近紅外光譜和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的金苦蕎氨基酸快速測定

朱麗偉，嚴(yán)金欣，黃 娟，石桃雄，蔡 芳，李洪有，陳慶富，陳其皎

貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550001

引 言

蕎麥屬于蓼科蕎麥屬的一年生草本雙子葉植物，因生育期短、抗逆性強(qiáng)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)常用來補(bǔ)種。金蕎麥?zhǔn)且环N傳統(tǒng)中藥材，研究發(fā)現(xiàn)金蕎麥根莖活性成分通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬等作用而抑瘤，同時還有清熱解毒、消炎抗菌等功效[1-2]。金苦蕎是金蕎麥與苦蕎雜交而培育的新型蕎麥，特征介于雙親之間，再生力強(qiáng)[3]，春季主要進(jìn)行營養(yǎng)生長，生產(chǎn)大量苦蕎葉。研究發(fā)現(xiàn)蕎麥葉發(fā)酵茶可提高小鼠免疫功能，還具有防治急、慢性炎癥的功能[4-7]。蕎麥籽粒中還含有豐富的蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量充足，富含谷類作物中比較缺乏的賴氨酸，使其具有較高的營養(yǎng)價值。本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥葉中各營養(yǎng)成分比籽粒中含量更高[3]，因此金苦蕎葉片有極大研究開發(fā)價值。

目前常用的氨基酸測定方法預(yù)處理復(fù)雜、耗時長、價格昂貴。陶琳麗等研究發(fā)現(xiàn)，20種氨基酸在1 000～2 502 nm區(qū)域有非常明顯的近紅外光譜吸收且差異顯著[8]，這為利用近紅外技術(shù)建立檢測模型提供了可能性。Chang等[9]利用傅里葉變換-近紅外分析技術(shù)建立了可快速測定菊花谷氨酸、天門冬酰胺和天冬氨酸的模型。通常采用偏最小二乘法(partial least squares，PLS)、主成分回歸(principal component regression，PCR)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neural network，ANN)等化學(xué)計量學(xué)算法建立識別模型，我們前期應(yīng)用線性相關(guān)系統(tǒng)的PCR法和PLS法嘗試建立模型，所建立的模型維度太高，限制其應(yīng)用。Viyona等[10]利用近紅外光譜技術(shù)檢測百香果中脂肪的方法，預(yù)處理光譜后，建立的前反饋(back propagation，BP)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型平均方差高達(dá)0.959。因此本工作選用BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法建立金苦蕎氨基酸的近紅外光譜預(yù)測模型，從內(nèi)部交叉驗證平均相對誤差(RSD)和相關(guān)系數(shù)(R2)等評價指標(biāo)來看，多數(shù)氨基酸預(yù)測模型取得了令人滿意的效果。

1 實驗部分

1.1 材料

樣品蕎麥自交系葉片粉碎樣采自貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)貴州師范大學(xué)蕎麥中心實驗基地，為得到化學(xué)值差異較大的樣品，種植了85份遺傳性狀已穩(wěn)定的金苦蕎自交系，常規(guī)栽培管理，選擇生長較為一致的植株，在其開花前采收上三葉、中三葉和下三葉，共255份樣品，將其分別放于紙袋中，先于鼓風(fēng)機(jī)105 ℃殺青，然后80 ℃烘24 h，然后使用高速粉碎機(jī)粉碎并過100目篩，備用。

1.2 方法

1.2.1 光譜采集與預(yù)處理

采用德國布魯克光譜儀器公司生產(chǎn)的MPA傅里葉變換近紅外光譜儀，OPUS光譜采集軟件。采用漫反射的方法，掃描樣品的近紅外光譜，單次掃描64次，分辨率4 cm-1，掃描范圍4 000～12 000 cm-1，每個樣品均掃描多次，取平均光譜進(jìn)行計算。原始譜數(shù)據(jù)中不僅包含與樣品有關(guān)的信息，還包含各種干擾和無效信息，影響所建模型的可靠性。為降低儀器噪聲和系統(tǒng)誤差以提升光譜中的有效信息率，在建模前對原始光譜進(jìn)行了數(shù)據(jù)預(yù)處理。本實驗利用光譜分析軟件OPUS執(zhí)行自動優(yōu)化程序，確定各組分建模的譜區(qū)范圍和最佳預(yù)處理方法。

