陳夫山,王高敏,吳 越,魯 鵬,吉 喆,*
1.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院,山東 青島 266011 2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西清潔化制漿造紙與污染控制重點實驗室,廣西 南寧 530004
隨著工業(yè)的迅猛發(fā)展,能源緊缺和環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重,利用木質(zhì)纖維生物質(zhì)開發(fā)清潔高效的可再生能源、大宗化學(xué)品和功能材料已成為當(dāng)前許多國家的重要發(fā)展戰(zhàn)略和研究熱點。而細胞壁中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和少量組分相互交聯(lián)構(gòu)成了天然抗降解屏障,嚴(yán)重阻礙化學(xué)藥液和微生物的入侵及降解,限制了木質(zhì)纖維原料的高效轉(zhuǎn)化。因此,對木質(zhì)纖維原料進行預(yù)處理,破除細胞壁的天然屏障,是實現(xiàn)生物質(zhì)低成本轉(zhuǎn)化的必要前提。在預(yù)處理過程中,木質(zhì)纖維細胞壁的超微結(jié)構(gòu)和主要組分的局部化學(xué)變化,是影響底物轉(zhuǎn)化效率的重要因素。因此,全面了解木質(zhì)纖維細胞壁的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)特性及其在轉(zhuǎn)化過程中的解構(gòu)機理是高效利用農(nóng)林生物質(zhì)的基礎(chǔ)。拉曼光譜作為一種對樣品制備無特殊要求、靈敏度極高的原位分析手段,能快速、無損的對樣品進行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析。尤其與顯微技術(shù)相結(jié)合,能同時獲得木質(zhì)纖維細胞壁主要組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)與微區(qū)分布信息,實現(xiàn)組分動態(tài)變化的可視化研究。目前已經(jīng)成為研究木質(zhì)纖維細胞壁結(jié)構(gòu)的有力工具,并取得一系列重要的研究成果。本文在簡述拉曼光譜成像原理的基礎(chǔ)上,重點介紹了生物質(zhì)預(yù)處理過程中拉曼光譜在木質(zhì)纖維細胞壁主要組分結(jié)構(gòu)解析、纖維素和木質(zhì)素局部化學(xué)動態(tài)變化等方面的研究進展,為木質(zhì)纖維生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化利用中細胞壁微觀結(jié)構(gòu)的原位分析提供了借鑒。
拉曼光譜是當(dāng)分子受到激發(fā)光的照射后,分子與入射光子碰撞發(fā)生能級躍遷,進而產(chǎn)生的一種非彈性散射光譜。由于分子的振動和轉(zhuǎn)動能級不同,拉曼光譜的譜線數(shù)目、位移大小和特征峰強度也會發(fā)生改變。通過分析拉曼特征峰的高度、寬度、面積、頻移和形狀,可以獲得樣品中元素、成分、分子取向、結(jié)晶狀態(tài)以及應(yīng)力、應(yīng)變狀態(tài)等重要信息。
隨著研究技術(shù)的進一步發(fā)展,拉曼光譜還可以與顯微技術(shù)相結(jié)合,以達到對樣品進行同步結(jié)構(gòu)分析和空間定位的目的,該技術(shù)即為共聚焦顯微拉曼成像(CRM)。CRM成像時,顯微鏡會將激發(fā)光聚焦在數(shù)微米的樣品表面,設(shè)定采集時間和掃描步距,通過精準(zhǔn)的馬達帶動定位平臺對樣品進行光柵掃描,在特定的樣品范圍內(nèi)就會獲得一系列拉曼光譜。CRM則會以被研究區(qū)域的拉曼特征譜峰為基礎(chǔ),基于特定拉曼峰的位移、強度和半峰寬等信息繪制成一幅偽彩色圖像,實現(xiàn)樣品的微區(qū)成分和空間分布分析。CRM成像的本質(zhì)是一種基于指紋譜學(xué)數(shù)據(jù)分析的物質(zhì)結(jié)構(gòu)和組分成像技術(shù),該技術(shù)可進一步結(jié)合數(shù)學(xué)分析算法,實現(xiàn)樣品微區(qū)分子結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、結(jié)晶度和應(yīng)變應(yīng)力等更深層次的信息的挖掘。
