈狀裸甲藻(防城港株)(Gymnodiniumcatenatum，GCFC)、塔瑪亞歷山大藻(香港株)(Alexandriumtamarense，ATHK)、鏈狀亞歷山大藻(南海株)(Alexandriumcatenella，ACSY)等5株產(chǎn)麻痹性貝毒藻為實驗微藻和21種非PSTs產(chǎn)毒微藻為對照藻，所選對照藻種分屬甲藻門、綠藻門、硅藻門等7個門，其中，利馬原甲藻(Prorocentrum.lima，CCMP685，PLCZ)由暨南大學生命科學技術學院楊維東教授提供，鏈狀裸甲藻產(chǎn)毒株(GCFC01，GCFC)和不產(chǎn)毒藻株(GCH01，GCCZ)由國家海洋局第三海洋研究所顧海峰研究員提供，其他藻種由暨南大學赤潮與海洋生物學研究中心藻種室提供。利用f/2改良配方配置培養(yǎng)液，人工光照培養(yǎng)箱內(nèi)設定溫度分別為16，22和28 ℃，光暗循環(huán)L∶D=12 h∶12 h培養(yǎng)實驗藻株。實驗共進行兩個批次的培養(yǎng)，每組設三個平行樣。

1.3 毒素的提取與高效液相色譜檢測

將收集的藻液反復凍融后，用超聲破碎儀冰浴破碎藻細胞后低溫離心(4 ℃，7 200 g，10 min)后，取上清液，經(jīng)超濾離心管(10 000道爾頓)離心(4 ℃，7 200 g，10 min)，取超濾液用于毒素HPLC分析。麻痹性貝毒的 HPLC檢測分析參考Band-Schmidt等[15]等修改的HPLC柱后衍生法。

1.4 藻類三維熒光光譜的測量

測量條件：設置激發(fā)波長400～600 nm，發(fā)射波長650～750 nm，激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫均為10 nm，掃描速度30 000 nm·min-1，掃描間隔為5 nm，信號積分時間0.004 s。每隔一天定時取上述藻液進行光譜三維光譜掃描測定。為了盡量避免熒光自吸現(xiàn)象，在掃描前用f/2培養(yǎng)液分別對培養(yǎng)藻液稀釋5，10，20，30，50，70和100倍，用三維熒光儀測定各密度的三維熒光光譜，確定適于三維熒光分析的藻細胞密度。

1.5 訓練集和測試集樣品的選取

將不同溫度下各生長期隔天取得的藻液經(jīng)不同稀釋倍數(shù)后測得的藻類三維熒光光譜分為產(chǎn)毒藻類和非產(chǎn)毒藻類，每類隨機再分為等數(shù)量的兩組，一組為訓練集，用于判別函數(shù)的構建，另一組為測試集，用于對判別函數(shù)的識別率測定。

1.6 藻類的三維熒光光譜分析

將掃描所得的文件(格式為*FD3)轉(zhuǎn)化為TXT格式文件，活體藻類的熒光信息為一個二維矩陣(21×11)，對應400～600 nm的激發(fā)波長和650～750 nm的發(fā)射波長。去瑞利散射采用Delaunay三角內(nèi)插值法。采用Matlab6.5及Spss17.0軟件對數(shù)據(jù)進行最大值歸一化處理和分析。

2 結果與討論

2.1 溫度對產(chǎn)毒藻生長及產(chǎn)毒影響

由圖1可知，5株產(chǎn)麻痹性貝毒藻類在溫度22 ℃時，生長速率和最大細胞密度普遍增加，這與Band-Schmidt等在墨西哥灣分離出的Gymnodiniumcatenatum在21和25 ℃生長速率最大的結果一致[15]。隨著溫度升高，亞歷山大藻單位藻細胞所產(chǎn)的PSP總量下降，在28 ℃條件下，4株藻在各個生長期單位藻細胞產(chǎn)PSP總量最低。低溫下，亞歷山大藻藻細胞的產(chǎn)毒總量升高，與已有的研究結果一致[14]。精氨酸是合成麻痹性貝類毒素的重要前體物質(zhì)，高溫使得精氨酸用于藻細胞的生長，所以合成PSP降低[13]。可能是因為低溫藻細胞的生長下降，細胞中精氨酸得到積累而用于PSP的合成。對于鏈狀裸甲藻(GCFC)而言，低溫以及高溫的PSP總量均高于22 ℃，這與墨西哥灣發(fā)現(xiàn)的Gymnodiniumcatenatum在16和33 ℃時單位細胞PSP總量最高，其中產(chǎn)生的C1、C2毒素降低，GTX5、GTX6毒素上升[15]與本實驗結果一致。說明不同屬的產(chǎn)PSP藻，在不同溫度條件下產(chǎn)毒類型及含量不同，有利于藻類生長的環(huán)境，有毒藻產(chǎn)PSP毒素能力降低。

圖1 溫度對五種產(chǎn)毒藻生長和產(chǎn)毒的影響(a):ATHK;(b):AMSY;(c):ATDY;(d):ACSY;(e):GCFCFig.1 The temperature effect on growth and toxin content of toxic microalgae(a):ATHK;(b):AMSY;(c):ATDY;(d):ACSY;(e):GCFC