1.2.2 氨基酸的測定

參考程勇杰等的方法測定氨基酸的含量[11]，略有改進(jìn)。具體方法如下：稱取0.100 0 g葉片粉末放于干凈的水解管，加入6 mol·L-1鹽酸15 mL，使用氮吹的方法清除管內(nèi)氧氣后封口。然后將水解管放于烘箱中，調(diào)整溫度慢慢升至110 ℃后開始計時，水解24 h關(guān)機(jī)。取出冷卻后的水解管，將水解液輕輕轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，去離子水沖洗水解管，沖洗液也倒入容量瓶，定容后混勻，然后吸取濾液1 mL，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀慢慢蒸干，再用1 mL pH 2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解，濾膜過濾后上機(jī)，所用儀器為日立L-8900氨基酸自動分析儀。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Matlab_R2014b分析軟件，在iMac Pro(2017)計算機(jī)上進(jìn)行模型的建設(shè)。為了驗證模型的性能，使用了交叉驗證(cross-validation)的方法，根據(jù)模型的R2和RSD，選擇最佳模型。當(dāng)RSD小于10%時表明模型效果良好，預(yù)測精度較高，建立的模型可用。

2 結(jié)果與討論

2.1 金苦蕎葉片氨基酸含量

實驗發(fā)現(xiàn)樣品中氨基酸的含量差異較大(表1)，其中差異最明顯的是必需氨基酸中的甲硫氨酸，所測樣品的含量最低值為0.308 mg·g-1，最高值達(dá)3.049 mg·g-1，后者是前者的9.9倍；其次是非必需氨基酸中的酪氨酸，所測樣品中含量最低為0.176 mg·g-1，最高達(dá)1.173 mg·g-1，后者是前者的6.7倍。說明所用建模樣品間化學(xué)值差異明顯的可滿足建模需要。賴氨酸被稱為谷物第一限制性氨基酸，高立成等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，普通苦蕎西農(nóng)9904和黔苦3號籽粒的賴氨酸含量分別為3.4和4.5 mg·g-1，萌發(fā)期其籽粒賴氨酸含量分別升至3.8和5.2 mg·g-1，Bhinder等研究不同品種苦蕎粉中氨基酸的含量，發(fā)現(xiàn)苦蕎粉中賴氨酸含量的最高值為6.55 mg·g-1，其他必需氨基酸如纈氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸和亮氨酸的含量最高值分別是3.5，2.55，8.79和12.4 mg·g-1，均遠(yuǎn)低于本實驗中金苦蕎葉片賴氨酸的含量[12-13]，證明金苦蕎葉片具有極高的營養(yǎng)價值和開發(fā)潛力。

表1 金苦蕎葉片氨基酸含量化學(xué)測定結(jié)果Table 1 Contents of amino acid in golden tartary buckwheat leaves using chemical method

2.2 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)的選擇與研究項目的要求、輸入-輸出節(jié)點(diǎn)的多少存在著直接的關(guān)系，其數(shù)目太少會使網(wǎng)絡(luò)不能收斂，造成網(wǎng)絡(luò)不能正確預(yù)測未知樣本，容錯性差，但太多又易造成網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)時間過長及過擬合現(xiàn)象的出現(xiàn)。一般隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)是遠(yuǎn)小于訓(xùn)練樣本數(shù)的。通過調(diào)整輸入層、隱層的節(jié)點(diǎn)數(shù)可以優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。經(jīng)過多次預(yù)測模型的建立，得到了相關(guān)系數(shù)較高的結(jié)果，其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為(1102-9-1)。

2.3 數(shù)據(jù)歸一化

為了提高建模效率，需要預(yù)處理光譜數(shù)據(jù)，常用的方法有一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、矢量歸一等。按照4∶1的比例將化學(xué)值和光譜值隨機(jī)生成訓(xùn)練集和測試集后，在處理的過程中發(fā)現(xiàn)光譜值以及化學(xué)值的特征值未在[0，1]的范圍內(nèi)，遂對其進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理。接著創(chuàng)建9個隱含層神經(jīng)元的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并設(shè)置迭代次數(shù)為1 000、MSE均方根誤差范圍為[0，1×10-3]即[0，0.001]以及學(xué)習(xí)率為0.01。開始訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)。訓(xùn)練完成后進(jìn)行仿真測試和數(shù)據(jù)的反歸一化，進(jìn)而進(jìn)行性能評價，測試相對誤差以及決定系數(shù)。

2.4 模型的分析及評價

采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模的方法對17種氨基酸進(jìn)行了數(shù)學(xué)建模后，可直觀的看出運(yùn)用近紅外光譜模型對未知樣品的預(yù)測效果，預(yù)測化學(xué)值與真實值的相關(guān)性及其精確度的提升空間?，F(xiàn)對建立的17種氨基酸數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析。