木質(zhì)纖維細胞壁主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。纖維素是由β-D-吡喃型葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接的線型高分子化合物,具有結(jié)晶型和無定型兩種結(jié)構(gòu)(表1)。根據(jù)已有報道,纖維素的三個典型特征峰位于380,1 098和2 890 cm-1,分別對應(yīng)吡喃環(huán)CCC的對稱彎曲振動、糖苷鍵COC伸縮振動、主鏈葡萄糖環(huán)和側(cè)鏈亞甲基上的CH及CH2的伸縮振動[1]。歸屬于纖維素分子的拉曼特征峰的強度多數(shù)與入射激光偏振方向有關(guān),在1 098 cm-1處尤為顯著。因此,采用偏振入射光掃描,可以同時測定纖維素的空間分布和分子取向特征。
表1 細胞壁主要組分拉曼特征峰歸屬Table 1 Assignment of Raman bands for the main components in cell walls
半纖維素是由木糖、甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖等多種糖基單元構(gòu)成的帶有支鏈的異質(zhì)性多糖。由于半纖維素和纖維素的化學(xué)鍵型類似,因此二者的特征峰多數(shù)相互重疊,難以區(qū)分。但已有研究證實,半纖維素的HCC、HCO伸縮振動在890 cm-1處信號顯著,可以作為半纖維素的典型拉曼特征峰。此外,Hemmelsbach等對亞麻纖維的拉曼光譜進行了詳細分析,發(fā)現(xiàn)475~515和800~870 cm-1譜帶可以用于識別半纖維素木聚糖[2]。
木質(zhì)素是由苯基丙烷結(jié)構(gòu)單元通過碳碳鍵和醚鍵連接構(gòu)成的三維空間網(wǎng)狀芳香族化合物。木質(zhì)素的典型拉曼特征峰位于1 600和1 660 cm-1,分別歸屬于芳香環(huán)骨架的彎曲振動和與苯環(huán)共軛的酮羰基伸縮振動,來源于松柏醇/紫丁香醇或松柏醛/紫丁香醛結(jié)構(gòu)單元[3]。
木質(zhì)纖維細胞壁是以纖維素微纖絲為骨架,半纖維素和木質(zhì)素為膠黏劑的多層同心圓環(huán)結(jié)構(gòu),由外到內(nèi)依次分為細胞角隅(cell corner,CC)、復(fù)合胞間層(compound middle lamellar,CML)、初生壁(primary wall,PW)和次生壁(secondary wall,SW:包括S1,S2 和S3)。學(xué)者們[4]借助CRM研究發(fā)現(xiàn)纖維素和木質(zhì)素在細胞壁中的分布呈不均一性,木質(zhì)素的濃度分布規(guī)律為:CC>CML>S2,而纖維素的分布特征與木質(zhì)素恰好相反。
由于細胞壁復(fù)雜的超微結(jié)構(gòu)和組分分布不均一,形成了天然的抗降解屏障阻礙了生物質(zhì)各組分的高效利用,因此需要選擇經(jīng)濟、高效、環(huán)保的預(yù)處理方法對生物質(zhì)進行預(yù)處理以實現(xiàn)組分清潔分離和高效轉(zhuǎn)化。而全面解析預(yù)處理過程中細胞壁微觀結(jié)構(gòu)和主要組分微區(qū)分布變化,是解譯生物質(zhì)轉(zhuǎn)化機制的重要課題。CRM的迅猛發(fā)展,為研究學(xué)者從細胞及亞細胞水平探究預(yù)處理誘導(dǎo)細胞壁主要組分動態(tài)溶解機制提供了有效路徑,并在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化領(lǐng)域取得了一系列重要的研究成果。
稀酸預(yù)處理主要通過溶解半纖維素和少量木質(zhì)素來打破細胞壁的致密結(jié)構(gòu),從而增加纖維素的酶水解效率。在預(yù)處理過程中組分的降解和新聚合物的生成,導(dǎo)致拉曼特征峰發(fā)生偏移或重疊,難以準(zhǔn)確歸屬,Jin等[5]通過模型物參比確認(rèn)1 330和1 272 cm-1特征峰分別對應(yīng)G型和S型木質(zhì)素,結(jié)合拉曼信號強度變化和積分成像,實時監(jiān)測了酸性亞氯酸鈉預(yù)處理過程中不同分子結(jié)構(gòu)木質(zhì)素的溶出機制。在奇崗表皮和髓心組織稀酸預(yù)處理過程中,Ji等[6]通過對比2 886,1 599和1 173 cm-1拉曼信號變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)髓心中木質(zhì)素和羥基肉桂酸的溶出能力較外皮更強,且兩組分溶出速率呈正相關(guān),拉曼成像進一步證實木質(zhì)素會凝聚為球狀顆粒在細胞壁內(nèi)發(fā)生遷移、重分布,影響纖維素酶水解效率。這些研究多采用二維成像技術(shù),為更精準(zhǔn)地呈現(xiàn)稀酸預(yù)處理過程中楊木細胞壁三維結(jié)構(gòu)變化,Zoghlami等[7]在拉曼成像分析中引入了3D分割技術(shù),為研究細胞壁主要組分連接鍵的斷裂和溶出機制提供了新的方法。