2.2 基于Db7小波的浮游植物三維熒光光譜特征提取

微小亞歷山大藻(AMSY)三維熒光光譜進行4層層化后得到各層尺度分量(Ca1—Ca4)，如圖2所示，第一層尺度分量受噪聲影響較明顯，難以有效地體現(xiàn)熒光特征，第二、三層分量能較好地避免噪聲干擾，但隨著分層次數(shù)的增加，信號頻率降低，光譜產(chǎn)生了失真。經(jīng)Fisher判別對比發(fā)現(xiàn)，第三層尺度分量(Ca3)判別正確率較高(表1和表2)，因此選擇Ca3-Ex和Ca3-Em的聯(lián)合光譜作為識別特征譜。

圖2 Db7小波對AMSY分解的聯(lián)合熒光光譜圖Fig.2 3D-fluorescence feature extraction of AMSY by Db7 wavelet

表1 Db7小波Ca3分量判別結果Table 1 The identification result of the algae species with Ca3 scale components of Db7

表2 Db7小波Ca2分量判別結果Table 2 The identification result of the algae species with Ca2 scale components of Db7

2.3 基于Ca3尺度分量不同溫度條件下產(chǎn)毒藻判別式的構建

實驗分別測定了藻類(產(chǎn)毒藻和非產(chǎn)毒藻)在溫度16，22和28 ℃時對數(shù)期的三維熒光光譜特征。產(chǎn)毒藻類各溫度的Ca3三維熒光聯(lián)合光譜，如圖3所示，其中1～40數(shù)據(jù)點是Db7小波分析Ca3激發(fā)光譜(λex=650～750 nm)，41～80數(shù)據(jù)點為Ca3發(fā)射光譜(λem=400～600 nm),比較不同溫度條件下的聯(lián)合熒光光譜圖發(fā)現(xiàn)相對熒光的差異主要集中在Ex為400～425和450～545 nm；Em為715～750 nm，可用這幾段特征光譜表征不同溫度下產(chǎn)麻痹性貝類毒素藻的識別光譜，以此特征譜進行Fisher判別。

圖3 不同溫度下對數(shù)期產(chǎn)麻痹性貝毒藻類Ca3聯(lián)合熒光光譜圖(a)：ATHK;(b)：AMSY;(c)：ATDY;(d)：ACSY;(e)：GCFCFig.3 The Ca3 alliance fluorescence spectrum of toxic algae species in exponential phase under different temperatures culture(a)：ATHK;(b)：AMSY;(c)：ATDY;(d)：ACSY;(e)：GCFC

建立的判別函數(shù)如下：

Y1=-130.949+78.758X1+242.195X2+354.102X3-872.739X4-291.105X5-169.714X6+187.348X7+90.945X8+27.478X9-29.249X10-125.974X11+509.928X12+124.248X13-6.539X14+15.802X15-103.205X16-287.275X17-21.752X18+47.053X19+751.713X20

(1a)

Y2=-124.088+167.417X1+137.332X2+212.889X3-725.046X4-217.466X5-132.201X6+149.668X7+90.248X8+39.348X9-55.137X10-157.135X11+490.261X12+201.836X13-30.616X14-2.786X15-170.228X16-189.410X17-28.050X18+54.651X19+707.183X20

(1b)

其中，X1—X20分別代表第1，2，6，11，12，13，15，16，18，20，21，22，23，24，30，33，39，42，60和80數(shù)據(jù)點，數(shù)據(jù)點由費希爾線性判別函數(shù)選擇，Y1和Y2分別是麻痹性貝毒藻類和非麻痹性貝毒藻類的分類判別函數(shù)值。經(jīng)F檢驗(55，3047)，顯著水平<0.1，組間差異顯著。對式(1a,1b)進行Wilk’s Lambda檢驗=0.283，說明判別組間存在顯著水平差異(p<0.05)，判別式具有統(tǒng)計意義。使用函數(shù)對共95份樣本進行判別檢驗時，若Y1>Y2，則該藻有毒；若Y1

表3 藻類Db7小波Ca3分量判別結果Table 3 The identification result of algae species with Ca3 scale components of Db7 wavelet

3 結 論

甲藻是光合自養(yǎng)生物，光合作用對麻痹性貝類毒素藻產(chǎn)毒是必需的，光合作用中產(chǎn)生的高能中間產(chǎn)物，是PSP合成的前提。PSP產(chǎn)生的調(diào)節(jié)，與光合作用相關蛋白質(zhì)的表達有關，光合作用調(diào)控產(chǎn)PSP相關的酶及前體物質(zhì)[16-17]。通過對實驗室在不同溫度條件下培養(yǎng)的5株麻痹性貝毒產(chǎn)毒微藻和21種非麻痹性貝毒產(chǎn)毒微藻的三維熒光光譜進行小波分解，選取Db7小波Ca3分量中的第1，2，6，11，12，13，15，16，18，20，21，22，23，24，30，33，39，42，60，80等20個數(shù)據(jù)點構建判別函數(shù)，其對麻痹性貝毒藻類和非麻痹性貝毒藻類的判別率為93.3%和93.7%，對測試集綜合判別率為 93.5%，判別效果良好。限于實驗藻種的不足，本實驗選取的產(chǎn)毒藻種類較少，環(huán)境因素變量也較少，且只采用了單一的Db7小波分析方法，后續(xù)可以增加實驗藻種，設置不同的光照，營養(yǎng)鹽濃度等，擴大獲取的數(shù)據(jù)量，有望構建出更具代表性的判別模型。此外，隨著神經(jīng)網(wǎng)絡和圖像識別技術的發(fā)展，利用微藻的三維熒光光譜可開發(fā)出更為高效快速的產(chǎn)毒藻識別技術，為我國有毒有害赤潮的管理提供新的技術支持。