2.4.1 必需氨基酸的建模效果

從圖1和表2可知，7種必需氨基酸的近紅外模型預(yù)測值與真實值的R2均在0.90以上，其中苯丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和賴氨酸近紅外模型測試過程，其預(yù)測值與真實值的RSD均低于10%，模型可用。

甲硫氨酸近紅外模型的預(yù)測效果如圖1(b)和表2所示，從測試結(jié)果可知，供試樣品的真實值和預(yù)測值的R2雖然較高，達(dá)到0.914 9，然而參與測試的10組數(shù)據(jù)RSD達(dá)到25.98%，誤差太大，模型不可用。

圖1 必需氨基酸的近紅外模型仿真測試效果(a)：苯丙氨酸;(b)：甲硫氨酸;(c)：亮氨酸;(d)：蘇氨酸；(e)：纈氨酸;(f)：異亮氨酸;(g)：賴氨酸Fig.1 Simulation results of near-infrared model of essential amino acids(a):Phenylalanine;(b):Methionine;(c):Leucine;(d):Threonine;(e):Valine;(f):Isoleucine;(g):Lysine

2.4.2 非必需氨基酸的建模效果

從表2和圖2可知，天冬氨酸和精氨酸的建模效果最好，其模型真實值與預(yù)測值的R2均大于0.97，天冬氨酸模型仿真測試的10組數(shù)據(jù)，其RSD值為6.67%[圖2(c)]；參與精氨酸模型測試的10組數(shù)據(jù)，其RSD為4.22%[圖2(e)]，兩種模型均較優(yōu)秀。

從表2和圖2還可知，絲氨酸、丙氨酸、組氨酸、甘氨酸和酪氨酸模型的預(yù)測值與真實值R2均較高，達(dá)到0.90以上，且仿真測試過程，5種氨基酸模型的RSD均低于10%，模型較好。脯氨酸模型的仿真測試中，應(yīng)試樣品真實值與預(yù)測值的R2為0.899 1，稍低于其他氨基酸模型，10組供試數(shù)據(jù)的RSD為7.86%，模型也可用。

半胱氨酸近紅外模型的預(yù)測效果如表2和圖2(b)所示，可知應(yīng)試樣品的預(yù)測值與真實值差異較大，二者的R2只有0.788 0，且10組數(shù)據(jù)的RSD為33.23%，該模型預(yù)測結(jié)果不理想，有待進(jìn)一步研究，可設(shè)計更加精細(xì)的實驗，使用代表性更強(qiáng)的樣品，獲得更加精準(zhǔn)的化學(xué)值和光譜值數(shù)值，另外，采用更加合適的算法與光譜預(yù)處理方法，以達(dá)到更好的建模效果。

圖2 非必需氨基酸的近紅外模型仿真測試效果(a)：谷氨酸;(b)：半胱氨酸;(c)：天冬氨酸;(d)：絲氨酸;(e)：精氨酸;(f)：丙氨酸;(g)：組氨酸;(h)：甘氨酸;(i)：脯氨酸;(j)：酪氨酸Fig.2 Near infrared simulation of non-essential amino acids(a):Glutamic acid;(b):Cysteine;(c):Aspartic acid;(d):Serine;(e):Arginine;(f):Alanine;(g):Histidine;(h):Glycine;(i):Proline;(j):Tyrosine

表2 氨基酸近紅外模型仿真測試效果Table 2 Simulation results of near-infrared model of amino acids

3 結(jié) 論

通過對苦蕎葉氨基酸含量的測定，可知葉中的氨基酸，特別是必需氨基酸的含量遠(yuǎn)高于蕎麥籽粒，使其具有極高的營養(yǎng)價值。常規(guī)氨基酸測定方法限制了高氨基酸苦蕎的育種與開發(fā)工作。本文建立的17種氨基酸的非線性預(yù)測模型中，精氨酸和天冬氨酸建模效果較好，預(yù)測值與真實值R2均高于0.97，其RSD均低于7%；另外丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、脯氨酸、異亮氨酸和組氨酸的模型預(yù)測值與真實值的R2均大于0.85，RSD均低于10%，可用于氨基酸的預(yù)測工作；而甲硫氨酸和半胱氨酸的近紅外模型，RSD均大于10%，模型不可用，這兩種氨基酸的近紅外光譜非線性預(yù)測模型還需要進(jìn)一步研究。