水熱預(yù)處理一般在130~220 ℃范圍內(nèi)進行,在反應(yīng)過程中不添加任何化學(xué)試劑和催化劑就可以有效脫除半纖維素。由于絕大多數(shù)的半纖維素特征峰與纖維素重疊,所以很難利用CRM直接定位半纖維素的分布,因此已有報道多數(shù)利用2 889 cm-1碳水化合物信號峰,結(jié)合化學(xué)或免疫標(biāo)記技術(shù)間接探究半纖維素的微區(qū)分布特征。但是,Ma等[8]利用CRM對874~934 cm-1積分成像得到了楊木半纖維素動態(tài)分布圖,分析發(fā)現(xiàn)水熱預(yù)處理過程中CML和S2層的聚木糖率先溶出,而聚甘露糖卻相對穩(wěn)定;延長預(yù)處理至40 min,CC,CML和S2層中木質(zhì)素的溶出率分別為22.5%,45.9%和71.0%,表明木質(zhì)素由細胞壁各亞層的脫除速率呈不均一性。
堿性預(yù)處理主要通過斷裂木質(zhì)素和半纖維素之間的化學(xué)鍵,脫除大量木質(zhì)素和部分半纖維素以增大纖維素底物的可及性,進而提高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率的方法。在稻桿的NaOH預(yù)處理過程中,Li等[9]利用主成分分析法對CRM全光譜數(shù)據(jù)實現(xiàn)了指紋譜帶的定性定量分類,又結(jié)合全約束最小二乘法(FCLS)對光譜進行解混分析,得到了主要組分的分布成像,與單光譜成像技術(shù)相比,該方法從定性、定量和定位等多角度更精準(zhǔn)地揭示了堿預(yù)處理提高稻稈厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)率的機理。Huang等[10]利用CRM研究了水熱和稀堿兩段預(yù)處理過程中竹材纖維的變化,發(fā)現(xiàn)纖維素、木質(zhì)素和羥基肉桂酸在不同類型細胞壁的不同形態(tài)學(xué)區(qū)域的溶出速率呈不均一性,三者協(xié)同影響纖維素的酶水解效率。
除酸性、堿性處理外,CRM也被廣泛應(yīng)用于有機溶劑、離子液體、低共熔體系預(yù)處理過程的監(jiān)測。Li等[11]用γ-戊內(nèi)酯/水/酸體系對桉樹進行預(yù)處理,通過化學(xué)組分拉曼分布變化研究,證實提高H2SO4濃度可以促進CML中木質(zhì)素和半纖維素的脫除。Li等[12]在微波輔助低共熔溶劑降解生物質(zhì)細胞壁過程中,分析各形態(tài)學(xué)區(qū)域的拉曼信號發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素的溶出速率為:SW>CML>CC。綜上所述,利用CRM可以快速、原位獲取預(yù)處理過程中細胞壁各形態(tài)學(xué)區(qū)域的組分(纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和羥基肉桂酸)分布特征,從細胞及亞細胞水平揭示預(yù)處理解構(gòu)細胞壁的機制。
木質(zhì)纖維細胞壁是由多種高分子聚合物構(gòu)成的一種多層納米復(fù)合材料。通過共聚焦拉曼掃描可獲得海量光譜數(shù)據(jù),而傳統(tǒng)的光譜分析方法主要根據(jù)研究人員經(jīng)驗,抽取特定空間區(qū)域的平均光譜后,進行單光譜成像或僅選擇需要的特征峰進行分析。該方法存在以下顯著缺陷:(1)數(shù)據(jù)處理結(jié)果人為誤差較大,且費力費時;(2)大量有效信息被遺漏;(3)分析結(jié)果精準(zhǔn)性、可重復(fù)性差。因此,結(jié)合生物質(zhì)細胞壁的結(jié)構(gòu)特征,構(gòu)建海量光譜數(shù)據(jù)全自動分類分析方法至關(guān)重要。本文主要介紹了主成分聚類分析法和頂點成分分析法。
主成分分析法是一種統(tǒng)計方法,可以在盡可能保留原有信息的基礎(chǔ)上將高維空間的樣本映射到低維的主成分空間中,使數(shù)據(jù)矩陣簡化,降低維數(shù),被降低維數(shù)后的數(shù)據(jù)又可以進行聚類分析,將研究對象按照諸多特性的相似程度進行逐漸聚合,最終按照類別的綜合性質(zhì)歸類,從而完成聚類分析的過程。陳勝等[13]利用主成分分析法對馬尾松多種組分進行了分類識別,其中木質(zhì)素(1 597 cm-1)和碳水化合物(2 890 cm-1)兩大主成分累計貢獻率高達94.61%。通過聚類分析可以將拉曼光譜分為四類,分別對應(yīng)細胞壁的CC,CML,SW和細胞腔(CL),經(jīng)算數(shù)平均后可以得到細胞壁各形態(tài)學(xué)區(qū)域的平均拉曼光譜(圖1)。并利用該方法分析了楊木稀酸和離子液體預(yù)處理過程中主要組分的分布變化[14],這比傳統(tǒng)的手動選定細胞區(qū)域獲得少量光譜平均數(shù)據(jù)的方法更加準(zhǔn)確。主成分聚類分析法可以壓縮數(shù)據(jù)、準(zhǔn)確提取出不同形態(tài)區(qū)域的平均拉曼光譜,并揭示細胞壁超微結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分之間的內(nèi)在聯(lián)系,為進一步地精細區(qū)分不同細胞壁層之間的化學(xué)差異奠定了良好的基礎(chǔ)。
圖1 未處理和稀酸預(yù)處理馬尾松細胞壁拉曼光譜主成分得分圖(a,d);聚類分析結(jié)果(b,e);各壁層平均拉曼光譜(c,f)Fig.1 PCA scores plot of Raman spectra of Pinus cell wall untreated and pretreated by dilute acid (a,d);The cluster results (b,e);Average Raman spectra of each layers before preprocessing(c,f)
頂點成分分析是一種多元曲線分解方法,它以交互的方式將數(shù)據(jù)投影到所識別的正交子空間中,通過反復(fù)迭代從存在混合像元的高光譜圖像中提取出場景的基本組成成分,即提取端元。它具有光譜分析全自動以及端元提取速度快的優(yōu)點,是目前分析木質(zhì)纖維細胞壁拉曼光譜的有效方法之一。Notburga Gierlinger[15]在分析云杉細胞壁的拉曼譜圖時,根據(jù)細胞壁各層中主要成分分子結(jié)構(gòu)的差異性,采用頂點成分分析算法將細胞壁分為四個端元,分別對應(yīng):CC和CML、S3和紋孔膜、S2、CL[圖2(a)],每個端元的豐度圖均詳細呈現(xiàn)了主要組分的空間分布特征[圖2(b—e)],通過提取四個端元的平均拉曼光譜可以進一步獲取不同形態(tài)學(xué)區(qū)域中成分含量和分子結(jié)構(gòu)信息[圖2(f—g)]。該方法較傳統(tǒng)光譜分析法,開創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)S3和紋孔膜的微觀結(jié)構(gòu)特征明顯區(qū)別于S2和CML層:1)纖維素微纖絲與細胞軸趨于垂直,與S2層中較小的微纖絲角差異較大;(2)該層的木質(zhì)素特征峰由1 599 cm-1偏移至1 603 cm-1,說明S3和紋孔膜具有類似的木質(zhì)素分子結(jié)構(gòu),但與S2和CML層顯著不同。此外,作者借助頂點成分分析法解析拉曼光譜,進一步證實S2層由于木質(zhì)化不均一性形成了連續(xù)薄層狀結(jié)構(gòu)。頂點成分分析法為深入解析拉曼光譜,研究木質(zhì)纖維細胞壁的精細結(jié)構(gòu)提供了新的途徑。
圖2 基于頂點成分分析的云杉橫切面(38 μm×38 μm)的拉曼端元圖像與光譜(1 800~300 cm-1)Fig.2 Raman images of spruce wood cross sections (38 μm×38 μm)based on VCA analysis with four endmembers using the wavenumber region from 1 800 to 300 cm-1
拉曼光譜顯微成像技術(shù)具有制樣簡單、掃描快速、空間分辨率高等優(yōu)點,目前已發(fā)展為木質(zhì)纖維細胞壁研究領(lǐng)域的重要工具,它可以在原位狀態(tài)下獲得細胞壁聚合物大分子的結(jié)構(gòu)組成、空間分布和分子取向等信息,尤其在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中細胞壁微觀結(jié)構(gòu)變化的動態(tài)監(jiān)測展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢,并取得了豐碩的研究成果。然而,拉曼光譜作為一種新興技術(shù),還存在一定的局限性,比如大部分拉曼光譜儀采用背散射采集方式獲取拉曼信號,一般只能獲得樣品表面的信息,而且光譜信號噪聲大。此外,木質(zhì)纖維生物質(zhì)樣品大多具有自發(fā)熒光性,會干擾拉曼信號的采集從而降低光譜質(zhì)量與數(shù)據(jù)分析,因此需要借助多種光譜分析方法對拉曼光譜進行深度剖析以提取更有價值的信息。近年來,拉曼光譜技術(shù)迅猛發(fā)展,與多種光譜和光譜成像技術(shù)相輔相成,在生物煉制、生物質(zhì)化工等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛能。